壳聚糖微球介导人IL-1Ra与TGF-β1基因转染兔软骨细胞的研究

目的 探讨壳聚糖微球介导人IL-1Ra与TGF-β1基因转染兔软骨细胞.方法 制备壳聚糖微球介导IL-1Ra质粒与TGF-β1质粒转染系统,检测其载药、体外释药、降解,转染体外培养的兔膝软骨细胞,荧光显微镜、荧光定量PCR、MTT检测.结果 壳聚糖-IL-1Ra DNA和壳聚糖-TGF-β1 DNA微球平均径粒(2.8±0.2)μm和(2.6±0.1)μm,包封率(88.3±4.1)%和(87.2±2.6)%;缓释分3个阶段.荧光显微镜观察、荧光定量PCR证实软骨细胞转染基因得到30 d表达.MTT提示转染促进软骨细胞增殖.结论 壳聚糖微球介导IL-1Ra与TGF-β1基因转染软骨细胞可获得较长期目的基因表达,可促进软骨细胞增殖,为用于基因治疗软骨退变和促进软骨修复提供基础.     

骨形态发生蛋白-2和转化生长因子-β1双基因共表达对骨髓基质细胞向软骨细胞分化基因表达的影响

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和转化生长因子-β1 (TGF-β1)双基因真核共表达载体对兔骨髓基质细胞(MSCs)向软骨细胞分化mRNA表达的影响。方法 pIRES-BMP-2-TGF-β1、pIREES-BMP-2 and pIRES-TGF-β1质粒通过质脂体介导转染MSCs,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MSCs内Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达。结果 转染后2、4d双基因组MSCs内的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达量60.4±10.1、606.0±88.5和42.6±6.0、411.2±73.6均明显高于转染后单一BMP-2(28.7±4.0、236.7±48.5和26.9±4.3、208.2±36.7)及TGF-β1(30.9±4.54、205.5±38.7和28.4±3.7、184.9±30.9)组(P＜0.05)。结论 pIRES-BMP-2-TGF-β1双基因真核共表达载体诱导MSCs向软骨细胞分化的作用强于单一基因BMP-2及TGF-β1。     

转IL-1Ra和TGF-β1基因治疗兔骨性关节炎的体外实验研究

目的 探讨重组人IL-1Ra和TGF-β1双基因在体外对兔骨性关节炎软骨退变的治疗效果.方法 取新西兰大白兔关节软骨,经消化分离,软骨细胞以1.5×105/ml浓度培养于6孔培养板.软骨细胞分为5组,转染IL-1Ra组、转染TGF-β1组、转染IL-1Ra＋TGF-β1双基因组、未转染组、空白组.上述转染组均以LipofectamineTM 2000 Reagent脂质体为转染媒介.各组加入软骨块,除空白组外,其余各组均加入20 ng IL-1β.于第6天后每组各取4孔1.5 ml培养基,ELISA法检测TGF-β1和IL-1Ra的含量,RIA法检测IL-1β和TNF-α的含量.收集软骨块做HE染色、阿尔新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化检测等组织学观察.结果 转染组IL-1Ra或TGF-β1有较高的表达水平;转染组IL-1β和TNF-α的表达水平降低,在双基因组降低最明显,与单基因组之间有显著性差异（P〈0.05）.转基因组基质染色均比未转染组着色较深.在双基因组软骨细胞排列尚整齐,细胞数量多,基质深染.结论 联合基因治疗效果优于单基因,为体外骨性关节炎的基因治疗提供实验基础.     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

