白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法研究

目的: 筛选白术、苍术鉴别SNP位点,并设计特异性引物,实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法: 通过测序及GenBank中下载获得白术、苍术的psbA-trnH序列,通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点,设计位点特异性PCR引物,将ITS通用引物加入到特异性引物构建多重PCR体系,并优化PCR条件,对白术、苍术种子进行分子鉴定。结果: 构建了多重PCR鉴别体系,通过一个PCR反应,能扩增出苍术、白术约643 bp 的ITS DNA质控条带,扩增出白术172 bp的特异性鉴别条带,实现白术、苍术鉴别。结论: 使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别白术、苍术种子。     

基于通用DNA条形码序列的黄精属药用植物分子鉴定

目的 分析4个通用植物DNA条形码序列(trnH-psbA、matK、rbcL和ITS2)及其组合对黄精属药用植物的物种鉴定分辨率，挖掘适用于黄精属种间鉴定的高分辨率分子标记。方法 以《中国药典》2020年版中收录的黄精属药用植物黄精Polygonatum sibiricum、滇黄精P. kingianum、多花黄精P. cyrtonema、玉竹P. odorati及其地方常见同属替代品、混伪品共12种79个野生个体为对象，将4个通用DNA条形码序列独立、联合分析，评估其种间、种内变异情况，并分别基于建树法(tree-based method)和PWG距离法(PWG-distance method)评估不同条形码及其组合的物种鉴定分辨率。结果 ITS2序列扩增成功率低，trnH-psbA、matK、rbcL序列的引物在黄精属植物中通用性较好；3组叶绿体序列的种间变异依次为matK＞trnH-psbA＞rbcL，种内变异差异不显著，种间、种内遗传距离无明显的Barcoding gap；各条形码独立及联合分析的物种鉴定分辨率普遍偏低，其中，组合条形码trnH-psbA＋matK＋rbcL在建树法分析中的分辨率最高，为25%，trnH-psbA＋rbcL在距离法分析中的分辨率最高，为50%。结论 4个通用DNA条形码序列及其组合都并非黄精属药用植物不同种间有效区分鉴定的理想分子标记，但多序列联合分析能在一定程度上提高物种鉴定成功率。     

基于位点特异性PCR的黄芪与红芪鉴别方法研究

研究黄芪与红芪药材之间的DNA分子鉴别方法。采集不同产地的黄芪药材30份、红芪28份,所有样品进行总DNA的提取,通过对黄芪及红芪药材trnL-trnF片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。并对位点特异性PCR方法进行条件优化。通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现黄芪可扩增出136 bp 片段,红芪可以扩增出323 bp片段。黄芪中掺入10% 以上红芪可以扩增出红芪特异鉴别条带。通过位点特异性PCR的方法实现了黄芪与红芪药材的快速、准确鉴别。     

基于特异性聚合酶链式反应的西红花快速分子鉴别研究

 目的 建立一种基于特异性聚合酶链式反应(PCR)及荧光染料检测快速鉴别西红花真伪品的方法。方法 通过对叶绿体基因片段测序和比对分析,找出西红花与其常见掺伪品序列差异,针对差异碱基设计特异性引物,构建并优化聚合酶链式反应扩增反应体系,使用荧光染料法检测聚合酶链式反应产物,实现西红花的快速鉴别。结果 建立了基于psbA-trnH序列的西红花鉴别体系,优化后的聚合酶链式反应反应条件为90 ℃预变性1 min,90 ℃变性5 s,58 ℃延伸5 s,26个循环。在聚合酶链式反应反应产物中加入染料SYBR Green I,西红花正品出现强烈绿色荧光,而伪品无荧光。结论 位点特异性聚合酶链式反应方法可以简单快速鉴别西红花及其掺伪品。     

罂粟属植物核心DNA条形码的筛选

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种准确、高效且对操作人员要求不高的物种鉴定技术。为了筛选出适合罂粟属的DNA条形码,从GenBank上获得罂粟属植物共69条序列,包括21条ITS序列,10条matK序列,8条psbA-trnH序列,14条rbcL序列和16条trnL-trnF序列。应用Mega 6.0软件分析了罂粟属的ITS,matK,psbA-trnH,rbcL,trnL-trnF序列的特征,通过计算序列的种内、种间距离,评估序列的Barcoding Gap和构建NJ,UPGMA系统发育树进行分析。分析结果表明:trnL-trnF不仅种内变异和种间变异差别最大,而且有明显的barcoding gap,种内变异和种间变异重合较少,能较好地区分不同种类的罂粟;所构建的NJ和UPGMA系统发育树,也能将全部物种区分开。综合考虑,建议把trnL-trnF作为鉴定罂粟属植物的核心条形码,结合其他片段作为组合条形码。     

