同源盒基因Lhx4在PC12细胞缺氧损伤保护中的作用

目的:转染并筛选Lhx4高表达的PC12细胞株,观察Lhx4基因对PC12细胞的缺氧保护作用.方法:①用RT-PCR检测PC12细胞缺氧培养后Lhx4基因的表达变化;②Lhx4基因连接至pLXIN逆转录病毒载体,收集病毒上清,感染PC12细胞,G418筛选阳性克隆,PCR鉴定,所筛选的克隆缺氧培养;③通过台盼蓝染色和培养液中乳酸脱氢酶活性的检测评价PC12细胞的存活状态.结果和结论:PC12细胞缺氧培养4 h后Lhx4基因的表达明显上调;缺氧8 h后Lhx4基因表达开始下调.所筛选的Lhx4高表达转染细胞株表现出明显的缺氧耐受性,相同的损伤条件下,细胞的存活数目及生存状态明显优于对照组.说明Lhx4基因在PC12细胞的缺氧损伤保护中具有重要的作用.     

脑创伤后nNOS和iNOS对大鼠海马神经细胞凋亡的影响

目的 探讨大鼠脑创伤后神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOs)的神经毒性作用机制及7-硝基吲唑(7-NI)和氨基胍(AG)的治疗作用.方法 雄性成年Wistar大鼠250只,随机分为5组(假手术组、创伤组、AG治疗组、7-NI治疗组、AG+7-NI联合治疗组),每组又分为伤后1、3、6、12h及1、3、7、14d共8个时相点.采用Marmatou法制作大鼠重型弥漫性颅脑创伤模型,免疫组织化学法检测海马CA1区nNOS和iNOS表达情况,TUNEL法观察大鼠海马CA1区神经细胞凋亡情况,双标染色观察细胞凋亡与nNOS、iNOS的关系.结果 创伤组海马CA1区nNOS表达在伤后6h达高峰,iNOS表达及细胞凋亡在伤后3d达高峰,各治疗组凋亡细胞均有不同程度的减少.伤后6h创伤组TUNEL与nNOS共阳性细胞较多,应用7-M后共阳性细胞明显减少.伤后3d创伤组TUNEL与iNOS共阳性细胞较多,应用AG后共阳性细胞明显减少.结论 大鼠脑创伤后nNOS和iNOS的过度表达对大脑神经组织具有毒性作用,是海马CA1区神经细胞凋亡的原因之一.7-NI和AG可抑制nNOS和iNOS的活性,减少神经细胞凋亡,从而起到神经保护作用.     

缺氧对PC12细胞中活性氧含量和缺氧诱导因子 血管内皮生长因子表达的影响

目的研究缺氧对PC12细胞中ROS含量和HIF-1α、VEGF表达的影响,初步探讨缺氧损伤的分子机制。方法使用三气培养箱建立PC12细胞缺氧损伤模型;观察缺氧环境下细胞形态的改变;MTT法检测细胞存活率;DCHF-A染色检测ROS的含量;RT-PCR检测HIF-1α、VEGF mRNA的表达;Western Blot检测HIF-1α、VEGF蛋白的表达。结果与正常组相比较,缺氧24 h后ROS明显升高;HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达较正常组明显升高。结论缺氧24 h后可以导致PC12细胞中ROS含量、HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达升高。     

脑红蛋白减轻硝普钠诱导的PC12细胞损伤

目的:探讨脑红蛋白(NGB)对硝普钠(SNP)诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制.方法:利用一氧化氮(NO)供体——硝普钠诱导制备NO损伤细胞模型,通过转染真核表达载体方式在PC12细胞中过表达NGB,采用Western印迹方法检测NGB表达水平,采用RT-PCR方法检测细胞内bcl-2基因的表达变化,并检测细胞活性(MTT法)、LDH释放量和胞内胞外NO含量.结果:过表达NGB可提高PC12细胞的存活率,增加bcl-2基因的表达,但不改变胞内、外NO的含量.结论:NGB可保护硝普钠诱导的PC12细胞损伤,其机制可能与增加抗凋亡基因bcl-2的表达有关.     

