结核分枝杆菌重组Bb-MPT64疫苗的构建、鉴定及表达

目的:构建和鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-MPT64疫苗.方法:以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到MPT64抗原编码基因序列,定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-MPT64;用电穿孔法将该质粒导入Bh及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-MPT64疫苗.用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达MPT64/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定.结果:PCR成功扩增出688bp的MPT64目的基因;双酶切证实MPT64目的基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-MPT64疫苗构建成功.免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-MPT64的表达产物在相对分子量(50ku)处有明显的蛋白表达条带,且能被活动性结核病人血清特异识别.结论:成功构建了结核分枝杆菌rBb-MPT64疫苗,为发展新型结核病疫苗奠定了基础.     

多房棘球绦虫重组质粒BCG-EmⅡ/3-10的构建及意义

目的:构建多房棘球绦虫重组质粒BCG-EmⅡ/3-10,探索泡球蚴病防治的新途径。方法:超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增EmⅡ/3-10抗原编码基因,将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG-EmⅡ/3-10,电穿孔法将该质粒导入BCG构建多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3-10。结果:经过PCR扩增鉴定、电泳证实获得的重组基因的大小和插入方向正确。结论:成功构建了多房棘球绦虫重组质粒BCG-EmⅡ/3-10,为进一步研究多房棘球绦虫重组疫苗奠定基础。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST的构建及其表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28a-Sj26GST,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET28a中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为36×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的26%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28d-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

狂犬病病毒糖蛋白在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的 表达狂犬病病毒糖蛋白(GP),用于狂犬病疫苗免疫抗体评估和狂犬病病毒糖蛋白功能的研究. 方法 采用分析软件,分析其可能的抗原表位,利用PCR方法 扩增狂犬病病毒SRV9疫苗株G蛋白抗原位点区域基因,PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后,插入大肠埃希菌表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a.将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的 蛋白,进行SDS-PAGE分析.表达蛋白进行电洗脱纯化和Western blot鉴定分析.结果 成功构建了pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a表达质粒,序列分析表明,插入片段大小分别为1314 bp和1275 bp.SDS-PAGE分析结果 证明,在大肠埃希菌系统中成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达的融合蛋白含有GST标签,大小分别约为74×103和73×103.Western blot鉴定结果 表明,表达产物有抗原特异性并能与狂犬病病毒抗血清反应.结论 利用大肠埃希菌表达系统成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达产物有良好的反应原性.     

铜绿假单胞菌OprH基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH,研究其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAO1标准株双链DNA为模板,通过PCR扩增OprH基因。经酶切后与载体pGEX-1λT进行连接,构建重组质粒pGEX-OprH,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 PCR扩增出660 bp的OprH编码基因;重组质粒经双酶切和PCR证实OprH基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE电泳发现表达产物相对分子质量约为47 000 Mr,与前期预测结果一致,大肠埃希菌BL21(DE3)表达蛋白为菌体量的22%;免疫印渍表明Pa抗原免疫的小鼠血清能特异识别47 000 Mr重组蛋白。结论铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH在E.coli BL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

