Agilent 2100 Bioanalyzer在基因差异表达研究中的应用

目的：观察Agilent2100 Bioanalyzer芯片分析系统（以下简称Bioanalyzer）在基因差异表达研究中的应用。方法：应用限制性显示技术分别从正常和热休克处理后的酿酒酵母细胞中分离出cDNA片段，然后再用Bioanalyzer和传统的琼脂糖凝胶电泳技术对RD-PCR产物进行检测分析。结果：Bioanalyzer能更快速、敏感地分离和显示差异表达的基因片段，并且通过对差异片段进行定量比较，发现了数个表达有明显差异的基因片段。结论：Bioanalyzer在基因差异表达研究中具有重要的应用价值。     

大鼠视觉相关脑区表达序列标签的克隆与鉴定

目的分析视觉相关脑区基因的差异表达并获取新的表达序列标签.方法利用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术分析大鼠外侧膝状体与视皮层基因差异表达情况,并筛选差异表达基因片段.结果经DDRT-PCR筛选并通过反Northern杂交去除假阳性,最终获得1个差异表达基因片段.对其进行克隆、测序和同源性比较发现,该片段为一新的表达序列标签,并与心肌细胞集钙蛋白的mRNA具有74%的同源性.结论视觉相关脑区差异表达序列的分析可能为研究视觉形成的分子机制或视觉通路的分子构筑提供有益的线索.     

用荧光差异显示法分离新的肝细胞癌相关基因

目的：寻找新的肝细胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ,ＨＣＣ）相关基因。方法：应用荧光－差异显示（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）技术分析人ＨＣＣ、配对非癌肝、胎肝、正常肝等组织之间的基因差异表达,差异表达ｃＤＮＡ片段,经测序后,再用ＲＮＡ狭缝杂交对部分差异片段在上述４种组织中的表达进行验证。结果：共得到差异表达ｃＤＮＡ片段１１０条。经狭缝杂交     

用荧光差异显示法分离新的肝细胞癌相关基因

目的 :寻找新的肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)相关基因。方法 :应用荧光 差异显示 (fluorescentdifferentialdisplay)技术分析人HCC、配对非癌肝、胎肝、正常肝等组织之间的基因差异表达 ,差异表达cDNA片段 ,经测序后 ,再用RNA狭缝杂交对部分差异片段在上述 4种组织中的表达进行验证。结果 :共得到差异表达cDNA片段 110条。经狭缝杂交筛选 ,获得了 4条阳性片段 ,未知cDNA片段L2和与人醛缩酶B 99.5 %同源的cDNA片段L7在部分HCC中特异性低表达 ,未知cDNA片段LC2 7和与人Nip3基因 99.4%同源的cDNA片段LC2 0在部分HCC中特异性高表达。结论 :确认了 4条HCC相关基因。其中L2和人醛缩酶B基因可能为阻抑HCC发生、发展的基因 ,而人Nip3基因和LC2 7可能为促进HCC发生、发展的基因。L2和LC2 7为目前未知的新基因。     

有无上皮细胞共培养条件下前列腺增生间质细胞的基因差异表达

目的 研究前列腺增生间质细胞在有无上皮细胞共培养条件下的基因差异表达.方法 利用前列腺间质与上皮细胞共培养模型及DDRT-PCR技术,对单独培养的前列腺增生间质细胞和与上皮细胞共培养的前列腺增生间质细胞的mRNA进行差异表达分析,获得差异表达片段(ESTs);并对这些ESTs进行斑点杂交印迹分析及克隆测序,将所测阳性克隆的cDNA序列与网上公用核苷酸数据库中的已知序列进行同源性比较.结果 得到差异表达片段44个;经同源性分析,有29个ESTs与已知基因有较高同源性,15个ESTs为新的cDNA片段.结论 前列腺增生间质细胞在有无上皮细胞共培养条件下,存在差异表达基因,这些基因可能在前列腺间质细胞与上皮细胞的相互调控中发挥作用.     