人IL-1受体拮抗蛋白重组逆转录病毒载体的构建、鉴定及在骨关节炎软骨细胞中的表达

目的 构建含人IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)逆转录病毒表达载体(PLXRN-IL-1Ra),体外转染人骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨细胞,研究其相关特性.方法 利用细菌内同源重组技术快速构建PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒重组质粒,经测序及酶切鉴定正确后转染PT67细胞,包装成为重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒,并使用小鼠肾成纤维细胞系NIH/3T3对病毒进行滴度测定.实验分为3组未转染组(A组)、PLXRN空质粒转染组(B组)、PLXRN-IL-1Ra转染组(C组),病毒感染人OA软骨细胞后,RT-PCR检测细胞内IL-1Ra基因的转录和表达;ELISA法检测细胞培养上清液中人IL-1Ra蛋白表达.结果 酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒中含有人IL-1Ra cDNA,测定包装的病毒滴度为3 × 104 CFU/mL.原代软骨细胞体外培养呈多角形或梭形,甲苯胺蓝染色见细胞内有紫色异染颗粒.RT-PCR结果显示在C组出现311 bp人IL-1Ra mRNA片段,A、B组未见人IL-1Ra mRNA的表达带,GAPDH在各组均有表达.ELISA检测发现C组细胞上清有一定量的人IL-1Ra表达,蛋白浓度为(60.47±15.13)ng/L,A组和B组均无人IL-1Ra表达.结论 构建的IL-1Ra逆转录病毒表达载体成功地感染人OA软骨细胞,并在体外获得稳定表达,为将表达人IL-1Ra基因的人OA软骨细胞用于OA基因治疗提供了实验依据.     

超声微泡介导白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因体外转染兔软骨细胞的研究

目的 观察超声介导下携白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因(IL-1Ra)的微泡体外转染兔软骨细胞的效率和表达.方法 体外分离培养兔软骨细胞,分为单纯质粒组(P)、微泡+质粒组(M+P)、超声+质粒组(U+P)和超声+微泡+质粒组(U+M+P),照射后48 h,荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测IL-1Ra基因的mRNA和蛋白表达,台盼兰染色检测细胞生存率.结果 U+M+P组转染效率较其他三组明显提高,为(11.6±1.0)%;且eGFP-C1-IL-1Ra质粒经超声微泡介导转染后可表达IL-1Ra的mRNA和蛋白.结论 超声微泡可介导IL-1Ra基因在兔软骨细胞内的转染和表达,可望成为软骨损伤基因治疗的新方法.     

TGF—β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]本研究通过选择对软骨细胞ECM合成具有促进作用的TGF-β1转染脂肪干细胞(ADSCs),观察转染后目的基因的稳定表达和对软骨细胞外基质(ECM)的两种重要组分:Ⅱ型胶原(type Ⅱ collage,ColⅡ)和aggrecan的合成,为构建新型的组织工程软骨提供实验依据.[方法]TGF-β1基因转染脂肪干细胞及阳性细胞克隆株的筛选;RT-PCR检测TGF-β1、纤连蛋白(fibronectin,FiN)、ColⅡ、Aggrecan的表达;Western-blot检测TGF-β1.[结果]RT-PCR结果显示:实验组(TGF-β1稳定转染组)的TGF-β1、FN、Col Ⅱ、Aggrecan的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01);Western blot检测实验组(TGF-β1稳定转染组)TGF-β1蛋白的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01).[结论]成功分离培养脂肪干细胞;以脂质体介导法将TGF-β1目的基因成功转染ADSCs,转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多,表明转染TGF-β1基因可以促使ADSCs向软骨细胞方向分化,从而为软骨组织工程提供新的思路和方法.     

慢病毒介导TGF-β1基因诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化

[目的]探讨慢病毒介导转化生长因子β1(tansforming growth factor bata 1,TGF-β1)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导成软骨细胞分化的作用。[方法]密度梯度离心法分离培养BMSCs,探索病毒感染最佳条件,取第3代细胞,分为实验组和对照组,通过慢病毒载体将外源性TGF-β1基因转染入细胞,观察绿色荧光表达情况,Real-time PCR法和western blot法检测TGF-β1基因的mRNA和蛋白表达情况,7、14 d时行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和Real-time PCR检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的表达。[结果]TGF-β1基因转染BMSCs后能够稳定表达。转染7、14 d时,实验组免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。转染7、14 d时,实验组II型胶原mRNA均显著高于对照组(P<0.01)。转染7 d时,实验组聚集蛋白聚糖mRNA变化不明显,而14 d时显著高于对照组(P<0.01)。[结论]慢病毒介导的TGF-β1基因可成功转染大鼠BMSCs,并诱导其向软骨细胞分化。在此过程中软骨特异性标志Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达具有时间差异性。     

