甲酰肽受体shRNA稳定转染U87细胞系的构建

目的 构建靶向甲酰肽受体(FPR)基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定转染的U87细胞系.方法 设计并合成FPR基因特异性的shRNA序列,构建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体,通过脂质体转染293T细胞包装成FPR慢病毒颗粒,感染U87细胞.荧光显微镜观察转染效果,实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测FPR干扰效率.结果 成功构建FPR基因shRNA慢病毒表达载体.稳定转染U87细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白.实时荧光定量PCR及Western blot证实PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体具有良好的干扰效果.结论 成功构建FPR shRNA稳定转染的U87细胞系.     

EB病毒LMP1 C端原核表达质粒的构建

目的 通过巢式PCR技术扩增EB病毒LMP1 C端,并构建其原核表达重组质粒,经诱导获得EB病毒LMP1C端蛋白.方法 用巢式PCR技术,从B95-8细胞中扩增EBV-LMP1 exon c DNA,克隆至pET-32a载体,转化入原核表达菌BL21,IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定.结果 巢式PCR扩增的LMP1exon c DNA长度为801 bp,测序结果与LMP1 C端cDNA序列吻合,诱导pET-32a-LMP1c重组原核表达菌株获得大小约48×103的LMP1 C端融合蛋白,Western blot表明重组蛋白能与LMP1单克隆抗体特异结合.结论 通过巢式PCR成功构建了原核表达载体,获得的EB病毒LMP1 C端融合蛋白为制备国产LMP1单克隆抗体,研究LMP1致瘤机制奠定了基础.     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

GST-Gankyrin融合蛋白的原核表达及抗体制备

目的:为进一步研究在肝癌上过表达的癌相关基因Gankyrin的功能,进行GST-Gankyrin融合蛋白表达载体的构建、原核表达、及抗体制备.方法:采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人肝癌细胞系hepG2中扩增Gankyrin Cdna编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒Pgex-4T2中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌DH-5α,经IPTG诱导获得表达,并将Gankyrin蛋白免疫家兔,经过Western blot检测抗Gankyrin抗体的产生.结果:成功构建了Gankyrin原核表达载体,并在大肠杆菌DH-5α中获得表达,Western blot检测证实获得了抗Gankyrin抗体.结论:成功表达了Gankyrin蛋白并制备了其特异性抗体.     

Construction of lentiviral expression vector containing human TRADD gene and its inhibitory effect on proliferation in hyperplastic scar fibroblasts

目的 构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体,并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响.方法 以购买的人TRADD基因为模板,采用PCR法扩增目的基因片段,PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro重组.重组质粒转化DH5α感受态细胞.菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆测序无误后,质粒共转染293FT细胞制备慢病毒.Real-time定量PCR法检测病毒滴度.Western blot检测TRADD-GFPFLAG融合蛋白的表达.MTT法检测TRADD基因慢病毒对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响.结果 菌落PCR扩增产物经凝胶电泳,阳性克隆得到1 200 bp片段,基因测序显示重组质粒中TRADD序列与GenBank中序列一致.包装产生的慢病毒转染293 FT细胞48 h后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度为3.22×108 IU/ml,Western blot检测到融合蛋白TRADD-GFP-FLAG在293FT细胞中获得有效表达,MTT法证实该融合蛋白具有生物活性,能有效抑制瘢痕成纤维细胞增殖.结论 成功构建并包装了pLVX-TRADD-EGFP-3 FLAG-Puro慢病毒表达载体,其可明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖.     