胃癌及其癌前病变相关基因差异表达的研究

目的 探讨与人胃癌发生密切相关的基因片段。方法 本研究应用荧光mRNA差异显示技术分析胃癌（3例）、胃癌前病变（3例）和正常胃黏膜（3例），鉴别并分离差异表达的基因片段，进行PCR再扩增。将扩增的cDNA片段克隆后进行测序，测序结果提交GenBank，经BLAST软件检索进行同源性分析。应用生物信息学技术确定基因在染色体中的定位。结果 发现1个差异表达的cDNA片段，在胃癌组织和癌前病变中高表达，初一步定位于17号染色体，在GenBank数据库中与RP11-25705克隆高度同源，但其具体功能目前尚不清楚。结论 本研究发现的1个基因片段在胃癌组织和癌前病变中高表达，可能参与了胃癌的发病过程。     

小鼠胸腺增龄相关性基因的差异表达及其克隆

目的 小鼠胸腺增龄相关性基因差异表达研究及其克隆。方法 利用DDRT－PCR技术对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行分析,获得差异表达片段（ESTs)。进一步作Northern印迹分析并进行核苷酸测序。选取其中一个EST为探针,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆基因。结果 对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行DDRT－PCR分析,发现小鼠胸腺基因存在增龄相关性的表达差异,某些基因在1或10月龄胸腺内有选择性表达,某些基因仅有表达量的变化。共获得108个差异表达的ESTs,其中31个呈Northern印迹阳性,全部测序。经同源性分析,有14个ESTs与已知基因有较高的同源性,17个ESTs为新的cDNA片段。选取其中1个在1月龄鼠胸腺水平表达的EST,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆到1个与小鼠的LAF1转酮醇酶高度同源的1480bp片段。结论 小鼠胸腺内存在增龄性基因表达差异。据此差异所获得的胸腺差异表达基因可能参与胸腺衰老与萎缩过程。     

应用mRNA差异显示技术进行肝癌相关基因的筛选

目的采用mRNA差异显示技术寻找肝癌及非肝癌组织的差异表达基因，筛选肝癌相关基因，为进一步研究创造条件。方法提取手术切除肝癌及非癌肝组织成对标本的总RNA，逆转录获得eDNA片段，以mRNA差异显示方法筛选差异表达基因。对所获得的差异表达基因进行序列分析，并通过CenBank／BLAST数据库进行序列的同源性比较，并以Northern杂交方法对有意义片段予以来源确认。结果自720余条扩增条带中选出28条差异条带，其中“上调”者16条，“下调”者12条。对其中5条差异最为明显的片段进一步分析，其中2条为可能的新基因片段，其中一条经Northern印迹杂交证实确来自源标本组织，且在肝癌组织中有明显高表达趋势。结论mRNA差异显示技术是一种快速、灵敏、高效的差异表达基因的克隆技术，已采用这种技术获得了1条可能的肝癌相关新基因片段，有必要进一步研究。     

子宫肌瘤致病相关基因的筛选与克隆

【目的】 研究子宫肌瘤与正常子宫肌组织中的基因表达差异,筛选及克隆子宫肌瘤的致病相关基因。【方法】 应用荧光标记的mRNA差异显示技术,比较11例子宫肌瘤及其正常子宫肌组织基因表达的差异,对获得差异片段进行克隆、测序及同源性分析,并对其中5条差异片段在子宫肌瘤及正常子宫肌组织中的表达情况进行RT-PCR分析。【结果】 差异片段NO.3,5,11,12在子宫肌瘤正常及异常组织中的表达均存在差异。其中NO.3差异片段在8例子宫肌瘤组织中有表达,而相应的正常组织中仅2例有表达。NO.5,11,12差异片段在子宫肌瘤中的表达水平高于正常子宫肌组织中的表达水平。【结论】 在子宫肌瘤的发生和发展过程中存在多个基因的表达异常,其中ulap8基因有可能在子宫肌瘤组织中呈特异性的表达,ulap14,ulap25,ulap26基因在子宫肌瘤组织中存在表达差异,推测这些基因有可能与子宫肌瘤的发病有关。     

信号传导与激活因子2基因在食管癌中的表达

目的:筛选食管癌中特异表达的基因,进一步了解食管癌发生的分子机制。方法:利用荧光差异显示技术(DD-PCR)获得差异表达的片段,对这些片段进行克隆和序列分析。通过在基因库中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因。利用实时荧光定量PCR技术在食管癌临床标本中进行验证。结果:通过DD-PCR获得的差异片段中有一个片段对应于信号传导与激活因子2(stat2)基因,该基因的读码框长2556 bp,编码852个氨基酸,编码蛋白分子量约97.9 kD。应用实时荧光定量PCR方法进一步验证发现该基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织(P<0.05,n=16)。结论:stat2基因在食管癌组织中呈高表达,推测其可能在食管癌的发生发展中起一定的作用。     

