插入IL-2基因优化HBV DNA疫苗的研究

目的：观察IL-2基因的插入对DNA疫苗免疫效应的影响，探讨优化DNA疫苗设计、提高DNA疫苗兔疫效应的途径。方法：采用PCR产物直接克隆和重组DNA技术构建了人IL-2和HBsAg融合基因的真核表达载体pcDNA3．1 -S/IL-2，通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达，并经肌肉注射免疫C57Bl/6小鼠，以检测和比较它们的细胞和体液免疫应答。结果：通过酶切、PCR及测序证实已正确完整地插入 IL-2基因，成功构建了 pcDNA3．1 -S/IL-2重组质粒。体外转染Cos-7后可见基因的表达和分泌，pcDNA3．1 -S/IL-2可以提高免疫小鼠的抗 HBs抗体滴度和脾淋巴细胞诱生的IL-2的生物活性水平，增加 HBsAg特异性的脾淋巴细胞增殖指数。结论：IL-2和 HBsAg基因的融合表达对 DNA疫苗的免疫反应起协同和增强作用，提示IL-2基因插入可能是增强DNA疫苗的免疫效应的可行途径。     

含密码子优化的SIV gag基因的DNA疫苗与rAd5疫苗构建及免疫原性评价

目的 构建含有SIVgag基因的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗,为后期在SIV感染的猴模型中进行多载体疫苗联合免疫策略的治疗效果评价奠定基础.方法 将SIV gag基因按照哺乳动物偏嗜密码子进行优化并构建至pVR载体,作为DNA疫苗.以Western Blot方法比较优化前后gag基因表达水平.将优化后的gag基因插入重组腺病毒载体,构建rAd5-SIVgag疫苗.在BALB/c小鼠中分别比较DNA疫苗及rAd5-SIV.gag疫苗单独及联合免疫的效果.结果 密码子优化的SIVgag基因的表达水平远高于野生型SIVgag基因.重组腺病毒疫苗免疫一次或两次诱导的细胞免疫反水平分别高于DNA疫苗免疫一次或两次.两种疫苗联合免疫的反应水平与腺病毒疫苗免疫两次的水平相当,高于DNA疫苗单独免疫及腺病毒疫苗单独免疫一次的结果.结论 成功优化了SIV gag基因,使其不依赖Rev高水平表达;成功构建了表达优化后SIV gag基因的DNA疫苗和rAd5疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.     

幽门螺杆菌双亚单位基因疫苗的构建及免疫原性研究

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）两个保护性亚单位UreB、HspA融合基因疫苗并观察其免疫原性。方法：从Hp基因组分别扩增出UreB、HspA基因片段,采用重叠延伸PCR方法将两个基因片段构建融合基因,以BglⅡ和XhoⅠ酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,经测序确认后转染COS-7细胞,Western blot检测目的蛋白表达,胫前肌注射免疫小鼠后收集血清检测特异性抗体效价。结果：经测序后证实成功将融合基因构建到真核表达载体中,免疫印记检测到目的蛋白表达,并具有良好的抗原性,免疫小鼠后能够产生特异性抗体。结论：成功构建Hp双价DNA疫苗,免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,为Hp进一步基因疫苗的研究奠定了基础。     

ctB和ure I双基因融合表达及其免疫特性分析

目的构建霍乱毒素B亚单位(CtB)和幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白(UreI)融合的原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,并初步研究融合蛋白CtB/UreI的表达特性和免疫特性。方法PCR从pUC18ctB中克隆ctB基因,定向在pET32a( )/ureI的ureI基因5′端插入ctB基因,构建ctB和ureI双基因原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,转该质粒于E.coliBL-21(DE3),经酶切和序列分析鉴定工程菌。IPTG诱导表达,HP-His亲和层析纯化,SDS-PAGE和Gel-ProAnalizer4分析,重组蛋白免疫BALB/c小鼠。用Westernblot和ELISA分析重组蛋白的免疫特性。结果工程菌含完整的ctB和ureI基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。在22℃,1mmol/LIPTG诱导4h后,重组蛋白的表达占菌体总蛋白12%,亲和层析纯化后蛋白纯度为94.3%。Westernblot表明重组蛋白分别能与相应的抗体反应,该蛋白免疫小鼠后能产生相应的IgG抗体。结论成功构建了能表达CtB/UreI蛋白的大肠杆菌表达菌株。对融合蛋白表达和纯化后,初步证明了该重组蛋白有CtB和UreI的双特异反应原性和免疫原性,为研究新型幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。     

