Smac基因联合12C6+离子照射对膀胱癌EJ细胞的生物效应观察

目的观察smac基因能否提高膀胱癌EJ细胞12C6 离子照射的生物效应。方法实验分为3组:空白对照组、转染空载体组、转染smac基因组。利用免疫组化及流式细胞仪方法检测3组细胞内smac基因表达。转染24h后对3组分别进行0、2和4Gy12C6 离子照射,用克隆形成实验对3个组分别检测细胞的存活分数并利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果免疫组化结果表明转染pcDNA3.1/smac的细胞其smac基因表达量明显高于转染空载体pcDNA3.1的细胞和空白组细胞。流式细胞仪数据显示,smac基因转染细胞smac基因的荧光强度(3080)显著高于转染空载体组(2256)(P<0.05),而后者与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。克隆形成实验结果表明,转染smac基因组细胞12C6 离子照射后的存活分数较转染空载体组细胞显著降低(P<0.05)。流式细胞仪测定结果表明,12C6 离子照射的转染smac基因组的细胞凋亡率明显高于转染空载体组(P<0.05)。结论外源smac基因转染膀胱癌细胞株能显示高表达,并能提高膀胱癌细胞的凋亡率,与12C6 离子照射结合后能显著降低细胞存活分数和进一步增高凋亡率。     

人Slitrk1基因对PC12细胞增殖和分化的影响

目的研究人Slitrk1基因过表达对PC12细胞增殖和分化的影响。方法PCR扩增人Slitrk1 CDS，克隆到pcDNA4／myc-His A载体，构建重组质粒pcDNA4／St1，分别以空载体和重组质粒转染PC12细胞，RT-PCR法鉴定出阳性转染细胞，观察空载体转染的PC12细胞（pcDNA4／PC12）和过表达Slitrk1的PC12细胞（ST1／PC12）的表型并用MTT法检测细胞增殖情况。结果与空载体转染的PC12细胞相比，过表达Slitrk1基因的细胞增殖速度明显减慢。pcDNA4／PC12与野生型PC12细胞表型一致，均为悬浮成团生长，细胞少有突起，而ST1／PC12细胞大部分贴壁生长，突起多见，呈分化状态。结论过表达人Slitrk1基因能够抑制PC12细胞增殖，促进细胞的贴壁及突起长出。人Slitrk1基因可能有促进PC12细胞神经分化的作用。     

缺氧对PC12细胞中活性氧含量和缺氧诱导因子 血管内皮生长因子表达的影响

目的研究缺氧对PC12细胞中ROS含量和HIF-1α、VEGF表达的影响,初步探讨缺氧损伤的分子机制。方法使用三气培养箱建立PC12细胞缺氧损伤模型;观察缺氧环境下细胞形态的改变;MTT法检测细胞存活率;DCHF-A染色检测ROS的含量;RT-PCR检测HIF-1α、VEGF mRNA的表达;Western Blot检测HIF-1α、VEGF蛋白的表达。结果与正常组相比较,缺氧24 h后ROS明显升高;HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达较正常组明显升高。结论缺氧24 h后可以导致PC12细胞中ROS含量、HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达升高。     

大黄素甲醚对神经细胞缺氧性损伤保护作用的实验研究

目的:研究大黄素甲醚对缺氧引起的PC12神经细胞损伤的保护作用。方法:培养PC12细胞,建立神经细胞缺氧损伤模型,观察组细胞在缺氧损伤前采用大黄素甲醚进行预处理。MTT检测PC12细胞增殖活性,光学显微镜观察PC12细胞形态学、测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量、荧光免疫组化法测定c-fos蛋白表达、RT-PCR检测nNOS、iNOS mRNA表达。结果:细胞形态学研究提示大黄素甲醚明显提高PC12细胞的抗缺氧活性。大黄素甲醚处理后,细胞存活率明显提高,上清液LDH水平明显下降,c-fos表达明显降低(P<0.05)。RT-PCR结果分析显示nNOS mRNA在缺氧早期表达,iNOS mRNA主要在缺氧中晚期表达。结论:大黄素甲醚能减轻缺氧所致的神经元损伤,对神经元起保护作用。     

