VEGF与肿瘤的相关性及其对间充质干细胞分化为血管内皮细胞诱导作用的研究

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤患者的表达水平及与愈后的相关性，并探讨VEGF对间充质干细胞（MSCs）分化为血管内皮细胞的诱导作用。方法用ELISA法检测初发及愈后出院的肿瘤患者血清VEGF含量；分离骨髓单个核细胞，经贴壁法获取MSCs，体外经高浓度VEGF诱导分化，通过流式分析表面分子CD34、CD31和vWF以及体外成血管实验对分化细胞进行鉴定。结果初发患者与正常对照相比高水平表达VEGF（P〈0．01），而愈后明显降低（P〈0．01）。MSCs经VEGF诱导后呈现“纤维细胞”样长梭形，内皮系表面分子CD34、CD31、vWF均有不同程度表达，在半固体培养基中可形成“血管管腔样”结构。结论VEGF与肿瘤的发生及其愈后有明显的相关性；在体外培养条件下可诱导MSCs分化为血管内皮细胞。     

人脐血CD133^＋和CD133^-细胞分化为内皮细胞的实验研究

目的：从人脐血中分离鉴定、培养和诱导分化人脐血CD133^+细胞和CD133^+细胞，建立一种能够方便获得高纯度人脐血CD133细胞的方法，同时在体外诱导该细胞向内皮细胞分化，进一步明确CD133^+细胞与CD133^-细胞之间的关系。方法：从新鲜脐血中纯化的CD133^+和CD133^-接种于添加了干细胞因子(stem cell factor，SCF)，IL-3，IL-6的Sigma无血清培养液中，检测CD133^+细胞抗原标志，观察梭形贴壁细胞的出现时间和特异性细胞标志。结果：免疫磁珠法分离的CD133^+细胞数为(6．08—6．80)&;#215;105，CD133^+细胞的纯度(96．18&;#177;1．83)％。CD133^-细胞(0．02&;#177;0．01)％。培养3—5d可观察到梭形贴壁细胞，15d左右可形成索条状结构，贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志血管内皮钙黏蛋白，血浆血管性假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)，UEA-1和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor eceptor-2，VEGFR-2)。结论：采用先用密度梯度离心法离心后再用免疫磁珠分选的方法来分离CD133^+细胞和CD133^-细胞，分离到的细胞纯度高，在一定的条件下，可分化为内皮样细胞。     

免疫磁珠法分选骨髓CD34^＋细胞：纯度影响因素的分析

背景：免疫磁珠分选技术已成为分选CD34^＋细胞的主要方法之一,在长期实验中发现诸多因素影响其分离纯度,包括磁珠与细胞孵育时干冰与碎冰的使用、磁珠与细胞孵育及分离时摇床的摇摆方向、红细胞裂解液裂解单个核细胞的使用等。目的：在免疫磁珠分选CD34^＋细胞过程中分别对上述影响因素进行分析改进,以提高分选CD34^＋细胞的纯度。设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-07/2009-03在太原市中心医院皮肤科实验室完成。材料：骨髓象筛选正常的人骨髓29份,由太原市中心医院血液科提供,取材均经患者同意。CD34^＋免疫磁珠为Dynal公司产品。方法：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离培养人骨髓单个核细胞,用免疫磁珠法分选骨髓CD34^＋细胞,对其分选过程中的主要环节如冰块与碎冰、摇床的种类以及红细胞裂解液的使用进行方法改进。方法1：按试剂盒提供方法进行磁珠常规分选CD34^＋细胞。方法2：在方法1基础上,用碎冰替代冰块进行磁珠与单个核细胞孵育。方法3：在方法2基础上,用万向摇床替代水平摇床。方法4：在方法3基础上,向单个核细胞中预先加入红细胞裂解液裂解残留红细胞。主要观察指标：通过流式细胞仪检测不同方法分选出的CD34^＋细胞纯度。结果：随着不同环节的逐渐改进,CD34^＋细胞纯度由（32.7±6.6）%升至（84.5±5.2）%,方法1,2,3,4所分选出的CD34^＋细胞纯度逐渐升高,组间方差分析差异显著（F=76.209,P〈0.01）,Bonferroni法两两比较差异亦有非常显著性意义（P〈0.01）。结论：碎冰、万向摇床及红细胞裂解液的使用能有效提高免疫磁珠法分选人骨髓CD34^＋细胞的纯度。     