创伤性脑损伤后脑组织c-fos表达及细胞凋亡

目的研究创伤性脑损伤（TBI）后脑组织c-fos表达及神经细胞凋亡，探讨神经细胞凋亡在脑继发性损害中的作用，及c-fos基因表达与凋亡的关系。方法雄性Wistar大鼠，随机分为假手术对照组和脑创伤后3、12、24、72小时和7天组，采用自由落体撞击致重型颅脑损伤。应用TUNEL法检测神经细胞凋亡，免疫组化法观测c-fos的表达。结果TBI后3小时创伤组各组脑组织即出现c-fos表达和神经细胞凋亡，随伤后时间逐渐增强，至伤后72小时达高峰，伤后7天仍有明显的c-fos表达和神经细胞凋亡。其分布区域为脑挫伤区、挫伤周围皮质和海马，累及细胞类型包括神经元和胶质细胞。c-fos表达与神经细胞凋亡在时序空间分布上基本一致，两者呈正相关。结论创伤性脑损伤可引起脑组织明显的c-fos表达和神经细胞凋亡，c-fos表达增加在神经细胞凋亡和修复中可能起重要作用。     

吲哚美辛对β淀粉样蛋白1-42刺激BV-2细胞产生一氧化氮的抑制作用

目的研究吲哚美辛对β淀粉样蛋白1-42（A-β1—42）刺激小胶质细胞（MG）释放一氧化氮（N0）的抑制作用。方法应用高度纯化的BV-2小胶质细胞作为体外小胶质细胞模型，应用不同浓度吲哚美辛（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5mol／L）与20μmol／L Aβ1—42单独或同时培养12h，测定细胞上清NO含量及细胞iNOS活性；RT-PCR法测定BV-2细胞iNOS mRNA的表达。结果吲哚美辛单独作用对BV-2细胞产生NO、iNOS活性及iNOS mRNA表达无明显作用。Aβ1—42可以刺激产生NO、提高细胞iNOS酶活性、增加iNOS mRNA表达，这些作用均可被吲哚美辛所抑制，吲哚美辛浓度为10^-7～10^-5mol／L时抑制作用较为明显。结论在体外吲哚美辛可以降低Aβ1—42介导的BV-2细胞iNOS活性及iNOS mRNA表达，从而减少NO的产生，上述抑制作用可能参与了吲哚美辛在AD治疗中的神经元保护机制。     

预缺氧对PC12细胞缺氧后细胞内游离Ca^2＋的影响

目的：建立PC12细胞预缺氧模型；观察预缺氧对PC12缺氧后细胞内游离Ca^2＋的影响。方法：PC12细胞分为对照组、缺氧组、预缺氧组。检测缺氧及预缺氧对PC12细胞LDH释放率的影响；采用荧光分光光度法，检测PC12细胞内游离Ca^2＋浓度和PC12细胞线粒体膜电位的变化。结果：①缺氧组LDH释放率和细胞内游离Ca^2＋浓度比对照组显著升高（P〈0．01），而线粒体膜电位显著低于对照组；②预缺氧组LDH释放率和细胞内游离Ca^2＋浓度显著低于缺氧组（P〈0．01），线粒体膜电位显著高于缺氧组。结论：预缺氧对PC12细胞的缺氧损伤具有保护作用，其机制可能与减轻缺氧时细胞内的游离Ca^2＋浓度与稳定线粒体膜电位有关。     

缺氧复合梭曼中毒后PC12细胞IL-6、GP130、JAK1、STAT1基因表达的变化

目的研究缺氧复合梭曼中毒后PC12细胞IL-6、GP130、JAK1、STAT1基因mRNA和蛋白表达的变化。方法制备缺氧复合梭曼中毒细胞模型,设对照组、梭曼中毒组、缺氧复合梭曼中毒组和Genistein抑制剂组。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测各组PC12细胞IL-6、GP130、JAK1、STAT1基因mRNA和蛋白的表达水平,并对PCR产物进行测序。结果梭曼中毒后PC12细胞IL-6、GP130、JAK1、STAT1mRNA和蛋白表达水平升高,在中毒后12h达峰值,中毒后24h的表达量低于12h,与对照组比较均有显著差异。缺氧复合梭曼中毒组PC12细胞中IL-6、GP130、JAK1、STAT1 mRNA和蛋白表达水平6h后达峰值,且明显高于对照组、梭曼中毒组和Genistein抑制剂组。RT-PCR产物直接测序证实扩增产物片段与GenBank中相应序列相同。结论梭曼中毒或(和)缺氧后PC12细胞中JAK1/STAT1基因的表达增强,在缺氧复合梭曼中毒所致脑损伤中可能发挥重要作用。     

虎纹捕鸟蜘蛛毒素对全脑缺血大鼠海马神经元细胞形态及bax、bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响

目的:观察蛛网膜下腔注射虎纹捕鸟蜘蛛毒素(HWTX-I)对全脑缺血再灌注大鼠海马神经细胞线粒体和CA1区锥体细胞形态、凋亡相关因子bax和bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响。方法:SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组及HWTX-I组,采用改良的Pulsinelli四血管阻断全脑缺血损伤结合蛛网膜下腔置管术模型,对大鼠海马神经细胞线粒体进行超微结构及Nissl染色形态学观察,免疫组织化学法检测Bax、Bcl-2蛋白表达,RT-PCR法检测baxb、cl-2 mRNA表达。结果:(1)HWTX-I能够使全脑缺血大鼠海马神经细胞线粒体基本维持正常形态。(2)HWTX-I能稳定全脑缺血大鼠海马CA1区锥体细胞分布。(3)HWTX-I能够下调全脑缺血再灌注大鼠海马组织bax mRNA及蛋白表达,上调bcl-2 mRNA及蛋白表达。结论:蛛网膜下腔注射HWTX-I对全脑缺血再灌注所致的大鼠海马神经元损伤有明显的保护作用。     