缺氧复合梭曼中毒后PC12细胞IL-6、GP130、JAK1、STAT1基因表达的变化

目的研究缺氧复合梭曼中毒后PC12细胞IL-6、GP130、JAK1、STAT1基因mRNA和蛋白表达的变化。方法制备缺氧复合梭曼中毒细胞模型,设对照组、梭曼中毒组、缺氧复合梭曼中毒组和Genistein抑制剂组。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测各组PC12细胞IL-6、GP130、JAK1、STAT1基因mRNA和蛋白的表达水平,并对PCR产物进行测序。结果梭曼中毒后PC12细胞IL-6、GP130、JAK1、STAT1mRNA和蛋白表达水平升高,在中毒后12h达峰值,中毒后24h的表达量低于12h,与对照组比较均有显著差异。缺氧复合梭曼中毒组PC12细胞中IL-6、GP130、JAK1、STAT1 mRNA和蛋白表达水平6h后达峰值,且明显高于对照组、梭曼中毒组和Genistein抑制剂组。RT-PCR产物直接测序证实扩增产物片段与GenBank中相应序列相同。结论梭曼中毒或(和)缺氧后PC12细胞中JAK1/STAT1基因的表达增强,在缺氧复合梭曼中毒所致脑损伤中可能发挥重要作用。     

脑红蛋白减轻硝普钠诱导的PC12细胞损伤

目的:探讨脑红蛋白(NGB)对硝普钠(SNP)诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制.方法:利用一氧化氮(NO)供体——硝普钠诱导制备NO损伤细胞模型,通过转染真核表达载体方式在PC12细胞中过表达NGB,采用Western印迹方法检测NGB表达水平,采用RT-PCR方法检测细胞内bcl-2基因的表达变化,并检测细胞活性(MTT法)、LDH释放量和胞内胞外NO含量.结果:过表达NGB可提高PC12细胞的存活率,增加bcl-2基因的表达,但不改变胞内、外NO的含量.结论:NGB可保护硝普钠诱导的PC12细胞损伤,其机制可能与增加抗凋亡基因bcl-2的表达有关.     

hHO-1联合GATA-4修饰大鼠骨髓间充质干细胞抗凋亡及向心肌分化的实验研究

目的 探讨经人血红素加氧酶1 (hHO-1)基因和GATA-4基因联合修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧环境中抗凋亡及体外分化为心肌细胞样细胞的能力是否优于hHO-1或GATA-4单基因修饰的BMSCs.方法 采用全骨髓贴壁法分离、培养BMSCs并进行鉴定,重组腺病毒转染BMSCs,Western blotting法确定基因表达的最佳时间;以缺氧无血清条件模拟体内缺血缺氧微环境培养基因修饰的BMSCs,采用CCK-8试剂盒和台盼蓝染色法分别检测缺血缺氧培养12、24、48、72h细胞存活率,流式细胞术检测缺血缺氧培养24h细胞凋亡情况,Western blotting及细胞免疫荧光法检测特异性心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)表达情况.结果 缺血缺氧培养12、24、48、72h的hHO-1 +GATA-4组细胞生存率均高于hHO-1组(P＜0.05)和GATA-4组(P＜0.05).缺血缺氧培养24h的hHO-1 +GATA-4组细胞凋亡率低于hHO-1组(P＜0.05)和GATA-4组(P＜0.05);GATA-4组与hHO-1 +GATA-组的cTnI表达差异无统计学意义.结论 hHO-1与GATA-4联合修饰可明显增强缺血缺氧BMSCs的存活;与GATA-4单基因修饰相比,联合修饰并没有增强BMSCs向心肌细胞分化的能力.     

12C6+重离子诱导可溶性TRAIL表达增强及其抗肿瘤作用的实验研究

目的构建可被辐射诱导激活的表达载体pEgr-sTRAIL,研究其体外瞬时转染联合不同剂量的^12C^6＋离子辐照对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖活性的影响。方法SOEing PCR法克隆可溶性TRAIL基因,测序正确后连入pcDNA3.1-Egr质粒,构建pEgr-sTRAIL表达载体;采用GeneCompanionTM聚阳离子转染试剂体外瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞;接受不同剂量的^12C^6＋照射后,RT-PCR法检测目的基因 mRNA水平的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,克隆形成实验检测细胞增殖存活。结果成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-sTRAIL;瞬时转染联合^12C^6＋离子照射可在mRNA水平上诱导sTRAIL表达增强;随照射剂量的增加,转染pEgr-sTRAIL的HeLa细胞凋亡率明显增加,克隆形成率明显下降。结论^12C^6＋离子可诱导重组质粒pEgr-sTRAIL在被转染的HeLa细胞中表达增高,体外基因-^12C^6＋离子联合治疗可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