应用免疫磁珠分离成人骨髓中STRO-1阳性细胞

目的：利用免疫磁珠分离成人骨髓中STRO-1^＋阳性细胞，获得同质性骨髓基质干细胞。 方法：实验于2004-06／2005-06在东南大学修复重建外科研究所实验室完成。采集正常自愿献髓者骨髓，淋巴细胞分离液体离心纯化分离后利用免疫磁珠分离出STRO-1^＋细胞，研究其生长曲线、体外扩增能力、集落形成能力、细胞表型、细胞周期、成骨能力。 结果：①利用免疫磁珠可从成人骨髓中获取STRO-1^＋细胞。经体外培养发现STRO-1^＋细胞贴壁生长，相差显微镜下STRO-1^＋细胞呈成纤维细胞梭形外观。②生长曲线可分为细胞生长延滞期、对数生长期及稳定期，细胞倍增时间为57h。③STRO-1^＋细胞可以在体外扩增12周左右，形成的成纤维细胞集落数、处于细胞分裂期的细胞数、扩增倍数均低于传统分离方法得到的骨髓基质干细胞。④经流式细胞仪检测，STRO-1^＋细胞稳定地表达CD29，CD44，CD105，不表达造血细胞系的表面标记CD14，CD34，CD45，HLA-DR。⑤经成骨培养发现STRO-1^＋的骨髓基质干细胞具有很强的成骨分化能力。 结论：利用免疫磁珠能够从成人骨髓中快速分离、纯化骨髓基质干细胞，且具有高效、灵敏、对骨髓基质干细胞活性影响小的优点。     

人脐血中CD133^＋血管内皮祖细胞的分离培养和生物学特性

目的:观察免疫磁珠法分离得到的CD133 血管内皮祖细胞的细胞表面标记及生物学特性。方法:实验于2002-11/2003-08在解放军第四军医大学西京医院烧伤外科实验室完成。①选取正常顺产或剖腹产人胎盘(解放军第四军医大学西京医院妇产科提供,产妇均知情同意)作为CD133 血管内皮祖细胞的标本来源。②人胎盘脐血ACD-B抗凝,稀释后取7mL脐血缓慢加入淋巴细胞分离液3mL,2100r/min离心30min,取棕黄色层低密度单个核细胞,洗涤去血小板。免疫磁珠与FITC-CD133单抗室温孵育30min,洗去多余单抗,将包被FITC-CD133的免疫磁珠加入到单个核细胞中,室温孵育30min,置于磁场中1min,吸弃细胞悬液,加入磁珠-细胞分离液从免疫磁珠上释放出CD133 血管内皮祖细胞。加入EGM-2MV培养基,接种于包被I型胶原的培养瓶中,24h换液除去未贴壁细胞,3d后半量换液,培养3～4周。③观察CD133 血管内皮细胞经免疫磁珠分离后的形态变化;采用流式细胞仪分析CD133 血管内皮祖细胞在脐血单个核细胞的比例及免疫磁珠的分离效率;免疫荧光及酶组织化学检测CD133 血管内皮祖细胞体外培养不同时期的表形变化;透射电镜观察成熟血管内皮细胞W-P小体的形成情况。结果:①CD133 血管内皮祖细胞体外培养形态观察:贴壁小细胞团在4～5d可见伪足伸出,7d后呈克隆状迅速生长,2～3周后密集区细胞呈“鹅卵石”样,培养4周融合后的细胞呈梭形。②CD133 血管内皮祖细胞分离率检测结果:CD133 血管内皮祖细胞在脐血单个核细胞中的比例为0.91%,经免疫磁珠分离后比例为85.52%。③CD133 血管内皮祖细胞体外培养不同时期的免疫表形变化:培养第5天极少数细胞CD133染色阳性,大部分细胞CD34及vWF染色阳性;第10天所有细胞CD133染色均呈阴性,大部分细胞CD34、vWF染色呈阳性。④成熟血管内皮细胞W-P小体的形成情况:透射电镜下培养第10天可见成熟血管内皮细胞所特有的W-P小体。结论:采用免疫磁珠法可以有效地从人脐血中分离纯化CD133 血管内皮祖细胞,不同培养时期通过CD133,CD34,vWF单抗以及透射电镜进行鉴定,证明其具有分化为成熟血管内皮细胞的能力。     

