SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的探讨SARS冠状病毒的刺突(spike，S)蛋白的免疫学特性，以及S蛋白作为SARS—CoV病毒疫苗组分的可行性。方法将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET—15b，并在大肠杆菌中表达，经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rSa和rSb；将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB，得到重组DNA疫苗pSecS，免疫小鼠，得到SAS—CoV S蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rSa和rSb建立的SARS—CoV S抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果分段的重组蛋白rSa和rSb在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达，并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应，原核表达的重组分段S蛋白具有SARS—CoV S蛋白相似的抗原性。结论原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS—CoV检测中；所构建的SARS—CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体，这为进一步SARS DNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 探讨SARS冠状病毒的刺突(spike,S)蛋白的免疫学特性,以及S蛋白作为SARS-CoV病毒疫苗组分的可行性。方法 将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET-15b,并在大肠杆菌中表达,经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rS_a和rS_b;将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB,得到重组DNA疫苗pSecS,免疫小鼠,得到SAS-CoVS蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rS_a和rS_b建立的SARS-CoVS抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果 分段的重组蛋白rS_a和rS_b在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应,原核表达的重组分段S蛋白具有SARS-CoVS蛋白相似的抗原性。结论 原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS-CoV检测中;所构建的SARS-CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,这为进一步SARSDNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus，SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗，将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体，随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫，定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体，随着时间的延续，抗体水平逐步升高，而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

SARS病毒N蛋白真核表达质粒构建及诱导的体液免疫

目的构建SARS病毒核衣壳蛋白（N）的真核表达质粒，并研究其在小鼠体内诱导的体液免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS病毒N蛋白基因片段，定向克隆入真核表达栽体pVAC，构建pVAC-N重组质粒；大量制备该重组质粒，经基因枪腹部皮内注射免疫BALB／c小鼠三次，间接ELISA法测定免疫鼠IgG抗体效价。结果成功构建了重组表达质粒pVAC-N，免疫小鼠后可诱导产生出特异性的IgG抗体。结论构建的真核表达质粒pVAC-N能诱导小鼠产生特异性抗体，为SARS疫苗的进一步研究打下基础。     

以HBc颗粒为呈现载体的真核表达载体pcDNA3.1-HBcNhel的构建

目的构建含乙肝核心C基因的真核表达载体pcDNA3.1-HBcNhel,探索其作为DNA疫苗载体的可能性.方法采用分子克隆技术在原核表达质粒pTrc-core的HBcAg el-loop处添加NheI酶切位点,双酶切此重组载体pTrc-coreNhel及真核表达载体pcDNA3.1,产物经纯化、T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,筛选抗Amp+克隆并提取质粒进行酶切及PCR鉴定.结果成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-HBcNhel.结论该重组质粒可作为治疗性及预防性疫苗的候选载体,为深入研究预防性及治疗性疫苗奠定了基础.     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

结核分枝杆菌GroEL基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的克隆结核分枝杆菌基因组携带的两组GroEL基因,即GroEL1和GroEL2,它们分别编码热休克蛋白HSP60（cpn60.1）和HSP65（cpn60.2）,并构建真核表达质粒。方法用带有EcoR I和Xba I酶切位点的特异性引物,从结核杆菌H37Rv株中PCR扩增两组GroEL基因,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-GroEL1和pCDNA3.1-GroEL2,并进行酶切和测序鉴定。结果成功克隆了结核分枝杆菌两组GroEL基因,酶切鉴定pCDNA3.1-GroEL1和pCDNA3.1-GroEL2构建成功,经DNA测序证实,载体上插入的序列与GenBank公布的序列一致。结论获得了结核分枝杆菌GroEL1和GroEL2基因,成功地构建了含GroEL1和GroEL2基因的真核表达质粒,为研究其作为核酸疫苗在免疫学方面作用提供材料。     

钩端螺旋体Lipl21基因真核质粒构建及在HeLa细胞的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白Lipl21基因片段的真核表达重组质粒,利用脂质体体外转染HeLa细胞,探讨其在体外真核细胞中的表达情况,为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据. 方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增Lipl21基因,纯化回收后克隆入pUCM-T载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,运用脂质体2000将重组体pcDNA3.1（＋）/LipL21转染入HeLa细胞,免疫组化法观察目的基因的表达. 结果双酶切及测序鉴定证明成功构建LipL21真核表达重组体pcDNA3.1（＋）/LipL21,DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段,读码框架正确,无碱基错配及移码突变.重组质粒pcDNA3.1（＋）/LipL21在体外HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21. 结论成功构建了钩端螺旋体Lipl21基因真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/Lipl21,且能够在体外真核细胞中表达,为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础.     