Agilent 2100 Bioanalyzer在人乳头瘤病毒检测中的应用

目的探讨Agilent 2100 Bioanalyzer 芯片分析系统(简称Bioanalyzer)在人乳头瘤病毒(HPV)的PCR检测和分型中的应用。方法先分别进行通用引物介导PCR(GP-PCR)和型特异性引物介导PCR,扩增HPV高保守区(L1区)的共同序列和各型(包括HPV6、11、16和18型)的特异性序列,然后分别用常规的琼脂糖凝胶电泳技术和Bioanalyzer对PCR产物进行检测,并比较两种检测方法的准确度、重复性和灵敏度。结果Bioanalyzer在确定片段长度时的准确度和重复性比琼脂糖凝胶电泳高,前者的准确度在95%以上,后者仅为85%;Bioanalyzer的检测灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高100倍。结论Bioanalyzer芯片分析系统结合PCR方法可对HPV进行特异、准确、稳定、灵敏的检测和型别鉴定,具有重要的推广价值。     

Agilent 2100 Bioanalyzer在人乳头瘤病毒检测中的应用

目的：探讨Agilent2100Bioanalyzer芯片分析系统（简称Bioanalyzer)在人乳头瘤病毒（HPV）的PCR检测和分组中的应用。方法：先分别进行通用引物介导PCR（GP－PCR）和型特异性引物介导PCR，扩增HPV高保守区（L1区）的共同序列和各型（包括HPV6，11，16和18型）的特型性序列，然后分别用常规的琼脂糖凝胶电泳技术和Bioanalyzer对PCR产物进行检测，并比较两种检测方法的准确度，重复性和灵敏度。结果：Bioanalyzer在确定片段长度时的准确度和重复性比琼脂糖凝胶电泳高，前者的准确度在95％以上，后者仅为85％，Bioanalyzer的检测灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高100倍，结论：Bioanalyzer芯片分析系统结合PCR方法可对HPV进行特异，准确，稳定，灵敏的检测和型别鉴定，具有重要的推广价值。     

诱发性糖尿病小鼠体外受精早期胚胎的差异基因分析

目的运用体外受精技术改变糖尿病小鼠胚胎的早期发育环境,研究母体糖尿病环境对早期胚胎基因表达的影响。方法选取6-8周龄ICR雌鼠2次腹腔注射小剂量STZ构建小鼠糖尿病模型,模型雌鼠超数排卵后通过体外受精的方法将培养至2一细胞的胚胎转移至正常假孕ICR雌鼠的输卵管内,取14d胎龄的胚胎提取总RNA。用Agilent 2100 Bioanalyzer系统对总RNA进行质检合格后,经过逆转录、标记、杂交、洗脱,芯片结果用Affymetrix Scanner 3000进行扫描,用Command Console Software3．1读取原始数据,实验重复3次。结果筛选出差异表达基因121个（P〈0．05）,其中有119个基因实验组的表达量是对照组的0．5倍以下,2个基因实验组的表达量是对照组的2倍以上。结论母体糖尿病环境能影响其卵子的生长发育,通过上调代谢相关基因和下调发育相关基因影响早期胚胎的生长发育。     

两种提取人参水煎液miRNA方法的比较

目的 筛选获取新鲜人参水煎液中高质量miRNA的提取方法.方法 选择改良Trizol法和通用植物miRNA提取试剂盒法提取新鲜人参水煎液miRNA,所得miRNA经DNaseⅠ处理后进行琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100生物分析仪检测,比较两种方法所得miRNA的纯度和质量.结果 改良Trizol法步骤简单、快捷省时、成功率较高但纯度较低;通用植物miRNA提取试剂盒法步骤较多耗时较长,但miRNA纯度高质量好.结论 通用植物miRNA提取试剂盒法更适用于提取人参水煎液中miRNA,提取的miRNA完整性好、纯度高,可以满足荧光定量PCR、建库测序等后续研究的需要.     