pcDNA3+转化生长因子-β1单独转染及其与pAT153+胰岛素样生长因子-1共转染兔软骨细胞的研究

目的 探讨重组大鼠转化生长因子-β1基因（pcDNA3＋TGF-β1）单独转染及其与重组大鼠胰岛素样生长因子-1基因（pAT153＋IGF-1）共转染兔软骨细胞后细胞增殖及所分泌的TGF-β1因子、IGF-1因子、Ⅱ型胶原的变化。方法 兔软骨细胞体外分别用pcDNA3＋TGF-β1单转染、pcDNA3＋TGF-β1和pAT153＋IGF-1共转染，筛选阳性克隆后，进行原位杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测、流式细胞仪检测、^3H．TdR（^3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷）检测。结果 基因转染组与空白组相比，TGF-^31、IGF-1、Ⅱ型胶原的含量均明显提高，空白组、基因单转染组、基因双转染组软骨细胞位于S期的比例分别为5．6％、33．4％、40．1％，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 基因pcDNA3＋TGF-β1、pAT153＋IGF-1转染软骨细胞后，细胞分泌的TGF-Ⅱ1、IGF-1及Ⅱ型胶原显著增多，细胞增殖明显增强，上述基因转染有助于软骨细胞活力的提高；pcDNA3＋TGF-β1和pAT153＋IGF-1双基因共转染软骨细胞后，细胞分裂增生活跃程度及分泌的TGF-β1、IGF-1和Ⅱ型胶原含量高于pcDNA3＋TGF-β1单基因转染，多基因共转染作为将来骨性关节炎基因治疗的方法，其治疗效果可能会优于单基因转染。     

重组PGL3-转化生长因子β1基因转染兔骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨将编码细胞转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的重组PGL3-TGF-β1质粒转染兔骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs),体外通过自分泌、诱导作用向软骨细胞方向分化的可行性,为基因加强组织工程学修复软骨损伤提供体外实验依据.方法兔MSCs体外密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养,脂质体法转染重组PGL3-TGF-β1,转染后绘制不同时期细胞生长曲线,MTT法分析转染后细胞(实验组)生长活性,以未转染空载体细胞为实验对照组,未转染细胞为空白对照组;转染后第2、7天,分别进行抗TGF-β1和抗Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学染色(SABC法),以未转染细胞为实验对照组,PBS作为一抗为空白对照组,进行图像定量分析.结果 MSCs体外分离培养,脂质体法转染后,生长曲线显示转染后细胞生长活性较对照组降低,MTT法显示实验组及实验对照组吸光度(A)值较空白对照组低,差异有统计学意义(P＜0.01);实验组转染细胞第2天,抗TGF-β1免疫组织化学染色可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性;转染细胞第7天,抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色实验组可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性.图像分析示,实验组抗TGF β1及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性值与实验对照组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论脂质体法重组PGI3-TGF-β1基因可成功转染兔MSCs,但对细胞生长有一定影响,转染细胞表达TGF β1,通过其自分泌、诱导作用,细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白,表现出软骨细胞样生理特征,并向软骨细胞方向分化.     

骨形成蛋白-2和转化生长因子-β1双基因在骨髓基质细胞中的共表达

目的 观察骨形成蛋白(BMP)-2、转化生长因子(TGF)-β1双基因真核表达载体在骨髓基质细胞中的共表达.方法 以pGEM-T-BMP-2及pGEM-T-TGF-β1为模板,分别用引入新的酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增出1188 bp长度的BMP-2和1173 bp长度的TGF-β1两个目的 基因片段;依次将其定向克隆入真核双基因表达载体pIRES;酶切、分析及序列测定重组子:然后,用脂质体包裹转染骨髓基质细胞;荧光定量逆转录(RT)-PCR方法 检测BMP-2及TGF-β1基因的共表达情况.结果 双酶切可见1188 bp的BMP-2条带及核酸序列测定证实重组质粒pIRES-BMP-2-TGF-131构建正确,并在骨髓基质细胞中能同时高效表达BMP-2和TGF-β1 mRNA.结论 BMP-2和TGF-β1双基因真核载体能够在骨髓基质细胞中实现BMP-2和TGF-β1基因共表达.     