外源性PTEN cDNA对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

 目的 探讨外源性野生型PTEN cDNA对人子宫内膜癌细胞RL95-2增殖、克隆形成和凋亡的影响.方法 脂质体介导携带野生型PTEN cDNA的质粒pcDNA3.0-PTEN cDNA转染人子宫内膜癌细胞RL95-2;G418筛选被转染的细胞株并扩增培养;RT-PCR方法检测PTEN cDNA在RL95-2细胞中的表达,并以转染空载体及未转染的RL95-2为对照组.四唑盐(MTT)比色实验检测细胞增殖活力,软琼脂克隆形成实验检测转染后细胞的克隆形成率,透射电镜观察细胞形态.结果 G418筛选得到稳定表达细胞株;RT-PCR方法检测PTEN cDNA在RL95-2细胞中持续表达.转染PTEN cDNA组的细胞培养24 h、48 h、72 h和96 h后A490值明显低于转染空载体组(P<0.01),而转染空载体组的A490值与未转染组比较无明显差异(P＞0.05);转染PTEN cDNA组细胞克隆形成数与转染空载体组之间相比有显著性差异(P<0.01),而转染空载体组与未转染组之间相比没有显著性差异(P>0.05);转染PTEN cDNA组透射电镜下出现肿瘤细胞凋亡表现,而转染空载体组细胞超微结构未见异常.结论 PTEN cDNA稳定表达可明显抑制RL95-2细胞的体外增殖、克隆形成并诱导细胞凋亡.     

载脂蛋白E基因多态性对星形胶质细胞损伤早期胞内Ca2+浓度的影响

目的 探讨载脂蛋白E(apolipoprotein E,蛋白:apoE,基因:APOE)基因多态性与星形胶质细胞损伤后早期胞内Ca2+浓度的相关性.方法 (1)通过RT-PCR及定点突变技术扩增人源性APOE三种等位基因的CDS区,并构建pEGFP-N1-APOE重组质粒;(2)APOE基因敲除鼠星形胶质细胞的原代培养、鉴定;脂质体法将重组质粒转染入星形胶质细胞,并筛选稳定表达APOE信息的细胞株;(3)利用划痕致伤构建细胞损伤模型,于伤后12,24,48及72 h时相点,利用激光共聚焦显微镜(LCSM)技术检测各基因型细胞内Ca2+的荧光强度.结果 各型细胞相对于自身对照(致伤前),Ca2+荧光强度变化差异有统计学意义(P＜0.05).伤后12 h,三组细胞内Ca2+荧光强度较弱,组间差异无统计学意义(P＞0.05);伤后24,48及72 h,三组细胞Ca2+荧光强度进行性增加,且ε4组明显高于ε2和ε3组(P＜0.05).结论 损伤后早期,携带APOEε4等位基因的星形胶质细胞内Ca2+高于ε2和ε3型,提示ε4携带体可能通过伤后Ca2+通道的激活导致急性期伤情加重及不良预后.     

抗辐灵活性成分对微波辐射致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用研究

目的：观察抗辐灵活性成分黄芪总苷、赤芍总苷和丹参酮对微波辐射致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用。方法采用神经生长因子（ nerve growth factor,NGF）诱导的PC12细胞为模型,分别给予1、3和9μg／ml黄芪总苷、赤芍总苷、丹参酮,作用48 h后经30 mW／cm2微波辐射6 min,于辐射后即刻采用倒置相差显微镜观察PC12细胞形态变化,四甲基偶氮唑盐（ methylthiazolyl tetrazolium,MTT）比色法测定细胞生存率,活性氧探针二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH－DA）法测定细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA）法测定细胞脂质过氧化代谢产物丙二醛（ malonyldialdehyde,MDA）含量。结果3种活性成分作用后经微波辐射各组PC12细胞形态未见明显差异。辐射后6 h,辐射组PC12细胞较对照组（假辐射组）生存率明显降低（P＜0．01）;与辐射组相比,黄芪总苷（3μg／ml）给药组PC12细胞生存率明显提高（P＜0．01）。辐射后0和48 h,辐射组PC12细胞ROS、MDA水平明显升高（P＜0．01）,与辐射组相比,各药物预处理组PC12细胞ROS、MDA水平均显著降低（P＜0．05）。结论抗辐灵3种活性成分能改善微波辐射对PC12细胞的损伤,其保护作用可能是通过清除氧自由基和减轻氧化应激损伤来实现的。     