TAT-E4orf4融合蛋白对胃癌细胞迁移和凋亡的影响

目的 构建融合细胞穿膜肽的腺病毒早期区4第4编码蛋白的pET28-TAT-E4orf4原核表达载体,分析TAT-E4orf4融合蛋白对胃癌AGS细胞凋亡的影响及其作用机制。方法 PCR法构建pET28-his-TAT-E4orf4表达载体,经PCR酶切鉴定后,诱导表达。并分别用pET28、pET28-his-E4orf4和pET28-his-TAT-E4orf4处理胃癌AGs细胞,分别采用MTT法和Transwell小室检测TAT-E4orf4对胃癌细胞增殖和迁移的影响,以流式细胞仪检测刺激后胃癌细胞的凋亡,以Western blot检测Caspases和Src信号轴上关键蛋白的表达变化。结果 PCR和Western blot实验结果证实成功构建pET28-TAT-E4orf4表达载体,MTT法显示pET28-his-E4orf4和pET28-his-TAT-E4orf4刺激后,胃癌AGS细胞增殖活性下降,且后者下降更为明显。与MTT实验结果趋势相似,Transwell实验的结果,pET28-his-TAT-E4orf4刺激后胃癌细胞迁移数目显著减少,与前三组比较,差异具有统计学意义。Western blot实验结果表明,Caspase-3和Caspase-9的表达水平无明显变化,而Src信号通路上的蛋白均出现规律性变化。结论TAT-E4orf4融合蛋白能抑制胃癌细胞增殖和迁移,促进胃癌细胞凋亡,主要依赖于Src信号通路。     

稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞系的建立

目的:建立稳定表达GFP-LC3的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系.方法:构建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表达载体,应用转染技术将该质粒导入RAW264.7细胞,用G418筛选稳定表达的细胞系.真核细胞中GFP-LC3的表达分别用荧光显微镜与Western blot方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察内质网应激时细胞发生自噬的情况.结果:成功获得2株转染并经G418反复筛选的RAW264.7细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光的表达率在95%以上,Western blot结果证实了GFP-LC3融合蛋白的表达.激光共聚焦显微镜和Western blot均证明内质网应激可以诱导自噬的发生.结论:用peDNA3.1-GFP-LC3转染的RAW264.7细胞经G418筛选,可成功建立GFP-LC3稳定表达系,从而为后续功能实验提供有用的细胞研究模型. ern blot方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察内质网应激时细胞发生自噬的情况.结果:成功获得2株转染并经G418反复筛选的RAW264.7细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光的表达率在95%以上,Western blot结果证实了GFP-L 3融合蛋白的表达.激光共聚焦显微镜和Western blot均证明内质网应激可以诱导自噬的发生.结论:用peDNA3.1-GFP-LC3转染的RAW264.7细胞经G418筛选,可成功建立GFP-LC3稳定表达系,从而为后续功能实验提供有用的细胞研究模型.     

痢疾杆菌GST-IpaH4.5载体构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建痢疾杆菌GST-IpaH4.5融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌（E.coli）中诱导表达。方法以痢疾杆菌福氏2a 301株全基因组为模板,PCR扩增痢疾杆菌ipaH4.5基因,在ipaH4.5的上游加上BamHⅠ酶切位点,下游加上XholⅠ酶切位点,将ipaH4.5基因定向插入质粒pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶切鉴定和DNA序列测定,DNA序列正确后提取质粒转化E.coli BL21,筛选阳性转化子,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果。结果成功构建IpaH4.5原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并表达出大小约86 000Mr的GST-IpaH4.5融合蛋白。结论 GST-IpaH4.5融合表达载体的构建,为进一步纯化IpaH4.5蛋白和研究其在痢疾杆菌致病机制中的作用奠定了基础。     

HRSP12慢病毒表达载体的构建及对宫颈癌HeLa细胞凋亡及增殖的影响

目的 构建热反应蛋白12（heat-responsive protein 12,HRSP12）慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装慢病毒颗粒并感染宫颈癌细胞HeLa,分析过表达的HRSP12对HeLa细胞凋亡和增殖的影响.方法 用反转录PCR扩增HRSP12全长编码顺序,构建慢病毒表达载体,利用人胚肾细胞HEK293T包装重组的慢病毒颗粒,感染HeLa细胞,用蛋白免疫印迹法检测剪切的半胱氨酸/天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）并用MTS比色法检测HeLa细胞增殖的情况.结果 编码全长HRSP12的cDNA片段为414bp,克隆至pWPI-linker载体成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装的慢病毒颗粒能够高效感染HeLa细胞,在细胞内表达Flag-HRSP12融合蛋白.HRSP12的过表达能够引起HeLa细胞caspase-3的剪切体增多,能够抑制HeLa细胞的增殖.结论 成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,初步结果表明,HRSP12可能具有诱导HeLa细胞凋亡、抑制细胞增殖的活性,为进一步研究HRSP12的生物学功能奠定了基础.     