大鼠脊髓损伤后神经型一氧化氮合酶羧基末端PDZ结合配体mRNA的表达

目的 探讨大鼠脊髓损伤后神经型一氧化氮合酶（nNOS）羧基末端PDZ结合配体（carboxy-terminal PDZ ligand of nNOS，CAPON）mRNA的表达变化及其意义。方法采用脊髓横断模型，用实时荧光定量聚合酶链式反应（realtime-PCR）及原位杂交与免疫荧光技术结合的方法检测正常成年大鼠脊髓内以及脊髓损伤后不同时间点损伤段脊髓组织中CAPONmRNA的表达，采用cresylviolet染色计数脊髓组织内存活神经元。结果 CAPON mRNA在对照组大鼠脊髓内呈低水平表达于前角神经元，脊髓损伤后表达于灰质各部分神经元及白质。在损伤早期2h表达开始升高，于8h达到高峰，随后1d有下降趋势，3d时稍有上升，损伤后14d恢复至正常水平。而nNOSmRNA在损伤后2h迅速上调，于8h达高峰，随即下降至正常水平。在此过程中，有神经元凋亡现象的发生。损伤后2h存活神经元的数量即减少，随后稍有增多，但仍少于对照组，3d后存活神经元再度减少，持续至14d。结论 大鼠脊髓损伤后CAPONmRNA表达发生变化，提示CAPON可能通过调节nNOS的活性及亚细胞定位而影响神经元的凋亡，在脊髓损伤病理过程中发挥积极的调节作用。     

大鼠重型脑伤后一氧化氮/诱生型一氧化氮合酶神经细胞毒性的作用机制

目的 探讨大鼠创伤性脑损伤后一氧化氮／诱生型一氧化氮合酶（ＮＯ／ｉＮＯＳ）神经细胞毒性作用机制。方法 将雄性ＳＤ大鼠１５０只随机分为假手术组、重离伤对照组、左旋精氨酸（Ｌ－Ａｒｇ）治疗组、伤后６ｈ ｉＮＯＳ抑制剂氨基胍（ＡＧ）治疗组、伤后１２ｈ ＡＧ治疗组。采有向位素标记法和免疫组化双酶双标技术,研究大鼠重型脑伤后ｉＮＯＳ活性变化及其细胞定位,观察ｉＮＯＳ抑制剂氨基胍（ＡＧ）及其作用底物Ｌ－Ａｒｇ     

大鼠油酸肺损伤早期肺组织一氧化氮合成酶活性变化、基因表达及其细胞定位

目的观察油酸肺损伤早期肺组织一氧化氮合成酶（ＮＯＳ）活性变化、诱导型一氧化氮合成酶（ｉＮＯＳ）基因表达变化及其细胞定位。方法３Ｈ－胍氨酸测定法测定ＮＯＳ活性；应用３２Ｐ标记核酸探针狭线杂交技术和地高辛标记核酸探针原位杂交技术检测油酸肺损伤大鼠肺组织。结果正常肺组织ＮＯＳ活性很低且无ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达；急性肺损伤后ｉＮＯＳ活性升高且与ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达相一致；硝基左旋精氨酸（ＬＮＮＡ）可抑制ｉＮＯＳ活性并下调ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达；伤后表达ｉＮＯＳｍＲＮＡ的阳性细胞可能为肺泡巨噬细胞、粒细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、平滑肌细胞、内皮细胞。结论急性肺损伤后肺组织ｉＮＯＳｍＲＮＡ的表达是一个突然启动的主动合成过程；ＬＮＮＡ抑制ＮＯ产生可能与其下调ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达有关；肺组织表达ｉＮＯＳｍＲＮＡ阳性细胞的多样性可能与ＮＯ损伤肺组织的复杂性有关。     

模拟微重力对大鼠嗜铬细胞瘤细胞形态及其生长的影响

目的研究回转是否影响PC12细胞内蛋白质的羰基化和硝基化水平，进而影响细胞骨架和形态；细胞内活性氮水平升高是否会影响PC12细胞的增殖分化。方法观察并测定了静置对照组和回转组细胞的细胞形态和细胞密度的变化，采用免疫荧光标记和RT—PCR技术研究了回转对细胞骨架蛋白Actin羰基化和Tubulin硝基化以及nNOS和iNOS的mRNA和蛋白表达的影响；并利用流式细胞术检测了细胞周期的改变，初步探讨了这些改变和一氧化氮合酶之间的关系。结果细胞骨架蛋白发生硝基化和羰基化的改变，但回转组细胞骨架形态变化不明显，PC12细胞的微丝回转后明显伸长；回转后，细胞密度显著增加，细胞周期中DNA合成的S期明显缩短。结论结果表明水平回转模拟微重力并不改变PC12细胞形态，相反还有利于细胞的生长，其机制可能与一氧化氮合酶的表达上调有关。     