转化生长因子-β1基因和胰岛素样生长因子1基因联合转染治疗兔膝骨性关节炎的研究

目的观察重组大鼠转化生长因子(TGF)-β1和胰岛素样生长因子(IGF)-1基因转染兔膝关节后对骨性关节炎(OA)的治疗效果。方法前交叉韧带切断法(ACLT)将新西兰白兔膝关节制成OA模型,分为5组,分别向膝关节内注射转染了不同重组基因的阳性克隆软骨细胞。4 周和8周后,取关节标本进行Mankin’s评分,AB-PAS染色,TGF-β1、IGF-1、Ⅱ型胶原原位杂交和免疫组织化学检测,透射电镜观察。结果手术对照组软骨损伤程度较大,其Mankin’s评分为 9．50±0．96(4周)和12．5±1．71(8周),明显高于空白对照组(P<0．01)和TGF—β1基因转染组、双基因转染组(P<0．05);各因子原位杂交和免疫组织化学染色,空白对照组(P<0．01)及TGF-β1 基因转染组、双基因转染组(P<0．05)的灰度值高于手术对照组;双基因转染组的灰度值较单基因转染组高(P<0．05);8周时各对应组灰度值较4周有明显下降(P<0．05);透射电镜观察显示,手术对照组的超微结构较空白对照组明显紊乱,经基因治疗4周后,超微结构逐渐恢复正常,但在8 周后,其紊乱程度又逐渐加重。结论关节内注射转基因软骨细胞对OA有一定治疗作用;TGF-β1 和IGF-1双基因的治疗效果优于单基因;基因治疗4周后,基因表达逐渐减弱,基因治疗具有时效性。     

白细胞介素-1受体拮抗蛋白和白细胞介素-10联合基因转染人骨关节炎软骨细胞的研究

目的探讨逆转录病毒载体PLXRN介导的人白细胞介素-1受体拮抗蛋白（hIL-1Ra）和白细胞介素-10（hlL-10）联合基因转染在人骨关节炎（OA）关节软骨细胞中稳定表达的可行性。方法构建含目的基因的表达载体PLXRN-IL-1Ra和PLXRN—IL-10，经酶切及测序鉴定正确后单个或联合转染人OA软骨细胞，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞内目的基因的表达；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中hlL-1Ra和hlL-10蛋白表达量的水平。结果酶切和测序表明获得了与预期结果一致的PLXRN—IL—IRa和PLXRN—IL-10真核表达载体。稳定转染软骨细胞后，RT-PCR检测到了细胞内hIL-1Ra和hIL-10mRNA片段。ELISA检测发现基因转染组均有相应的一定量的hlL．1Ra和hIL-10表达，单个基因转染组中分别为（60．47±15．13）和（19．73±4．10）ng／L；联合基因转染组为（67．15±11．47）和（16．76±9．96）ng／L。未转染组及PLXRN空质粒转染组均无hIL—IRa和hlL-10表达，基因转染组与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），而单个基因转染组和联合基因转染组组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论逆转录病毒载体PLXRN介导的hlL-1Ra和hlL-10联合基因可有效地感染人OA关节软骨细胞并获得稳定表达，为将表达hIL-IRa和hlL-10目的基因的人OA软骨细胞用于OA基因治疗提供了依据。     

转染Megsin基因对体外系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原分泌的影响及机制

目的 了解Megsin基因高表达对体外系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原分泌的影响，并探讨其机制。 方法 构建大鼠Megsin基因真核表达载体，体外转染系膜细胞。3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入法检测系膜细胞增殖情况。RT-PCR方法检测系膜细胞血小板源生长因子(PDGF)-BB、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α mRNA表达变化。ELISA法检测细胞培养上清PDGF-BB、TGF-β1和Ⅳ型胶原浓度。观察PDGF-BB中和抗体对大鼠系膜细胞转染Megsin基因后细胞增殖和TGF-β1 mRNA表达的影响。 结果 大鼠系膜细胞转染Megsin基因后，细胞内3H-TdR掺入量显著增加，PDGF-BB和TGF-β1 mRNA表达显著上调，细胞培养上清PDGF-BB、TGF-β1和Ⅳ型胶原的浓度显著升高，3者与转染Megsin基因呈明显时间依赖性关系。PDGF-BB中和抗体显著抑制系膜细胞转染Megsin基因后细胞内3H-TdR的掺入，并下调稳定表达Megsin基因的大鼠系膜细胞TGF-β1 mRNA表达。结论 Megsin基因高表达在体外可促进系膜细胞PDGF-BB和TGF-β1的表达和分泌，进而促进系膜细胞增生和Ⅳ型胶原分泌。     

不同浓度的IL-1β和TGF-β1对大鼠肋软骨细胞的影响

目的:研究人白细胞介素-1β(IL-1β)和转化生长因子-β1(TGF-β1,)对体外培养的SD大鼠肋软骨细胞功能的影响.方法:采用免疫组织化学检测不同剂量IL-1β和TGF-β1作用48h后软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达水平.采用RT-PCR方法检测细胞Ⅱ型胶原、aggrccanase-1,2、aggreean的mRNA的表达水平.结果:IL-1β可以促进软骨细胞aggreeanase-1,2的表达,从而降低多聚蛋白聚糖的含量,破环细胞外基质结构,减少II型胶原的含量,使细胞呈现去分化的表现,对软骨细胞起负性生调节作用.低浓度的TGF-β1对软骨细胞起保护的作用;高浓度的TGF-β1(100ng/m1)在促进蛋白多糖表达的同时也促进软骨细胞蛋白多糖的降解,从而打破软骨的代谢平衡,起负性调节的作用.     