Traf6通过降低TAK1活性抑制乳腺癌MCF 7细胞增殖能力

【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子相关受体因子6（Traf6）对乳腺癌MCF 7细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法 采用pGPU6/Neo载体构建稳定敲除Traf6的MCF 7细胞株，应用实时定量PCR和免疫印迹验证Traf6基因和蛋白的均低表达，采用细胞计数试剂盒 8（CCK8）法检测MCF 7细胞增殖情况，流式细胞仪检测MCF 7细胞周期的变化，蛋白印记法（Western Blot）检测MCF 7细胞中周期蛋白A（Cyclin A）、周期蛋白B（Cyclin B）、周期蛋白依赖激酶（CDK/p34）表达量和转录生长因子β 活化激酶1（TAK1）磷酸化水平。结果 使用pGPU6/Neo载体能够稳定的敲除MCF 7细胞中Traf6的表达，敲除Traf6能够抑制MCF 7细胞增殖并诱导其凋亡，将细胞阻滞在G1期，同时抑制细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B及CDK/p34的表达及TAK1磷酸化。结论 Traf6表达的降低能抑制TAK1信号通路活性，进而抑制乳腺癌MCF 7细胞增殖能力。     

EGFR单链抗体-力达霉素融合蛋白抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖与侵袭的研究

目的 研究EGFR单链抗体-力达霉素融合蛋白ER（Fv-LDP-AE）对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭的抑制作用,探讨其作用机制.方法 采用噻唑蓝（MTT）法测定ER（Fv-LDP-AE）对MCF-7细胞增殖的影响.流式细胞术、Hoechst 染色和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞周期的变化以及细胞凋亡.Transwell实验测定ER（Fv-LDP-AE）对MCF-7细胞迁移和侵袭的影响.采用RT-PCR检测细胞EGFR mRNA的表达水平,Western blot分析ER（Fv-LDP-AE）对EGFR细胞信号通路的影响.明胶酶谱实验测定细胞基质金属蛋白酶（MMPs）的活性.结果 ER（Fv-LDP-AE）能显著抑制MCF-7细胞的体外增殖,其半数抑制浓度（IC50）为1.5 x10-12 mol/L.ER（Fv-LDP-AE）可引起细胞周期G2/M期阻滞,诱导细胞凋亡,抑制细胞的迁移和侵袭,阻碍EGFR的表达,干扰EGFR细胞信号通路,降低MMPs的活性.结论 ER（Fv-LDP-AE）通过抑制EGFR及其细胞信号通路、干扰细胞周期循环和诱导细胞凋亡,抑制乳腺癌MCF-7细胞的体外增殖,通过降低迁移能力和调节MMPs活性,阻碍肿瘤细胞的侵袭转移.     

活化型及失活型n-Src真核表达载体的构建及活性鉴定

目的 构建神经型酪氨酸蛋白激酶n-Src的活化型（aSrc,SrcY535F）及失活型（iSrc,SrcK303R）真核表达载体并鉴定其在HEK293T细胞中的表达及活性.方法 以野生型pRc/CMV-n-Src真核表达载体为模板,采用PCR定点突变技术分别扩增活化型及失活型pRc/CMV-n-Src全长序列,并转染入HEK293T细胞,通过免疫印迹检测n-Src的蛋白表达及其自身磷酸化水平.结果 aSrc及iSrc目的 基因成功扩增,且测序结果与预期结果一致.免疫印迹分析显示,aSrc及iSrc均能在HEK293T细胞中表达,aSrc自身磷酸化水平显著升高.结论 成功构建活化型及失活型n-Src真核表达载体,并能于HEK293T细胞中高效表达.     