人参二醇促骨髓CD34+细胞增殖和分化的研究

本研究探讨人参二醇（PDS）对正常人骨髓CD34^＋细胞的促进增殖和诱导分化作用。用吸附单克隆抗体的免疫磁珠技术从正常人骨髓分离出CD34^＋细胞,采用琼脂半固体多向祖细胞集落（CFU-Mix）培养方法观察PDS对CD34^＋细胞的增殖作用;用液体培养使CD34^＋细胞增殖,并向红系、粒系定向生长,用流式细胞仪分析PDS诱导后细胞表面标记变化。结果显示：免疫磁珠分离CD34^＋细胞的获得率占骨髓有核细胞（MNC）的（1.0±0.15）%;活细胞比例占（95.6±1.2）%,CD34^＋细胞富集度达（86.8±2.8）%。中浓度PDS（25mg/L）能够有效地促进CD34^＋细胞增殖,生成CFU-Mix集落,提高率为（56.3±3.5）%,与对照相比较有显著差异（p〈0.01）。液体培养生成粒系、红系细胞的数量明显增高,与对照相比差异有显著性,提高率分别为（35.6±3.2）%和（22.3±2.1）%,与对照相比差异有显著性（p〈0.01）,且呈剂量依赖性。经PDS诱导14天后,细胞表面分化标记明显增高,CD33^＋细胞在PDS50mg/L时最高,CD71^＋细胞在25mg/L时最高,G-A^＋细胞在10mg/L时最高,而CD15^＋细胞数量无明显变化。结论：PDS不但促进CD34^＋细胞增殖,且能诱导其定向分化,提示PDS具有类似造血生长因子和协同生长因子的效应。     

人骨髓CD34＋干细胞分离培养及血管内皮生长因子165诱导分化的作用

背景:有研究证实,骨髓中CD34+干细胞在一定条件下具有向内皮细胞分化的潜能.目的:体外分离、纯化、培养和扩增人CD34+造血干细胞,并检测其免疫学表型,观察血管内皮生长因子对其体外诱导分化后细胞免疫表型的变化.设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成.材料:骨髓来源于健康供者.方法:利用Percoll梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离培养、扩增人骨髓CD34+干细胞.采用脂质体介导转染法,选生长良好的传代细胞,以血管内皮生长因子165基因转染人骨髓CD34+干细胞.主要观察指标:采用免疫荧光和流式细胞术检测人骨髓CD34+干细胞免疫学表型.经血管内皮生长因子165基因转染后,人骨髓CD34+干细胞的表型变化以及血管内皮生长因子的分泌情况.结果:体外分离培养出高度同源性的人骨髓CD34+干细胞,细胞形态呈成纤维细胞样.CD44、CD29和c-kit阳性,CD31和CD54阴性;经血管内皮生长因子165诱导后,人骨髓CD34+干细胞表面标志CD44表达降低,CD31升高,呈现典型的内皮细胞表型,并且获得大量分泌血管内皮生长因子的能力.结论:采用Percoll分离液梯度离心继以贴壁筛选法及单克隆培养法联合筛选分离,可培养扩增}H高度同源的CD34+干细胞,经血管内皮生长因子基因转染后,CD34+干细胞呈典型的内皮细胞表型,验证了其具有向内皮细胞分化的潜能.     

间充质干细胞分化的内皮细胞有免疫调控作用

为了探讨间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）诱导而来的内皮细胞的免疫调控能力，将人骨髓MSC在体外经VEGF诱导分化为内皮细胞，并用倒置相差显微镜和流式细胞术分别观察和检测细胞的形态和免疫表型，用淋巴细胞转化实验观察其免疫调控能力。结果表明：MSC在向内皮细胞分化的体系中生长迅速，诱导后的细胞经von Willebrand factor（vWF）免疫荧光染色呈阳性，能在Matrigel上形成毛细血管样网状结构。细胞表面标记无明显改变，即CD73、CD105、HLA—ABC仍阳性，CD34、CD80、CD86、HLA—DR、CD31仍为阴性。由MSC诱导分化而来的内皮细胞能抑制T淋巴细胞的增殖，其抑制作用随内皮细胞加入量的增多而增强。结论：由骨髓MSC来源的内皮细胞对T淋巴细胞具有调控作用。     