SARS病毒M蛋白编码基因真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的:构建SARS冠状病毒M蛋白N端编码基因1~129bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况。方法:用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-M上扩增出M编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-M。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组M蛋白片段表达。结果:酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组质粒的构建完全正确。对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为10000处有重组蛋白的表达。结论:SARS冠状病毒M蛋白N端1~43aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

婴儿利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧基酶优势表位基因的分子克隆与表达

目的 基于前期分析并选取的婴儿利什曼原虫PEPCK的优势表位基因,构建相应重组原核表达载体以获得重组蛋白,构建相应重组真核表达载体并验证真核载体在NIH3T3细胞中的表达,为后续动物的免疫和感染实验备下基础。方法 根据PEPCK优势表位基因序列,经PCR反应及酶切连接构建重组原核与真核表达质粒pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK并分别转染至E. coli和NIH3T3细胞中进行表达。采用SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定原核重组质粒在大肠杆菌中的表达和原核表达蛋白被镍柱纯化后的情况,采用免疫荧光实验验证真核重组质粒在细胞中的表达。结果 重组原核与真核载体的正确测序结果表明重组载体构建成功。SDS-PAGE电泳和Western Blot的结果显示,大肠杆菌中表达的原核重组蛋白以及纯化后的蛋白在48.08 kD处存在条带,转染了真核重组载体的NIH3T3细胞的免疫荧光结果呈阳性。结论 成功构建了PEPCK优势表位基因的重组原核和真核表达载体:pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK,成功表达相应的重组蛋白并纯化并验证了pVAX1-EPEPCK在NIH3T3细胞中的表达,为后续DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强免疫的动物实验备下基础。     

Nogo-66受体LRR功能区的真核分泌表达

目的: 构建含有人Nogo-66受体LRR功能区段cDNA序列的真核分泌型表达载体,并在COS-7细胞中表达. 方法: 采用定向克隆的策略,在保证阅读框正确的前提下,从原核表达载体pES-His/LRR上切下编码LRR的DNA片段,亚克隆入真核分泌型表达载体pSectag2B中,构建LRR与c-Myc表位、6His标签基因相融合的真核表达质粒pSectag2B/LRR,在Lipofectamine 2000介导下瞬时转染COS-7细胞. 结果: 利用针对c-Myc表位和6His标签的抗体分别作免疫荧光和Westernblot,证实胞内表达正确融合的目的蛋白;同时双抗体夹心ELISA也检测到转染细胞上清中存在融合蛋白. 结论: 真核表达质粒构建成功,转染后目的蛋白在COS-7细胞中实现分泌表达.     

医学论文中转化、转导、转染和感染的辨析

转化、转导、转染和感染是分子生物学实验中基因转移相关的名词,在医学论文中经常使用。它们词形相近、词意容易混淆,医学论文中时常用错。“转化”指通过含外源基因的重组质粒载体将外源基因直接导入原核细胞（如细菌）;“转导”指通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞;“转染”指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞;“感染”在基因转移实验中强调重组病毒载体入侵受体细胞的过程。在使用这4个名词时,应仔细分析基因转移实验的4要素——转移物、载体、介导方法、受体细胞类型,而正确区分载体和受体细胞类型是辨析的关键点。当载体是重组质粒时,如受体细胞是原核细胞应使用“转化”,如受体细胞是真核细胞则使用“转染”;当载体是重组病毒时,如强调转移物进入受体细胞应使用“转导”,如强调重组病毒我体进入受体细胞的过程则使用“感染”。     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒的构建

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的原核表达重组质粒pET-amastin.方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-amastin.结果:扩增出大小约550 bp的无鞭毛体蛋白基因,重组质...     

人Slit2全长cDNA的真核表达及鉴定

目的:对人神经轴突导向因子Slit2(hSlit2)全长cDNA进行真核表达并进行鉴定。方法:采用分段克隆的方法获得hSlit2全长cDNA的克隆,并构建hSlit2全长cDNA真核表达重组质粒pCMV-GFP-C/hSlit2,用磷酸钙共沉淀法将其转染到人胚肾细胞HEK-293细胞中,通过免疫印迹法鉴定其蛋白表达。结果:经酶切鉴定证实hSlit2全长cDNA的真核表达载体构建成功,免疫荧光蛋白和Western blot结果证实hSlit2全长cDNA在HEK-293细胞中的表达。结论:人神经轴突导向因子hSlit2真核表达载体构建成功,为进一步完善hSlit2蛋白及各水解片段功能研究提供了实验基础。