ERβ在结肠癌细胞株的表达及他莫昔芬对结肠癌细胞株体外抑制实验

目的：探讨ERβ在结肠癌细胞株Lovo、HT-29的表达和他莫昔（tamoxifen,TAM）对结肠癌细胞株抑制作用.方法：体外培养人结肠癌细胞株Lovo、HT-29,用细胞爬片免疫组化、RT-PCR、Western blot方法检测ER α、ERβ表达,用MTT法检测不同浓度的17β-E2、TAM、5-Fu、TAM＋5-Fu、TAM对结肠癌细胞株的生长影响作用.流式细胞仪（FCM）测定细胞凋亡率.结果：①在结肠癌细胞株Lovo、HT29中稳定表达ERβ而不表达ER α ②TAM、5-Fu能抑制Lovo、HT29细胞株的增殖 ③TAM协同5-FU对Lovo、HT29细胞株有促使细胞凋亡的作用.结论：①结肠癌细胞株Lovo表达ERβ而不表达ER α ②TAM以ERβ为靶点抑制Lovo细胞株的增殖 ③TAM协同5-FU抑制Lovo细胞株的增殖,TAM协同5-FU对Lovo、HT29细胞株促细胞凋亡的作用.     

雌激素受体β对牙周膜成纤维细胞骨钙素含量的影响

目的研究雌激素受体β（ERβ）对人牙周膜成纤维（HPLF）细胞骨钙素（OCN）含量的影响。方法采用基因干涉方法抑制了HPLF细胞中ERβ基因的表达,用雌激素干预ERβ抑制的和未抑制的HPLF细胞,研究细胞骨钙素含量的变化情况。结果测序鉴定重组质粒后,蛋白质印迹法及RT-PCR结果显示ERβsiRNA载体可特异地抑制HPLF细胞中ERβ的表达。经雌激素干预后,HPLF细胞OCN含量明显高于对照组（P〈0.01）,但ERβsiRNA载体稳定转染的HPLF细胞OCN含量与对照组相比无统计学意义。结论雌激素可能通过ERβ亚基促进人牙周膜成纤维细胞的骨钙素含量增加。     

三苯氧胺诱导乳腺癌细胞凋亡过程中ERα和SMRT的表达变化

目的：观察三苯氧胺（tamoxifen，TAM）作用前后乳腺癌细胞株T-47D和MDA—MB-231中雌激素受体α（estrogenreceptor alpha，ERα）、共抑制因子SMRT的表达变化，寻找更佳的指导乳腺癌内分泌治疗指标。方法：采用四氮甲基唑蓝（MTT）观察乳腺癌细胞T-47D和MDA-MB-231的生存状况，以筛选最佳的药物作用浓度和时间。流式细胞仪法（FCM法）检测细胞凋亡。细胞免疫组化法及Westernblot法观察TAM作用前后细胞中ER-α、SMRT的表达情况。结果：MTT法测得经0．10mmoI／LTAM作用48h后T-47D和MDA-MB-231细胞增殖率下降，与对照组相比有显著性差异（P〈0．05）。特别对T-47D效果更强。FCM法检测两种细胞均出现低于G，期DNA含量的亚二倍体凋亡峰，与MDA-MB-231相比，T-47D细胞株凋亡率更高。细胞免疫组化法及Westernblot法检测T-47D细胞，ERα、SMRT表达阳性，ERα阳性细胞比例减少，SMRT阳性细胞比例增多；MDA-MB-231细胞SMRT阴性，出现少量ER阳性及SMRT阳性细胞。结论：TAM可以通过诱导细胞凋亡途径抑制乳腺癌细胞增殖，对ERα阳性细胞T47D效果更为显著。     