抗辐灵活性成分对微波辐射致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用研究

目的：观察抗辐灵活性成分黄芪总苷、赤芍总苷和丹参酮对微波辐射致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用。方法采用神经生长因子（ nerve growth factor,NGF）诱导的PC12细胞为模型,分别给予1、3和9μg／ml黄芪总苷、赤芍总苷、丹参酮,作用48 h后经30 mW／cm2微波辐射6 min,于辐射后即刻采用倒置相差显微镜观察PC12细胞形态变化,四甲基偶氮唑盐（ methylthiazolyl tetrazolium,MTT）比色法测定细胞生存率,活性氧探针二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH－DA）法测定细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA）法测定细胞脂质过氧化代谢产物丙二醛（ malonyldialdehyde,MDA）含量。结果3种活性成分作用后经微波辐射各组PC12细胞形态未见明显差异。辐射后6 h,辐射组PC12细胞较对照组（假辐射组）生存率明显降低（P＜0．01）;与辐射组相比,黄芪总苷（3μg／ml）给药组PC12细胞生存率明显提高（P＜0．01）。辐射后0和48 h,辐射组PC12细胞ROS、MDA水平明显升高（P＜0．01）,与辐射组相比,各药物预处理组PC12细胞ROS、MDA水平均显著降低（P＜0．05）。结论抗辐灵3种活性成分能改善微波辐射对PC12细胞的损伤,其保护作用可能是通过清除氧自由基和减轻氧化应激损伤来实现的。     

去铁敏对损伤脊髓一氧化氮合酶表达的影响

目的 研究去铁敏(DFO)对急性脊髓损伤大鼠的神经功能保护作用及对3种一氧化氮合酶(NOS)亚型表达的影响.方法 利用Allen's打击模型,致伤力为25gcf(10g×2.5cm),选用SD大鼠36只,随机分为3组(n＝12):空白组(C组);脊髓损伤组(生理盐水组,S组);去铁敏治疗组(DFO组).分别于伤后4小时取材,免疫组化方法检测3种NOS亚型的表达情况,并于伤后5周行BBB评分.结果 DFO组及S组伤后上述指标比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论 去铁敏通过阻断铁离子引发的脊髓组织脂质过氧化反应而减轻脊髓组织的炎症反应,减少诱导型NOS(iNOS)的表达;并通过减轻脊髓组织细胞内钙超载,降低固有型NOS(cNOS)的活性,减少了脊髓组织的继发损伤程度.     

白藜芦醇预处理对心肌细胞缺血/再灌注损伤的保护作用

目的观察白藜芦醇预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法培养乳鼠心肌细胞,模拟I/R损伤,随机分为阴性对照组、缺血再灌组及白藜芦醇预处理组,采用台盼蓝穿透法及MTT比色法测定细胞活力,检测细胞培养液中LDH活性及心肌细胞Na^＋-K^＋-ATP酶、Ca^2＋-ATP酶活力。结果Res预处理可提高心肌细胞活力;稳定心肌细胞膜,抑制LDH释放;保护心肌细胞钠泵和钙泵功能,减轻再灌注损伤。结论白藜芦醇预处理对心肌缺血再灌注损伤有明显保护作用。     

大鼠睡眠剥夺后下丘脑一氧化氮合酶mRNA表达的变化

目的观察快动眼睡眠剥夺大鼠下丘脑神经元型一氧化氮合酶 (nNOS )及诱导型一氧化氮合酶(iNOS )mRNA表达的时相变化。方法小站台水环境法剥夺大鼠睡眠 2 4h、48h及 72h后 ,用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR )检测其下丘脑nNOS及iNOSmRNA的表达。结果睡眠剥夺 2 4h组nNOSmRNA表达量显著增加 (P <0 .0 1 ) ,剥夺 48h组与对照组比较无显著差异 ,剥夺 72h组nNOSmRNA的表达量低于对照组水平 (P <0 .0 5 ) ;睡眠剥夺 2 4h和 48h组iNOSmRNA的表达量无显著变化 ,但剥夺 72h组iNOSmRNA的表达量大幅度增加 (P <0 .0 1 )。结论睡眠剥夺后NOS基因表达增加 ,可能是睡眠“反跳”现象的机理之一 ;持续的睡眠剥夺状态下较高水平的NO还可能参与了睡眠剥夺对机体功能的损伤