幽门螺杆菌粘附素基因babA2的克隆及免疫应答的初步研究

目前，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)疫苗的研制仍处在抗原的筛选阶段，已经评价的基因重组抗原基本上是着眼于阻断Hp的毒力因素，而与Hp定植密切相关的粘附素评价较少。babA是迄今为止唯一明确受体的Hp粘附素，研究表明babA基因存在两个等位基因：babA1和babA2，其中只有babA2：具备与Le^b结合的功能。本实验对babA2基因进行了克隆和表达并研究了其免疫反应。     

共表达HIV-1与IL-6核酸疫苗质粒诱导小鼠免疫原性的研究

目前我国ＡＩＤＳ的流行已进入快速增长期 ,因此应用现代生物技术研制新型ＡＩＤＳ疫苗 ,改进早期开发疫苗的缺陷 ,提高其质量是当前的迫切任务。本研究利用分子生物学方法在真核表达载体基础上构建ＨＩＶ结构基因与细胞因子ＩＬ 6基因共表达重组质粒作为核酸疫苗 ,进行小鼠免疫试验 ,探讨核酸疫苗对机体细胞免疫反应能力及细胞因子ＩＬ 6作为免疫佐剂的效果。构建表达中国流行株ＨＩＶ 1Ｂ亚型ｇｐ12 0基因的核酸疫苗质粒ｐＧＰ及共表达中国流行株ＨＩＶ 1Ｂ亚型ｇｐ12 0基因与ＩＬ 6基因的核酸疫苗质粒ｐＧＰＩＬ 6 ,检测其在哺乳动物细胞…     

HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因改造及其重组DNA疫苗的构建

目的 构建表达含有密码子优化的HIV-1 CRF01_AE亚型env基因的DNA疫苗,为多载体艾滋病治疗性疫苗的应用提供候选疫苗.方法 对HIV-1感染者血液样本进行型别分析,分型得到的AE亚型标本采用亚型特异性引物克隆env基因,通过序列比对获得其共有序列,对该序列按照哺乳动物密码子使用的偏嗜性进行优化,将人工合成的优化基因克隆至pVR载体,构建DNA疫苗.通过Western Blot方法比较优化前后env基因的表达.结果 成功获得32条具有完整的开放性阅读框的env克隆,型别分析确认均为CRF01_AE亚型.成功对其共有序列进行了优化、合成并构建了DNA疫苗pVR-mod.AE env,该疫苗与野生型的env基因（wt.AE env）相比可以高水平表达env基因,且不依赖Rev的存在.结论 对HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的优化改造及重组DNA疫苗的构建是成功的.     

幽门螺杆菌NCTC11639标准株lpp20基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定

Lpp20是Hp一种高度保守的膜蛋白,有研究表明其具有较强的免疫活性和免疫保护性,是一种理想的疫苗侯选抗原.本研究利用基因工程技术构建了含lpp20基因的重组质粒,并进行了表达,为Lpp20疫苗的研究奠定了基础.     