绞股蓝属植物亲缘关系初步分析

采用DNA条形码ITS,matK,rbcL,psbA-trnH 4个片段,对绞股蓝属Gynostemma 9个种及变种共38份样品的序列进行分析,以雪胆属罗锅底Hemsleya macrosperma作为外类群,运用PAUP 4.0b10软件进行系统发育分析,基于ITS序列采用邻接法(NJ)和最大简约法(MP)构建系统发育树,探讨绞股蓝属下的亲缘关系.研究表明:①在NJ树和严格一致树中,广布种绞股蓝G. pentaphyllum var.pentaphyllum的8个个体没有形成单系分支;②怀疑长梗绞股蓝G. longipes 和光叶绞股蓝G. laxum是否应为独立的种;③支持绞股蓝属植物亚属的分类单位.     

蒙成药中“地格达”类原料药材的位点特异性PCR鉴别研究

该文选择8种含有地格达类蒙药原料药材的蒙成药为对象,首先对基原植物肋柱花和苦地丁样品采用改良CTAB法提取其总DNA,使用psbA-trnH片段进行扩增、测序,与GenBank下载的8种蒙成药中其他原料药材psbA-trnH序列进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。同时对8种蒙成药进行总DNA的提取,并使用DNA纯化试剂盒进行纯化,通过PCR反应对叶绿体rbcL序列进行扩增,再分别选择肋柱花和苦地丁鉴别引物进行扩增,并将扩增后的产物进行测序。所得序列校正、比对后,进行比对分析。结果表明,地格达-4汤、地格达-8散、地格达-4散中均含有原料药材肋柱花,苦地丁特异鉴别引物扩增分析可以鉴定出利胆八味散、伊赫哈日-12和阿嘎日-35中含有苦地丁。该研究结果说明,位点特异PCR方法用于鉴定蒙成药中原料药材具有一定的可行性。     

基于ITS2序列鉴定中药材升麻及其混伪品

该研究选用ITS2序列对升麻及其混伪品进行分子鉴定,从而确保用药安全。实验采用DNA条形码技术,对升麻及其混伪品的ITS2核基因片段进行扩增并双向测序,经CodonCode Aligner V3.7.1拼接后,利用MEGA 5.0软件对相关数据分析,构建邻接（NJ）系统聚类树进行鉴定分析。结果表明升麻药材的3个基原物种：大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia、升麻C. foetida、兴安升麻C. dahurica,其ITS2序列长度分别为217,219,219 bp,3个基原物种ITS2序列与混伪品的种间平均K2P距离大于其种内平均K2P距离,ITS2系统发育树显示,升麻的3个基原物种均各自聚为一单系分支,并与其他混伪品明显分开。ITS2序列能够有效准确地鉴别中药材升麻及其混伪品。     

中国红树类海桑属植物DNA条形码研究＊

目的 对中国的6种红树类海桑属植物进行DNA条形码研究，为该属植物鉴定、资源保护、合理开发等提供参考依据。方法 以核基因ITS2片段及叶绿体基因片段psbA-trnH作为DNA条形码，对分布在中国的海桑属植物进行基因组DNA提取、PCR扩增和双向测序。所得序列经CodonCode Aligner拼接获得叶绿体psbA-trnH基因间区序列和核ITS2序列，用软件MEGA6.0进行相关数据分析，构建NJ（邻接）树。结果 我国6种红树类海桑属植物的ITS2序列间存在明显差异，psbA-trnH序列间也存在一定的碱基差异，表明6种海桑属植物具有其各自独特的DNA条形码，可以相互区别，同时基于ITS2序列及psbA-trnH序列构建的邻接（NJ）树可以看出6种海桑属植物具有或近或远的亲缘关系。结论 核ITS2和叶绿体psbA-trnH序列作为DNA条形码可以有效地区分和鉴别我国6种红树类海桑属植物，为后续药用资源开发等相关研究提供了参考。     