铜绿假单胞菌重组Bb-pGEX-OprI疫苗的构建及其保护力的研究

目的 构建并鉴定含有铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, Pa）外膜蛋白I（OprI)基因与两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum, Bb）疫苗 （Bb-pGEX-OprI）,并研究该疫苗对小鼠Pa感染的保护作用。方法 PCR扩增OprI抗原编码基因并将其定向克隆至pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprI,将pGEX-OprI电穿孔转化Bb,构建Bb-pGEX-OprI疫苗,进行双酶切、PCR和测序鉴定后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分别分析并鉴定表达产物。21只小鼠随机分为3组,分别灌胃接种Bb-pGEX-OprI 疫苗、空载体疫苗（Bb-pGEX-1λT)和Bb。首次免疫后4周用PA01株攻击。攻击后2周处死小鼠取肺组织,计数肺组织的细菌菌落数。免疫前、首次免疫后4周和PA01株攻击后2周采小鼠静脉血,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE。结果 PCR成功扩增出194 bp的OprI抗原编码基因;双酶切、PCR和测序证实OprI基因成功克隆入pGEX-1λT中,并且pGEX-OprI成功转化Bb,构建为Bb-pGEX-OprI疫苗;SDS-PAGE显示Bb-pGEX-OprI 表达相对分子质量约32×103的OprI-谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白;Western blot证实融合蛋白能被Pa感染的鼠血清特异性识别。Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠肺组织的细菌菌落数低于Bb-pGEX-1λT组和Bb组（P<0.01）,Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠血清IgG、IgG2b、IgG3和IgE水平在首次免疫后4周和攻击后2周依次升高,相同时间点Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠血清抗体水平均高于Bb-pGEX-1λT和Bb组（P＜0.01或P<0.05）。结论 成功构建了重组疫苗Bb-pGEX-OprI,其在小鼠抗Pa感染过程中可产生有效的体液免疫应答。     

GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。更多还原     

结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌（（Bifidobacteria bifidum,Bb）-ESAT-6-MPT64疫苗。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增ESAT-6和MPT64单基因序列,然后采用基因拼接（gene SOEing）法构建融合基因ESAT-6-MPT64,定向克隆至穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;再电转化入Bb,构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗。结果 PCR成功扩增出1020bp的ESAT-6-MPT64融合基因;双酶切证实ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6-MPT64疫苗构建成功。结论成功构建了结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗,为进一步研究其免疫保护效果奠定了基础。     

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因在BCG中的表达

目的：研究多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因在BCG中的表达.方法：将重组质粒pBCG-Em14-3-3用电穿孔法导人BCG构建rBCG,将含有重组子的细菌培养至对数生长期,在收菌前3天每天45℃热诱导30min,然后对表达产物作SDS-PAGE及免疫印迹分析.结果：多房棘球绦虫pBCG-Em14-3-3在BCG中成功表达了Em14-3-3重组蛋白,在相对分子量为27KDa处可见明显的表达蛋白带,其表达量占菌体总蛋白量的11%.结论：多房棘球绦虫pBCG-Emi4-3-3能在BCG中高效表达,且能与鼠血清抗体发生特异结合,提示rBCG-Em14-3-3疫苗表达的Em14-3-3重组蛋白具有特异的抗原性.     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

猪带绦虫TSO45W-4B基因在长双歧杆菌中的表达

目的：在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法：将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B电转化入长双歧杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和Western blot分析表达情况。结果：酶切、聚合酶链反应（poly－merase chain reaction,PCR）和测序证实,重组质粒pGEX-TSO45W-4B成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量（Mr）约为40 kD,经谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase,GST）亲和层析后可获得纯度为85%以上的重组蛋白。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗TSO45W-4B血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论：猪带绦虫TSO45W-4B基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。     

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42 500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

幽门螺杆菌融合基因vacA-hpaA的克隆及在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达

目的 构建幽门螺杆菌融合基因vacA-hpaA的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒,并观察其在大肠杆菌(E.coli)和双歧杆菌(B.bifidium)中的表达情况.方法 通过PCR得到hpaA-vacA融合基因,将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-hpaA-vacA,电穿孔转化入大肠杆菌BL21和双歧杆菌.转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达的重组蛋白.结果 构建了重组质粒pGEX-vacA-hpaA,vacA-hpaA融合基因的分子量约为1548bp;经SDS-PAGE分析,在大肠杆菌中表达出85kD的融合蛋白,表达的蛋白约占细菌总蛋白的20.5％;在双岐杆菌中也能得到正确表达,但表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约8.5％.Western blotting结果确认了该条带为hpaA-vacA融合基因的产物.结论 构建的重组质粒pGEX-hpaA-vacA能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达.     

Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定

目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a( )表达载体上,鉴定并转化至Rosetta(DE3)plys表达宿主菌中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果构建了lukS-PV-pGEM-T和lukS-PV-pET28a( )重组质粒,经PCR扩增和限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切均得到939bp的目的片段,基因测序与GENEBANK中的PVL的序列一致,宿主菌表达带HIS标签的重组LukS-PV蛋白。结论成功克隆lukS-PV基因和构建重组表达质粒,并在宿主菌中成功表达重组LukS-PV蛋白,为PVL免疫学检测方法的建立奠定基础。     

日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及亚单位疫苗的构建和分析

目的 构建日本血吸虫大陆株Sj-Rho GTPase-like真核及原核表达重组质粒，并进行鉴定分析。方法 用PCR法将Sj-Rho GTPase-like基因从已剪切阳性克隆中扩增出来，亚克隆至pcDNA3.1和pGEX-5X-3中，分别经PCR、双酶切、测序、SDS-PAGE和Western blot等方法鉴定。结果 PCR和测序均证明Sj-Rho GTPase-like基因疫苗构建成功，重组蛋白经SDS-PAGE电泳可观察到与预期分子量相应的条带，转印后可被水牛感染血清识别。结论 成功构建了Sj-Rho GTPase-like基因的两种重组载体，为保护性免疫研究打下基础。     

人类生精相关基因TSARG6的原核表达和抗体制备

目的 构建人类生精相关基因pGEX-KG/TSARG6原核表达载体,原核表达、制备并鉴定多克隆抗体.方法 以人类睾丸cDNA文库为模板,用PCR方法扩增得到TSARG6基因开放阅读框(ORF)全长序列,插入原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入E.coli JM109细菌,IPTG 诱导表达GST/TSARG6融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blot鉴定融合蛋白,免疫家兔,制备抗TSARG6 多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 经测序验证,我们成功构建了pGEX-KG/TSARG6 重组质粒;转化重组质粒的E.coli JM109细菌经 IPTG 37℃诱导3 h后高效表达GST/TSARG6融合蛋白;Western blot 实验结果显示制备的多克隆抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了TSARG6基因的原核表达和多克隆抗体制备,为TSARG6的后续功能研究提供了有力的工具.     

双歧杆菌表达肠致病性大肠埃希菌EspA蛋白的体外研究

目的构建肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)EspA蛋白双歧杆菌表达重组菌株,并验证蛋白表达。方法采用常规PCR扩增EspA片段,体外构建重组质粒pBAD-EspA,转化大肠杆菌BL21感受态细胞培养,挑取单克隆提取质粒,双酶切和PCR对重组质粒鉴定。pBAD-EspA电转化长双歧杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆并PCR鉴定,经木聚糖诱导表达,蛋白质印迹试验(Western blot)分析验证EspA蛋白在双歧杆菌中的表达。结果经酶切后琼脂糖凝胶电泳及测序结果证明pBAD-EspA重组质粒构建成功。pBAD-EspA重组质粒转化双歧杆菌后经阿拉伯糖诱导,在诱导表达不同时间点菌液沉淀均有良好的蛋白表达。结论体外成功构建表达EPEC EspA蛋白的长双歧杆菌,为制备ESPA口服疫苗提供科学依据。     

人源MAP3K7克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

 目的构建MAP3K7 蛋白GST 的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7 融合蛋白,为GST Pulldown 实验做准
备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-
5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21 宿主菌中,IPTG 诱导表达融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达
产物,SDS-PAGE 和Western blot 分析鉴定。结果经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,诱导后的
GST 融合蛋白经SDS-PAGE 和Western blot 检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论
成功构建了MAP3K7全长的GST 重组表达载体,确定了GST-MAP3K7 融合蛋白表达的最佳条件,诱导成功并得到了高纯度的
融合蛋白,为进一步研究MAP3K7 蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪带绦虫TSOL18基因在长双歧杆菌中的表达

目的在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSOL18的基础上,研究猪带绦虫TSOL18基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSOL18电转化入长双歧杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达情况。结果酶切、PCR和测序证实,重组质粒pGEX-TSOL18成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,目的蛋白相对分子质量（Mr）约为41KD,与预期结果相一致。Western blot显示,目的蛋白能被兔抗血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论猪带绦虫TSOL18基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的目的蛋白具有抗原性。