表达幽门螺杆菌NAP基因的减毒沙门菌疫苗株的建立

目的：建立表达幽门螺杆菌(H．pylori)中性粒细胞活化蛋白(Hp—NAP)的减毒沙门菌疫苗株。方法：用PCR扩增Hp—NAP基因，并克隆至原核表达质粒pTrc99A中，经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列，并与GenBank中相关序列的同源性进行比较。以重组质粒pTrc99A—NAP转化减毒伤寒沙门菌SL3261，培养后筛选阳性菌落，抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的Hp—NAP蛋白用SDS—PAGE进行鉴定，用薄层扫描分析蛋白含量。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实，克隆的Hp—NAP基因与GenBank中相关序列的同源性为98％(397／402)，氨基酸序列的同源性为98％(131／133)。以重组质粒pTrc99A—NAP转化的减毒沙门菌，可表达Mr约15000的Hp—NAP蛋白，表达量约占菌体蛋白量的37．5％。结论：建立了可表达Hp—NAP基因的减毒鼠伤寒沙门疫苗株，为进一步研制Hp口眼疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌外膜蛋白hopX基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）hopX外膜蛋白编码基因的重组质粒,并进行生物信息学分析,探索筛选Hp疫苗的新途径。方法：应用PCR技术从Hp基因组扩增hopX外膜蛋白编码基因片段,TA克隆后测序分析,用信息学软件分析其物理化学特性,并构建表达载体hopX-pQE30转化E.coliM15,IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定表达蛋白。结果：测序分析表明hopX基因全长为1284bp,与Gene Bank公布的其他Hp菌株的基因序列同源性为96%～97%,氨基酸同源性为97%～99%,软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域。SDS-PAGE检测表明,47kD处有一新生的蛋白带,Western blot检测重组蛋白具有良好的抗原活性。结论：首次获得HpNCTC11637菌株hopX基因,其表达产物为外膜蛋白生物学功能和疫苗的研究奠定了基础。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1羧基端编码基因真核表达重组克隆的构建

目的构建以恶性疟原虫红内期重要的疫苗候选抗原——裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）羧基端编码分子量４２０００蛋白的基因片段为外源基因的可用作候选核酸疫苗的真核表达载体。方法目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟，将恶性疟原虫ＦＵＰ株裂殖子表面蛋白１羧基端编码４２０００蛋白的基因片段用常规分子克隆方法，分别克隆入非分泌性真核表达载体ＶＲ１０１２和改建后的分泌型载体ＶＲ１０１２／ＴＰＡ中，通过ＰＣＲ和酶切鉴定出重组克隆。结果成功地构建了真核表达载体ＶＲ１０１２／ＭＳＰ１－４２和ＶＲ１０１２／ＴＰＡ／ＭＳＰ１－４２。结论目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟红外期，该研究对研制有效的恶性疟原虫红内期核酸疫苗是一个有益的尝试。其免疫保护作用待进一步研究。     

基于Ii分子的HCV-NS3内源性靶向基因疫苗的构建及免疫应答研究

目的构建基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗并在真核细胞中表达,用构建的基因疫苗免疫BALB/c小鼠,研究免疫后小鼠的体液和细胞免疫应答。方法通过3轮PCR以HCV- NS3的T_H1表位(1248～1261 AA)取代Ii链CLIP片段编码基因,构建基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗,并在Cos-7细胞中表达;30只6～8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为5组,用内源性靶向基因疫苗(pHCV-NS3-T_H1)和非靶向疫苗(pHCV-NS3)于股四头肌进行免疫,生理盐水、pCI-neo和pCI-neo-Ii作为研究对照,经过5次免疫后,取外周血对小鼠的体液免疫进行检测,取小鼠脾脏细胞对细胞免疫进行检测。结果内源性靶向基因疫苗在Cos-7细胞中得到高效表达;对BALB/c小鼠的免疫结果显示,只有HCV-NS3免疫组小鼠可以检测到针对NS3的特异性抗体,抗体滴度达到1/1024;pHCV-NS3和pHCV-NS3-T_H1免疫的小鼠都可以检测到CD4~ 细胞的增殖,但pHCV-NS3-T_H1免疫的小鼠CD4~ 细胞的增殖强度要明显大于pHCV-NS3免疫的小鼠(P=0.002);在细胞因子的检测中,只有pHCV-NS3-T_H1免疫组小鼠检测到IFN-γ,浓度达剑33.65 pg/ml;只有HCV-NS3免疫的小鼠产生IL-4,浓度达到4.55 pg/ml。结论基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗能够在真核细胞中表达并刺激小鼠产生CD4~ T_H1类型的细胞免疫,为HCV的疫苗开发提供了一个新思路。     