基于ITS2和psbA-trnH条形码的藏党参的分子鉴定

目的 应用内转录间隔区（ITS）2及psbA-trnH条形码技术，对藏党参各物种之间进行分子生物学鉴定。方法 通过提取4个物种（灰毛党参Codonopsis canescens、脉花党参C. foetens subsp. nervosa、党参C. pilosula、长花党参C. thalictrifolia var. mollis）28份藏党参样品的基因组DNA，扩增ITS2及psbA-trnH序列并测序，并结合GenBank下载藏党参相关序列81条，包括15个物种，采用MEGA 6.0软件进行比对、变异位点分析、计算GC含量及种内和种间遗传距离，最大似然法（ML）、邻接法（NJ）、非加权组平均法（UPGMA）3种方法进行系统发育树的构建。结果 根据变异位点能将灰毛党参C. canescens、党参（党参C. pilosula、川党参C. pilosula subsp. tangshen及素花党参C. pilosula var. modesta）、西藏党参C. bhutanica、新疆党参C. clematidea、羊乳C. lanceolata、球花党参C. subglobosa及臭党参C. foetens区分；在系统发育树中，ITS2序列以ML法的聚类效果最佳，psbA-trnH序列以UPGMA法的聚类效果最佳，能对12个物种进行有效聚类区分。结论 ITS2及psbA-trnH条形码对单基原物种的鉴定率较高，但对变种与原变种间的鉴定仍存在一定局限性，这为后续藏党参物种之间的亲缘关系鉴定和临床应用等提供参考。     

基于荧光测序分型技术的六味地黄丸原料分子鉴别研究

该文选择成药六味地黄丸为研究对象,建立了一种用于中成药原料药材基原鉴定的荧光测序分型技术。首先以原料药材丹皮DNA为模板,筛选最适荧光标记鉴别引物,即通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别对5个FAM荧光标记引物psb A-trn H,ITS,trn L-trn F,mat K,rbc L序列进行扩增,并对扩增产物进行测序,所得测序结果使用GeneMarker V1.80进行分析。根据分析结果最终选择psb A-trn H荧光标记引物来鉴别六味地黄丸及其原料药材。结果表明,通过psb A-trn H荧光标记引物扩增分析,可以准确鉴定出六味地黄丸中的丹皮,山药,泽泻3种原料药材。研究结果说明,采用分子荧光测序分型技术鉴定中成药原料具有一定的可行性。     

葛根种质资源的分子地理标识研究

目的:利用葛根的ITs,psbK-psbI,trnH-psbA序列信息对不同产地葛根进行分类,为分析不同产地的葛根药材提供依据.方法:采集东北、华北、华中和西北共8个居群24份葛根样品,提取DNA,扩增ITS序列、psbK-psbI及trnH-psbA序列、测序,通过序列比对,根据差异划分基因型或单倍型.结果:ITS1,ITS2序列各有1个单碱基突变,5.8S序列有1个单碱基突变;psbK-psbI序列有2个单碱基突变;trnH-psbA序列有1个单碱基突变,还有1段10个碱基的缺失突变.结论:利用ITS序列将葛根划分成4个基因型,根据psbK-psbI和trnH-psbA序列均将葛根划分成2个单倍型,为进一步评价提供依据.     

头花蓼不同地理居群的叶绿体psbA-trnH和 trnL-trnF基因序列与聚类分析

目的:探讨民族药头花蓼居群间的DNA序列变异与地理分布的关系,为头花蓼优良种质资源的筛选评价提供分子依据.方法:采用PCR产物直接测序,对头花蓼11个居群11个个体样品的叶绿体psbA-trnH,trnL-trnF基因进行测序分析研究.结果:头花蓼11个居群的叶绿体psbA-trnH长402 bp,存在6个变异位点.trnL-trnF长875 bp,存在5个变异位点.用UPGMA法构建的聚类图表明,头花蓼在贵州至云南的类群存在较大程度变异.结论:贵州西部与云南东部地区的头花蓼有利于优良种质资源的筛选.     

基于居群DNA条形码的药用植物黄芩的产地鉴别研究

目的:利用居群DNA条形码阐明不同产地(居群)黄芩的遗传分化程度,对其进行产地鉴别。方法:应用进化速率快和母系遗传的叶绿体DNA基因间序列,基于分子谱系地理学理论筛选出居群间遗传分化明显的片段,构建单倍型网状进化树,根据单倍型在网状进化树中的位置、出现的频率和地理分布范围的大小,划分出不同层次的居群DNA条形码,以用于地理分布范围宽窄不同的产地鉴别。结果:本实验筛选出3个叶绿体DNA基因间序列atpB-rbcL,trnL-trnF和psbA-trnH对17个黄芩野生居群进行分子谱系地理学分析,得到13个多态位点,共20个单倍型,其中3个分布最广、频率最高的单倍型可用于较广地域的产地鉴别,称为区域居群DNA条形码;3个分布次之、只存在于2～3个邻近居群的单倍型可用于较窄地域的产地鉴别,称为地区居群DNA条形码;另有8个仅局限在某一个居群的单倍型可用于特定居群的鉴别,称为居群特有DNA条形码。结论:叶绿体基因间序列在居群间存在明显遗传分化,可用于地理分布范围宽窄不同的黄芩产地鉴别。     