壳聚糖微球转染人IL-1Ra与TGF-β1基因治疗兔骨关节炎

目的 探讨壳聚糖微球转染人IL-1Ra与TGF-β1基因治疗兔膝关节早期骨关节炎的方法与效果.方法 制备分别包裹IL-1Ra质粒DNA和TGF-β1质粒DNA的壳聚糖微球缓释系统,分组向兔膝关节早期骨关节炎模型关节腔注射含IL-1Ra基因和(或)TGF-β1基因的壳聚糖微球、不含上述基因的壳聚糖溶液,定期处死,使用ELISA检测关节腔灌洗液的IL-1Ra、TGF-β1浓度,取关节标本Mankin评分、苏木精-伊红(HE)染色、番红O染色及免疫组化检测.结果 经过60 d观察,壳聚糖微球转染基因组的IL-1Ra与TGF-β1的基因可持续表达,双基因组的软骨标本从外观、染色观察,损伤程度轻于单基因组.双基因组的Mankin评分明显低于单基因组(P＜0.05),单基因组的Mankin评分明显低于空白组(P＜0.05).结论 关节腔注射壳聚糖微球转染IL-1Ra与TGF-β1基因能抑制软骨的退变和促进软骨的修复.

Abstract：

Objective To explore the method and effect of transinfection of rabbit early knee osteoarthritis models via chitosan microsphere with gene of recombined human IL-1Ra gene and TGF-β1 gene. Methods Chitosan microspheres with plasmids of IL-1Ra gene and TGF-β1 gene, and rabbit early knee osteoarthritis models were prepared. Rabbits in different groups had intra-articular injections of chitosan microsphere containing IL-1Ra gene and / or TGF-β1 gene, and chitosan solution as control group before being executed regularly and randomly. The joint specimens were evaluated by HE staining, lycopene red O staining and immunohistochemical analysis and Mankin's score. ELISA was used for detection of IL-IRa and TGF-β1 concentration of articular cavity fluid in each group. Results The control group was consistent with the pathological changes of early OA. In co-transinfection group, judging from the appearance and staining of cartilage,the OA damage of the specimens was less serious than other groups'. Its Mankin's score was significantly lower than single-gene transinfection group (P ＜ 0.05), and the latters Mankin's score were significantly lower than control group (P ＜ 0.05). Conclusion Intra-articular injection of chitosan microspheres containing both IL-1Ra gene and TGF-β1 gene could inhibit the degeneration of cartilage and promote cartilage repair.     

转化生长因子-β1对人软骨细胞基质金属蛋白酶-1mRNA及其阻滞剂mRNA表达的影响

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对人透明软骨细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及其阻滞剂T(IMP-1)mRNA表达的作用及相关意义,更好地理解骨关节炎软骨损伤的相关机制。方法TGF-β1作用于传代培养的人软骨细胞12h,浓度分别为1ng/mL、10ngm/L、100ng/mL;上述不同浓度TGF-β1与白介素-1β(IL-1β)10ng/mL组成联合作用组,继续培养12h。应用逆转录PCRR(TP-CR)方法及实时荧光定量方法(FQP-CR),检测TGF-β1及其与IL-1β联合作用于传代培养的人透明软骨细胞MMP-1、TIMP-1mRNA表达的含量。结果正常对照组透明软骨细胞可见MMP-1、TIMP-1mRNA扩增产物,而实验组TGF-β11ng/mL、10ng/mL、100ngm/L作用于透明软骨细胞12h后,MMP-1mRNA表达逐渐降低,TIMP-1mRNA表达逐渐增高;TGF-β1与IL-1β联合作用后,随着TGF-β1浓度的升高,MMP-1mRNA表达逐渐降低,TIMP-1mRNA表达逐渐增高,各组之间差异有显著性意义(P<0.05)。提示TGF-β1与MMP-1、TIMP-1mRNA表达之间存在剂量依赖关系。结论不同浓度TGF-β1按照剂量依赖方式抑制人软骨细胞MMP-1mRNA基因的表达,刺激人软骨细胞TIMP-1mRNA基因表达;TGF-β1具有对抗IL-1β对人软骨细胞MMP-1、TIMP-1mRNA表达的作用,也呈现剂量依赖关系。研究结果对揭示骨关节炎的发病机理,指导其治疗具有积极意义。     