幽门螺杆菌Mr 26 000外膜蛋白编码基因的克隆及表达

目的　构建含幽门螺杆菌 (Hp)Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因的重组载体 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法　用PCR从Hp染色体中 ,扩增Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经BamHI、HindⅢ双酶切、纯化、连接后 ,构建含有目的基因的重组载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL2 1(DE30 )并表达。表达产物经纯化后 ,用ELISA法检测其抗原性。结果　经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为HpMr 2 6 0 0 0的外膜蛋白编码基因 ,与Tomb等的报道相比较 ,有 1.1%的bp发生变异 ,1.5 1%的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr为 4 6× 10 3 ,可溶性表达产物占细菌总蛋白的 38.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。ELISA法检测显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别 ,具有良好的抗原性。结论成功地克隆并表达Mr为 2 6 0 0 0的Hp外膜蛋白编码基因 ,为Hp蛋白疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究打下了基础     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性。方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a( )、pET28a( )及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a( )、pET28a( )与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论:成功地构建并筛选出了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

SARS冠状病毒spike基因DNA疫苗的初步研究

目的　构建SARS病毒spike基因片段真核表达质粒DNA疫苗;检测spike基因片段的免疫原性;筛选SARS病毒疫苗构建的理想靶抗原。方法　采用RT PCR从SARS冠状病毒北京0 1(BJ0 1)株cDNA获取了spike基因cDNA的全长D12、编码N末端氨基酸的cDNA片段D14和编码C末端氨基酸的cDNA片段D2 3;构建重组真核表达质粒pcDNA3 /D12、pcDNA3 D14、pcDNA3 D2 /3;用3种重组质粒和pcDNA3空质粒载体(对照)DNA皮下注射免疫Wistar大鼠;ELISA检测免疫后大鼠血清S蛋白特异性抗体IgG的产生;同位素51 Cr实验检测特异性CTL应答;ELISPOT检测单细胞水平IFN -γ分泌。结果　pcDNA3 /D2 3疫苗免疫组大鼠血清有S蛋白阳性抗体IgG产生、抗体滴度>10 0 0 ;脾淋巴细胞可诱导特异的CTL应答和IFN γ分泌,pcDNA3 /D2 3疫苗组与其它组之间统计分析P <0 .0 5。结论SARS冠状病毒S蛋白的C末端具有较强的免疫原性,是疫苗构建的理想候选靶抗原,本研究结果为SARS病毒的疫苗研究提供了资料。     

利用pIRES载体构建TCR独特型重组质粒

目的 利用可同时表达两个基因片段的pIRES作为载体,构建TCR独特型重组质粒,为制备诱导抗T细胞肿瘤免疫的TCR独特型DNA疫苗提供基础.方法 设计引物,提取Jurkat及Molt4细胞株RNA为模板,RT-PCR法特异性扩增CDR3区,与pIRES经酶切连接后氯化钙法转化,重组质粒经酶切鉴定后测序.结果 构建出3种重组质粒pIRES-Jurkat Vβ8、pIRES-Molt4 Vβ2①和pIRES-Molt4 Vβ2②,其中pIRES-Molt4 Vβ2②测序正确,可体外表达Vβ2蛋白.结论 利用真核表达载体pIRES可成功构建TCR重组质粒,并有可能用于进一步克隆佐剂基因片段入pIRES的多克隆位点,提高DNA疫苗的免疫原性.     