Cardiocrinum seeds as a replacement for Aristolochia fruits in treating cough

Aim of the study

The antitussive Chinese herb Madouling derived from Aristolochia species is banned due to aristolochic acid-induced nephropathy. A substitute is found dispensed as Madouling in Taiwan. This study aims to determine the source plant and verify the antitussive properties of the Madouling substitute used in Taiwan.

Materials and methods

Forensically informative nucleotide sequencing (FINS) approach based on the trnL-trnF and psbA-trnH regions was applied to facilitate identification of the genuine species and substitute. The antitussive effect of both genuine Madouling and the substitute were evaluated in guinea pigs.

Results

FINS approach based on the trnL-trnF and psbA-trnH regions readily identified the sample of Madouling in Taiwan to the seeds of Cardiocrinum giganteum var. yunnanense. Ethanol extracts of the substitute showed significant antitussive properties in guinea pigs.

Conclusion

Cardiocrinum seeds may have potential as a replacement of Aristolochia fruits.     

基于DNA条形码的玉叶金花属植物鉴定研究

目的利用DNA条形码进行玉叶金花属植物的分子鉴定。方法对玉叶金花属20种、89份个体进行叶绿体片段rbc L、mat K和trn H-psb A以及核基因片段ITS的PCR扩增和测序,计算种内和种间Kimura 2-parameter(K2-P)遗传距离,利用序列相似性法和邻接法进行单一片段、核心片段、组合片段以及ITS2片段的分析。结果单一片段分析结果表明玉叶金花属种间遗传距离(0.002~0.012)明显大于种内遗传距离(0.000 3~0.000 7)。trn H-psb A扩增率最低,ITS2片段的分辨率最高,其次是mat K和ITS片段,rbc L片段的分辨率最低。片段组合后的分辨率明显提高,基于序列相似性法和邻接法,mat K+rbc L+ITS和mat K+rbc L+trn H-psb A+ITS的分辨率相当,且比其他片段组的分辨率更高,分别为77%和75%,成功鉴定了15个近缘类群,包括2个药用种类广西玉叶金花和黐花。结论鉴于trn H-psb A扩增率较低,建议mat K+rbc L+ITS作为玉叶金花属物种鉴定的DNA条形码,并作为其药用种类的分子鉴定工具。     

基于多基因组片段构建枸杞属药用植物DNA条形码

目的采用核基因组核糖体DNA ITS区、叶绿体基因组9个DNA片段和线粒体基因组2个DNA片段构建国产枸杞属药用植物DNA条形码。方法采集枸杞属黑果枸杞Lycium ruthenicum、黄果枸杞L.barbarum var.auranticarpum、宁夏枸杞L.barbarum、枸杞L.chinense和新疆枸杞L.dasystemum 5个分类群标本及实验样品,测定各样品的核糖体ITS区,叶绿体mat K、rbc L、rpo C1、trn L(UAA)intron、psb A-trn H、atp B-rbc L、trn S(GCU)-trn G(UCC)、rpl20-rps12、trn L(UAA)-trn F(GAA)和线粒体nad1第2内含子、nad5第4内含子序列;以全萼秦艽Gentiana lhassica为外类群,进行系统学分析。结果共获得108条序列,ITS区变异位点最为丰富;筛选出6个叶绿体DNA片段;2个线粒体DNA片段可作为该属3个物种的条形码推荐序列;构建各物种多基因组多片段组合DNA条形码。结论 ITS区及筛选的6个叶绿体DNA片段均具有物种鉴别意义;2个线粒体DNA片段具有一定鉴别意义;为枸杞类物种鉴定及遗传背景分析提供基础资料。     

断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究

目的: 研究断肠草与金银花类药材水提液的DNA分子鉴别方法。方法: 采集不同产地的断肠草药材13份、金银花32份、山银花21份和水银花5份,所有样品提取总DNA,并对断肠草、金银花、山银花的水提液进行DNA提取。通过对断肠草psbA-trnH片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的中金银花类药材基原植物psbA-trnH序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。结果: 通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现断肠草可扩增出97 bp片段,而金银花类药材则不能扩增出条带。结论: 通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花类药材水提液的快速、准确鉴别。