当归有效成分抗缺氧损伤作用的研究进展

临床实践表明,当归注射液对脑中风患者可以起到治疗作用.经研究,当归抗低氧有效成分主要包括苯酞类、香豆素类、黄酮类、挥发油类化合物等.目前普遍认为当归可以通过抗自由基损伤、调节基因表达、激活蛋白酶、影响一氧化氮生成等方面发挥抗缺氧保护作用.我们最近的工作证明当归还可能有其他成分通过与以上机制不同的途径发挥低氧效应.有关经验教训可能对其他植物有效部位群活性研究提供借鉴.     

脑损伤后碱性成纤维细胞生长因子基因表达与组织病理学改变

目的：从分子水平探讨颅脑损伤发病机制，为临床治疗脑损伤寻救有效手段．方法：选择Ｗｉｓｔａｒ大鼠７５只，利用Ｍａｒｍａｒｏｕ颅脑损伤装置造成动物不同程度弥漫性脑损伤．以Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、组织病理学方法，动态观察动物脑损伤后碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）基因表达变化及脑组织病理学改变．结果：轻度颅脑损伤后１２小时，ｂＦＧＦ基因表达增加，伤后３天达峰值．重度颅脑损伤后４小时，ｂＦＧＦ基因表达明显增加，伤后第３天达到高峰，明显高于轻度颅脑损伤组水平．结论：ｂＦＧＦ基因表达与脑损伤程度密切相关，作为生长因子之一，ｂＦＧＦ可能参与颅脑损伤后神经元保护及损伤后修复过程．     

还原型辅酶Ⅰ(NADH)对PC12细胞鱼藤酮损伤的分子调控

为探讨NADH对PC12细胞线粒体鱼藤酮损伤的修复机制，采用细胞毒实验、免疫荧光和流式细胞仪检测细胞在鱼藤酮损伤前后细胞增殖基因（c-myc、c-erbB-2）、抗凋亡基因（bcl－2）、抑癌基因（p53）、细胞快反应基因（c-fos）相关蛋白和细胞增殖核抗原（PCNA）的表达。结果表明，鱼藤酮能明显抑制PC12细胞增殖，下调c-erbB-2、c-myc、bcl-2和p53基因的表达；NADH可以抑制鱼藤酮对PC12细胞线粒体的毒性作用，上调细胞bcl-2c、c-myc、c-erbB－2基因和PCR的表达，提示鱼藤酮可能通过控线粒体磷酸化过程和下调细胞增殖基因（c-rebB-2、c－myc）、抗凋亡基因（bcl-2），上调快反应基因(c-fos）表达致使细胞损伤，NADH抑制鱼藤酮对PC12细胞的损伤可能与bcl-2、c-myc、c-erbB-2和p53表达调控有关。     

缺氧对血管内皮细胞内皮素分泌的影响及茶多酚的保护作用

目的：观察缺氧对培养的血管内皮细胞分泌内皮素的影响及茶多酚的保护作用.方法：将培养的血管内皮细胞分为空白对照组、单纯缺氧组和茶多酚加缺氧组,采用低压舱对培养的血管内皮细胞进行缺氧,采用放射免疫方法测定各组样本细胞培养液中的内皮素浓度.结果：单纯缺氧组的内皮素浓度显著高于空白对照组（P＜0.01）,加入茶多酚后,血管内皮细胞的内皮素浓度显著降低（P＜0.05）.结论：急性缺氧可显著增加培养的血管内皮细胞的内皮素浓度,茶多酚可显著降低缺氧引起的内皮素浓度的增加,从而起到保护作用.     

碱性成纤维生长因子对大鼠骨骼肌细胞缺氧复氧损伤的影响

应用培养的新生Wistar大鼠骨骼肌细胞缺氧复氧（A/R）损伤模型，观察碱性成纤维细胞生工因子（bFGF）对A/R损伤及损伤后骨骼肌细胞凋亡（apoptosis)的影响，以探讨bFGF作物药物预处理保护骨骼肌细胞的可行性。结果表明，bFGF预处理呈浓度依赖性地提高了A/R后肌细胞存活率，减少了胞浆乳酸脱氢酶（LDH）的漏出，明显上调了骨骼肌细胞凋亡相关基因蛋白Bcl-2的表达，提示bGFG对A/R损伤的骨骼肌细胞有明显保护作用。