基因芯片筛选结肠癌伊立替康耐药相关基因

目的 应用基因芯片技术进行结肠癌伊立替康耐药相关基因表达谱差异分析.探讨伊立替康结肠癌耐药发生机制.方法 分别抽提人结肠癌细胞系SW480及其伊立替康耐药细胞系SW480/CPT总RNA,逆转录合成相应以Cy3标记的cRNA做探针,在Agilent基因芯片上杂交,Axon 4000B扫描仪扫描芯片荧光信号图像.Gene...     

适用于转录组测序的人参根总RNA提取方法的筛选

目的 筛选适用于转录组测序的人参根组织总RNA提取方法.方法 以15年生长白山人参为研究对象,比较RNAiso Plus法、Trizol法、改良CTAB法、植物总RNA提取试剂盒、多糖多酚总RNA提取试剂盒(RNA prep Pure Plant Kit)提取人参根组织总RNA,利用琼脂糖凝胶电泳、Aligent 2100 Bioanalyzer对5种方法提取的总RNA进行质量检测.结果 Trizol法和RNAiso Plus法均能提取到总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S条带清晰稳定,D(γ)260 nm/D(γ)280 nm和D(γ)260 nm/D(γ)230 nm值均在2.0左右.Trizol试剂法提取总RNA的28S条带亮度明显高于18S,所得RNA浓度达485.66 ng/μL,经Aligent 2100 Bioanalyzer检测,28S条带亮度是18S的2倍.RNA prep Pure Plant Kit试剂盒及植物总RNA提取试剂盒提取RNA的条带模糊、弥散,RNA降解严重.改良CTAB法无法完成人参根组织总RNA的提取.结论 Trizol试剂法提取的人参根组织总RNA浓度、纯度及完整性与其他方法相比效果最佳,能满足转录组测序的要求,是人参根组织总RNA提取的首选方法.     

丙型肝炎病毒全基因组培养细胞中转录调节基因的差异表达

目的利用基因芯片的高通量分析性能和丙型肝炎病毒(HCV)全基因组细胞培养系统,研究HCV对宿主细胞转录调节基因的影响和机制.方法用人工构建的HCV感染Huh-7肝癌细胞株,待其发生细胞病变后收集培养细胞,以同步培养但不感染HCV的细胞作为阴性对照.提取感染细胞和对照细胞的总RNA、总蛋白和细胞培养上清.总蛋白用于Western blotting鉴定HCV蛋白在感染细胞内的表达情况.细胞培养上清用于检测HCV在感染细胞内合成后的释放情况.总RNA 用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定抽提情况,再纯化后进行逆转录cRNA合成、荧光标记和纯化后用于基因芯片分析,检测宿主细胞转录调节基因的差异表达.结果在细胞培养上清液中可检测到HCV,感染细胞内可检测到HCV蛋白表达.基因芯片检测2倍差异表达转录调节基因发现,上调基因11个,下调基因11个.结论HCV全基因组细胞培养系统为研究HCV对感染细胞转录调节基因表达的影响提供了良好工具.利用基因芯片技术,筛选出HCV全基因组细胞培养系统中差异表达的转录调节基因,为研究HCV感染对细胞基因转录的影响提供了重要资料,加深了对HCV和宿主细胞相互作用机制的认识.     

静脉血放置时间对 Sysmex XE-2100血液分析仪白细胞分类结果的影响

目的 探讨静脉血样品放置时间对Sysmex XE-2100全自动血液分析仪白细胞分类结果的影响.方法 室温下对Sysmex XE-2100白细胞分类的精密度进行测定,然后对42例静脉血标本分别于0、2、4、8、24和48 h用Sysmex XE-2100进行测定,并将白细胞分类测定结果进行统计比较,再将Sysmex XE-2100在0 h的分类结果与手工分类结果进行比较.结果 SysmexXE-2100白细胞分类的精密度在允许范围内,SysmexXE-2100白细胞分类结果与手工分类比较,中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞相关系数（r）分别为0.9859,0.9775,0.8053,0.8695,0.5243.大部分参数在8 h内没有显著性改变,48 h MONO（%）,EOS（%）有极明显变化,BASO（%）改变明显,而MONO（%）在8 h内已明显增高.结论 室温下,静脉血标本白细胞分类计数应于8 h内用Sysmex XE-2100测定完成.