UreA/KatA双价减毒沙门菌疫苗株抗幽门螺杆菌的免疫保护作用

目的探讨由2种幽门螺杆菌(Hp)抗原组合的双价疫苗在防治Hp感染中的作用以及减毒鼠伤寒沙门菌作为传递Hp抗原的活疫苗载体的可行性.方法PCR技术扩增尿素酶A亚单位(ureA)和过氧化氢酶(katA)基因片段,构建表达UreA/KatA融合蛋白的重组质粒,重组质粒宿主菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Westernblot分析UreA/KatA的表达情况.将该重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261株中构建重组口服活疫苗株,经口服免疫C57BL/6小鼠,再用Hp悉尼株进行攻击,用快速尿素酶试验和细菌定量培养对胃粘膜中Hp的定植及生长情况进行观察.结果SDS-PAGE电泳图上显示1条相对分子质量(Mr)约108×103的新生蛋白带,占细菌总蛋白的5%,并能与抗GST抗体发生特异性反应.动物实验结果显示,经UreA/KatA双价疫苗免疫的小鼠能有效防御Hp的感染.结论表达UreA/KatA融合蛋白的双价减毒沙门菌疫苗株能诱导抗Hp保护性免疫反应,有望在Hp感染及其相关性疾病的防治中发挥积极作用.     

结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建及其联合人IL-12表达质粒诱导的小鼠细胞免疫应答观察

目的:构建编码结核分枝杆菌Ag85A分泌蛋白重组真核表达质粒,研究其与hIL-12联合免疫小鼠后的细胞免疫应答。方法:(1)构建质粒:采用PCR法从H37Rv菌株中扩增Ag85A编码基因,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体PMD20-T中,经酶切鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于真核表达载体PCDNA3.1的相应酶切位点。(2)动物实验:50只C57BL/6N小鼠随机分为:①Ag85A基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组);②重组Ag85A基因疫苗组;③卡介苗BCG组(阳性对照);④空载体组(阴性对照);⑤PBS组(空白对照)。基因疫苗、空载体和PBS经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次,约0.3 ml/只。第三次免疫小鼠后28天,处死各组小鼠,分离脾细胞,ELISA法检测脾细胞培养上清液中IFNγ-、IL-2、IL-4水平;乳酸脱氢酶释放法检测脾细胞杀伤活性;分离的脾细胞经TB-PPD刺激后,XTT比色法检测脾淋巴细胞增殖活性。结果:(1)成功构建结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗。(2)联合免疫组能诱导较强烈的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-r和IL-2水平显著高于Ag85A基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少;特异性CTL杀伤活性明显增强;淋巴细胞增殖活性也明显高于其他组别。结论:hlL-12表达质粒能够增强结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗所诱导的小鼠免疫应答。     

表达HIV-1 B亚型env基因的质粒DNA及腺病毒载体疫苗的免疫原性研究

目的 构建表达中国B亚型HIV-1流行株env基因的DNA及重组腺病毒载体疫苗,将其用于预防或治疗HIV感染.方法 构建质粒DNA疫苗pVR-gp160及重组腺病毒载体疫苗rAdV-gp160.将这两种疫苗以不同的方式免疫BALB/c小鼠,分别采用ELISPOT方法 和ELISA方法 检测免疫小鼠中HIV-1 Gp120特异性细胞免疫反应及抗体反应.结果 DNA疫苗单独免疫及DNA疫苗初免/腺病毒疫苗加强免疫的联合免疫方案皆可诱导较高水平的Gp120特异性细胞免疫反应;而在体液免疫方面,各实验组产生的Gp120特异性抗体水平都较低.结论 所构建的DNA疫苗及rAdV疫苗能有效表达Gp160蛋白,并可有效激活机体的细胞免疫反应.     

两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）包膜基因E1E2,对核心基因CDNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用。方法：构建包含HCVC或CE1E2基因片段的真有达载体pHCV-C和pHCV-CE1E2,分别接种于Balb/c小鼠股四头肌（以空载体pcDNA3作为对照）,每间隔2wk l次,用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCVC特异性抗体的产生。以pHCV-C转染并表达HCcAg r S p2/0细胞为靶细胞,采用^51Cr翻译放试验检测特异性CTL的杀伤作用。结果,两个实验免疫的20只小鼠均产生抗HCV C特异性抗体,当前／靶细胞比例为100：1时,CTL的杀伤率均明显高于对照组（P＜0．01）;pHCV-CE1E2与pHCV-C组之间,无论是抗HCV C抗体的滴度还是CTL的杀伤率均无显著性差异（P＞0．05）。结论E1E2基因的加入,并没有增加HCV C基因DNA疫苗诱导的抗HCcAg特异性抗体的滴度和CTL的杀伤作用。