体外诱导羊膜来源间充质干细胞分化为血管内皮细胞

背景：羊膜来源间充质干细胞植入机体不同类型组织后是否可以分化为相应组织靶细胞呢？目的：检测血管内皮细胞生长因子在体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。方法：分离培养羊膜间充质干细胞,鉴定其表面抗原表达,用含体积分数2%胎牛血清以及50μg/L血管内皮生长因子的条件培养基诱导,诱导后细胞通过内皮细胞标志物血管内皮生长因子受体2以及v-WF染色鉴定。结果与结论：羊膜间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变,内皮细胞标志物血管内皮细胞生长因子受体2以及v-WF染色结果阳性。提示羊膜间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力。     

Bcr/Abl融合基因阳性、Flk1+CD34-慢性粒细胞性白血病干细胞的分离纯化及其生物学特性的研究

目的分离慢性粒细胞白血病(ChronicMyelogenousLeukemia,CML)患者骨髓中表达BCR/ABL肿瘤基因的细胞亚群,并研究其生物学特性。方法淋巴细胞分离液分离CML患者骨髓单个核细胞,免疫磁珠分选CD45-、GlyA-及CD34-细胞,极限稀释法获得单克隆细胞,流式细胞术鉴定其免疫表型,体外定向诱导分化检测其干细胞特性,并检测其Bcr/Abl融合基因的表达情况。结果CML患者骨髓源单克隆扩增细胞不表达造血细胞和内皮细胞的特征性表型,但Bcr/Abl融合基因阳性;诱导后的细胞能同时向造血细胞及血管内皮细胞分化。结论Bcr/Abl融合基因的产生至少发生在比造血干细胞更为早期的血液血管干细胞水平上,即CML至少起源于血液血管干细胞。     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

血液循环中存在内皮细胞的前体细胞

为证明出生后血液循环中存在内皮细胞的前体细胞,从G-CSF动员的成人外周血及脐带血中分离CD34+细胞,将之接种于纤连蛋白与明胶铺板的培养皿上,培养体系中加入重组人内皮细胞生长因子(rhVEGF)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF).用von Willibrand因子(vWF)表达及Ⅰ型凝集素(UEA-I)结合能力鉴定内皮细胞.结果表明,上述体系经5-6周培养后,接种CD34+细胞的皿出现一层致密的贴壁细胞,而接种CD34-细胞的皿则未形成贴壁层.免疫细胞化学和流式细胞术的结果显示,几乎所有贴壁细胞为vWF阳性,且约90%的细胞具有UEA-I结合能力.实验结果证明人出生后阶段血循环中存在有成血管细胞(angioblast),因此在成人中也可发生血管系形成过程.     

CD271及CD133用于阳性分选富集骨髓间充质干细胞的比较

本研究旨在通过对CD271（低亲和性神经生长因子受体，low affinity nerve growth factor receptor，LNG—FR）及CD133免疫磁珠阳性分选富集骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的比较，选出一种相对理想的从骨髓中富集间充质干细胞的免疫磁珠分选方法。采用免疫磁珠的方法得到骨髓单个核细胞中的CD271^＋细胞及CD133^＋细胞；将得到的细胞分别进行培养，14天后计数成纤维细胞集落形成单位（colony forming unit—fibro—blast，CFU—F）；对每个传代细胞进行计数，绘制细胞增殖曲线；取两种方法得到的细胞培养至3代以后，流式细胞术检测细胞表面抗原，通过细胞形态及免疫化学染色鉴定比较成骨及成脂肪定向诱导分化。结果表明：CD271阳性分选纯度为（89．50±0．98）％，CD133阳性分选纯度为（88．03±3．06）％；1×10^4个CD271^＋细胞培养后产生的CFU—F数目是1×10^4个CD133^＋细胞培养后形成CFU—F数目的2倍，CD271^-细胞培养后无CFU—F形成，而CD133^-细胞培养后可形成少量的CFU—F；两种方法得到的细胞培养至第3代后表型基本一致，即CD34^-、CD14^-、CD45^-、CD90^＋、CD29^＋、CD44^＋、CD105^＋、CD73^＋；CD271^＋细胞的增殖能力比CD133^＋细胞的高出3倍，而且具有更强的成骨、成脂肪分化潜能。结论：虽然CD271及CD133阳性分选都可以得到间充质干细胞，但相比之下，CD271阳性分选得到的间充质干细胞有更强的增殖和分化能力，因而CD271阳性分选是一种相对理想的从骨髓中富集阃充质干细胞的免疫磁珠分选方法。     