大鼠肝星状细胞TGF-β3/TGF-β1mRNA比值与TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表达的关系

目的 探讨大鼠肝星状细胞(HSC-T6)中转化生长因子-β3(TGF-β3)和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA比值变化与TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表达的关系.方法 构建质粒pcDNA 3.1(+)-TGF-β3和pcDNA 3.1(+)-TGF-β1.将pcDNA 3.1(+)-TGF-1β1转染HSC-T6细胞株,经筛选建立高表达TGF-β1的HSC-T6细胞阳性克隆.pcDNA 3.1(+)-TGF-β3转染该阳性克隆,48 h后荧光定量PCR法和Western blot法分别检测TGF-β3、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1 mRNA和蛋白的变化.结果 空白组、对照组、阳性克隆组及TGF-β3干预组中,TGF-β3/TGF-β1mRNA比值分别为0.286±0.070、0.874±0.141、0.448±0.327和1.277±0.244;阳性克隆组与空白组和对照组相比,TGF-β1和TIMP-1的mRNA及蛋白表达明显增高(P<0.05),MMP-9的mRNA及蛋白表达明显减少(P<0.05);TGF-β3干预组与阳性克隆组相比,TGF-β1蛋白和TIMP-1 mRNA及蛋白表达明显下降(P<0.05),MMP-9 mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.05).结论 TGF-β3能下调TGF-β1蛋白表达;当TGF-β3/TGF-β1mRNA比值>1时,TGF-β1和TIMP-1表达减少,MMP-9表达增加;当TGF-β3/TGF-β1mRNA比值<1时,TGF-β1表达减少,TIMP-1和MMP-9表达无变化.     

转染转化生长因子β1基因减轻非协调性异种心脏移植急性血管性排斥反应

目的探讨移植物局部转染转化生长因子β1(TGF-β1)基因对非协调性异种心脏移植急性血管性排斥反应(AVR)的影响。方法建立豚鼠到SD大鼠的颈部心脏移植模型,移植前受鼠接受中华眼镜蛇毒因子和环孢素A预处理,供心切取后,经冠状动脉按每克心肌组织灌注5×1010PFU携带TGF-β1基因的重组腺病毒载体进行基因转染,再移植到经过预处理的SD大鼠颈部(基因转染组),另设灌注5×1010PFU腺病毒空白载体的空白载体组和对照组。术后观察各组移植物的存活情况、移植物组织学变化情况以及移植物中CD68和CD57的表达、细胞凋亡指数、TGF-β1的表达。结果基因转染组移植物的存活时间为(95±3)h,明显长于空白载体对照组的(57±2)h和对照组的(60±2)h(P<0.01);各组移植物均呈急性血管性排斥反应的病理改变,但基因转染组较轻;基因转染组移植物组织中炎症细胞浸润数、CD68和CD57的表达量及细胞凋亡指数明显低于空白载体对照组和对照组,并能检测到外源性TGF-β1的表达。结论经冠状动脉灌注重组腺病毒载体介导的TGF-β1基因转移可减轻非协调性异种心脏移植AVR,明显延长移植物的存活时间。     

转化生长因子-β1基因修饰对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响

目的观察骨髓间充质干细胞经转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor,TGF-β1)基因修饰后增殖能力和向软骨细胞分化能力的变化。方法利用脂质体将pcDNA3-TGF-β1基因导入骨髓间充质干细胞,通过大体形态观察、CCK-8测定转染前后骨髓间充质干细胞的增殖代谢能力,同时RT-PCR和Westernblot法检测软骨特异性细胞外基质蛋白Ⅱ型胶原的表达。结果基因修饰后骨髓间充质干细胞倍增能力明显增强,并且Ⅱ型胶原蛋白表达增加。结论经TGF-β1基因修饰的MSCs向软骨细胞分化能力增强,是优秀的软骨组织工程种子细胞。