基于分泌型荧光素酶亚细胞定位炎症小体活性报告系统的构建

目的 构建快捷、灵敏的亚细胞定位炎症小体活性报告系统,探讨各细胞器在炎症小体激活过程中的作用。方法 构建线粒体定位蛋白TOM20或内质网定位蛋白EMC3与白细胞介素-1β前体-分泌型荧光素酶的融合蛋白表达质粒,免疫印迹确认表达和免疫荧光染色确认亚细胞定位后,在Caspase-1和不同炎症反应刺激条件下,应用该报告系统检测炎症小体的活化情况。结果 建立的炎症小体报告系统分别定位于线粒体和内质网,可快速检测线粒体和内质网相关的炎症小体活性。结论 细胞器定位炎症小体活性荧光素酶报告系统能简便、快速地检测不同细胞器特异的炎症小体活性,可应用于无损伤的连续观察、动物活体研究和高通量药物筛选。     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

pEYFP-hApelin-R重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）融合的人Apelin-R（Human Apelin receptor,hApelin-R）真核表达载体,用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究。方法以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人Apelin-R。扩增的Apelin-R产物与质粒pEYFP-C1按常规方法酶切、连接、转化,并经酶切和测序进行鉴定。将重组质粒用脂质体法转染HEK293细胞,Western blot鉴定人Apelin-R的表达。用Apelin-13诱导后,共聚焦显微镜观察受体在细胞内的位移。结果扩增出了一条1143 bp的基因片段,序列与GenBank（NM_005161）相同。在69 kDa处有一蛋白条带,与预期大小相同。人Apelin-R表达在细胞膜上。诱导30 min后,发生受体向胞浆的位移。结论成功构建了pEYFP-hApelin-R重组表达载体,建立了该质粒转染HEK293的细胞模型。可用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究,其结果有助于寻找其作为药物的靶点。     

RNA干扰对胃癌细胞Cullin1基因表达及细胞黏附的抑制作用

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）对胃癌BGC823和MGC803细胞中Cullin1（Cul1）基因表达及细胞黏附力的影响.方法 体外化学合成Cul1 siRNA（si-Cul1）序列,同时合成Control siRNA（si-Ctrl）作为对照,在siLentFect Lipid Reagent介导下转染胃癌BGC823和MGC803细胞,Western blot检测Cul1蛋白及Src和FAK蛋白表达水平,用fibronectin包被96孔板行细胞黏附分析.结果 Cul1 干涉后胃癌BGC823和MGC803细胞株中Cul1、Src和FAK蛋白的表达均下降,同时胃癌细胞黏附于fibronectin包被板的能力降低.结论 Cul1 siRNA可以有效干涉胃癌BGC823和MGC803细胞中Cul1基因的表达,Cul1干涉后可能通过下调Src和FAK的表达水平进而降低胃癌细胞的黏附能力.     

蚓激酶对UUO大鼠肾组织NOX4、FAK、Src的影响

目的:观察蚓激酶（lumbrokinase）对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾组织NADPH氧化酶4（NOX4）、黏着斑激酶（FAK）、Src激酶表达的影响,并探讨其潜在机制。方法:雄性Sprauge-Dawley（SD）大鼠50只,随机分为5组,每组10只,即假手术组、模型组、蚓激酶低、中、高剂量组（0.9×105、1.8×10５、3.6×105 U·kg-1）,术后第2天开始灌胃给药,假手术组、模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃,连续14 d。免疫组化法检测转化生长因子β1（TGFβ1）、NOX4、FAK、Src蛋白表达变化,Western 印迹法和RT-PCR法检测TGFβ1、NOX4、FAK、Src蛋白和mRNA表达变化。结果:与假手术组相比,模型组TGFβ1、NOX4、FAK、Src、α-SMA蛋白和mRNA水平显著升高（均P＜0.05）。与模型组比较,免疫组化结果显示,蚓激酶组TGFβ1、NOX4、FAK、Src蛋白水平明显降低（F=10.57、7.086、11.23、7.750,均P＜0.05）;Western 印迹结果显示,蚓激酶组TGFβ1、NOX4、FAK、Src、α-SMA蛋白水平明显降低（F=8.873、11.18、6.902、8.679、5.672,均P＜0.05）;RT-PCR结果显示,蚓激酶组TGFβ1、NOX4、FAK、Src mRNA水平明显降低（F=5.546、4.285、6.626、3.911、5.914,均P＜0.05）。结论:蚓激酶可改善UUO模型大鼠肾间质纤维化（RIF）,其机制可能与蚓激酶调控TGFβ1、NOX4、FAK、Src、α-SMA的表达有关。