大鼠骨髓和外周血早晚期内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：旨在从大鼠外周血及骨髓中提取内皮祖细胞,培养晚期内皮祖细胞,为干细胞移植治疗或通过内皮祖细胞联合基因治疗使内皮祖细胞高表达血管新生诱导因子,达到促进缺血性脑血管病血管新生的目的。目的：从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞并对其进行鉴定。方法：使用密度梯度离心及贴壁筛选法从大鼠骨髓和外周血中分离获得单个核细胞,进行诱导培养,观察并记录贴壁细胞的生物学特征;选取内皮祖细胞特异性表面标志CDl33、CD34、KDR对原代细胞进行免疫荧光检测,利用流式细胞学技术检测KDR、CD34表达,并通过吞噬功能实验进～步鉴定培养细胞。结果与结论：大鼠骨髓和外周血能够分离获得早晚期内皮祖细胞;贴壁细胞免疫荧光检测CD34、CDl33、KDR表达阳性;流式细胞学检测CD34、KDR表达阳性;贴壁细胞能够吞噬ac—LDL,结合UEA-1。实验成功从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞;并获得了增殖活性强的晚期内皮祖细胞,找到了更好的成血管干细胞的种子来源。     

胎儿和成人骨髓间充质千细胞体外造血支持能力的比较

胎儿出生以后,造血干细胞(HSC)才从胎儿的肝脏和脾脏转移到骨髓,这一过程可能由不同的造血微环境中的信号分子所介导.间充质干细胞(MSC)是骨髓微环境中间质细胞如成骨细胞、内皮细胞的前体祖细胞.研究者推测,胎儿出生前的骨髓可能并不特别适合HSC生长.然而,该假说尚缺乏直接的证据支持.本研究通过对胎儿和成人骨髓MSC的造血支持能力进行比较,拟为此提供证据.成人骨髓MSC来源于3位健康供者,胎儿骨髓MSC来源于孕19-20周流产的胎儿.MSC辐照后与CD34+一起进行长期培养启动细胞分析,计数克隆形成细胞的数童,流式分析培养后CD34+的表型变化.RT-PCR分析两种MSC中细胞因子的表达.结果显示,成人骨髓MSC比胎儿骨髓MSC具有更强的造血支持能力,两者都促进CD34+向髓系细胞分化,两者之间细胞因子的表达存在差异.结论:与胎儿骨髓MSC相比,成人骨髓MSC在某些治疗,尤其是促进造血恢复方面具有更广泛的应用前景.     

小径聚氨酯人工血管内皮化种子细胞的体外诱导分化及种植实验

背景:目前,小径人工血管移植后由于缺乏内皮细胞衬里和抗血栓特性,长期通畅率低。有研究尝试用成熟内皮细胞种植人工血管以增强其抗血栓能力,以提高长期通畅率,但由于种子细胞和支架材料存在的缺陷,其效果并不令人满意。因此,临床上亟需寻找合适的种子细胞及血管支架材料,改善小径人工血管移植长期通畅率低这一现状。目的:探讨体外诱导骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞的可行性,并种植聚氨酯小径人工血管表面,为小径聚氨酯人工血管内皮化提供合适的种子细胞。设计:观察性实验。单位:中山大学附属第一医院心血管医学部,免疫学教研室。材料:实验于2004-09/2005-05在中山大学附属第一医院完成。健康志愿者成人骨髓(n=7)约10mL。方法:收集健康成人骨髓单个核细胞,置于纤维连接蛋白预衬的DMEM培养基中,用血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子加以诱导,通过荧光显微镜和免疫组化分析等方法观察和鉴定诱导后的细胞。将诱导分化的内皮祖细胞种植到聚氨酯小径人工血管表面,用扫描电镜观察。主要观察指标:①细胞形态学变化。②免疫组化VWF和CD34抗体染色结果。③聚氨酯小径人工血管表面内皮祖细胞的黏附生长状态。结果:①在血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等诱导因子存在的条件下,骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞,倒置荧光显微镜下呈典形的“纺锤样”梭形细胞,单层细胞贴壁生长融合时呈铺路石样排列。②免疫组化示VWF和CD34抗体染色阳性。②扫描电镜下,未种植细胞的聚氨酯小径人工血管表面呈典型的多孔蜂窝状结构,孔径大小比较适合内皮祖细胞爬行。种植细胞后,聚氨酯小径人工血管表面有大量的内皮祖细胞黏附、爬行及铺展生长,有时可见内皮祖细胞长入蜂窝状孔径内。结论:在体外能将骨髓单个核细胞诱导分化成为内皮祖细胞,而诱导分化的内皮祖细胞在小径聚氨酯人工血管上黏附生长状态良好,提示体外诱导骨髓单个核细胞分化为内皮祖细胞可作为小径聚氨酯人工血管内皮化的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景：骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。目的：体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。方法：分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周：单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10μg/L转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约 60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约 70%的细胞呈阳性,RT-PCR 显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和 CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。     

小鼠骨髓内皮细胞系的长期传代培养和生物学特性鉴定

小鼠骨髓内皮细胞系建立、保存和传代培养已10年之久。本研究的目的是对该内皮细胞系的生物学特性进行新的鉴定，以便利用该内皮细胞系进行进一步研究。取经传代培养的该内皮细胞系细胞，进行显微光镜和电子显微镜观察、分子标志检测、吞噬实验、生长动力学分析以及核型鉴定等。结果表明：细胞在亚汇合贴壁层中多为椭圆形、圆形或梭形，部分可呈条索状排列，在汇合层中一般为鹅卵石状。CD3l、vWF抗体染色阳性细胞占94％以上，摄取DiI—Ac—LDL的细胞达98．5％。在常规培养条件下，快速增殖期的细胞群体倍增时间约为54．6小时，分裂指数最高达到38％。。集落产率介于4．33％-7．40％。核型主要为超二倍体。结论：该细胞系保持了内皮细胞的基本特征，生长动力学和一些生物学行为与建系之初稍有差异。     

血管内皮生长因子对人骨髓和脐带间充质干细胞中内皮细胞组分的影响

本研究旨在比较人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)和脐带间充质干细胞(UC-MSC)中的内皮细胞(EC)比例,并探讨血管内皮生长因子(VEGF)对MSC中EC比例的影响。利用流式细胞术检测EC标志CD34+CD133+和vWF+CD31+双阳性细胞的比例,用瑞氏染色观察经VEGF作用的MSC细胞形态变化,免疫荧光技术观察CD34、CD133、CD31、VWF的表达,最后采用实时荧光定量PCR检测VEGF对EC标志性基因表达的影响。结果表明:BM-MSC和UC-MSC中存在少量EC及内皮祖细胞(EPC),经VEGF 10 ng/ml作用24 h后,MSC的长宽比变大,EC比例上升而EPC比例下降,EC相关标志基因Tie-2和ecNOS等的表达均上调,其中UC-MSC对VEGF的反应更明显。结论:BM-MSC和UC-MSC中存在少量的EC及EPC,VEGF可以提高EC的比例和细胞功能。     

骨髓内皮细胞条件培养液促进小鼠胚胎干细胞向造血分化

为观察骨髓内皮细胞条件培养液(BECM)和(或)细胞因子(VEGF SCF EPO)对小鼠胚胎干细胞(ESC-D3细胞)生成造血干／祖细胞的促进作用，先将ESC-D3细胞形成4天胚状体(Day 4 embryoid body,4dEB)，再诱导4dEBs生成造血干／祖细胞。实验分4组，第1，2和3组分别为BECM VEGF SCF EPO，BECM和VEGF SCF EPO组，第4组为自发分化对照组。检测各组造血干／祖细胞特异抗原、造血转录因子表达以及造血集落的形成。结果显示，BBCM和(或)细胞因子诱导生成的细胞均表达造血干／祖细胞抗原(c-kit,Sca-1,Thy-1和CD34)和造血转录因子(c—myb，SCL和β-H1)基因mRNA，培养后可产生HPP-CFC和BFU-E。从诱导ESC-D3细胞生成造血干／祖细胞的数量和生成的集落总数看，BBCM联合细胞因子组诱导效率均显高于单用组和对照组。结论：骨髓内皮细胞条件培养液能显促进胚胎干细胞早期造血分化，且骨髓内皮细胞条件培养液与细胞因子联合时效果更强。