广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的 通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DV1)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析,了解各流行株之间的遗传差异,追踪其可能的传染来源。方法 应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因,克隆到PMD18-T载体,转化JM109宿主菌,挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定,应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析,并绘制基因系统发生树。结果 3株DV1病毒E基因序列长度均为1485bp,编码495个氨基酸,核苷酸序列同源性在91%~98%之间,推测的氨基酸序列同源性在94%~99%之间。GD23/95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95%(98%),与其他株的同源性相对较低,2株属同一基因型;GD14/97和GD05/99与Cambodia共享序列非常接近,3株同属另一基因型。结论 广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

海南省2019—2020监测年度A (H1N1) pdm09流感病毒基质蛋白基因特性分析

目的 分析2019—2020监测年度（2019年4月1日—2020年3月29日）海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒基质蛋白基因（Matrix, M）进化规律和M2蛋白氨基酸位点变异情况。方法 选取14株2019—2020年海南省分离的A (H1N1) pdm09亚型流感病毒进行基因序列测定,采用Neighbor-Joining方法进行种系进化分析,通过系统进化树比较海南流行株与疫苗株的差异。测序结果用MEGA 10.1.8和DNASTAR7.0.1软件进行基因特性分析及基因同源性分析。结果 2019—2020监测年度,海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒分离株占分离株的4.9%。序列分析显示,海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒与国际疫苗株A/Brisbane/02/2018的M基因在核苷酸系统进化树6B.1分支上,核苷酸与氨基酸同源性范围为98.7%~100.0%、98.8%~100.0%。12株分离株胞外区编码区S23N氨基酸发生变异;跨膜区14株分离株均发生S31N位点突变,突变率为100.0%;1株I39V位点氨基酸变异;9株分离株在胞浆区E70D位氨基酸位点发生变异。结论 2019—2020监测年度海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒活动水平较低,与疫苗株相匹配,对金刚烷胺类药物耐药,应特别关注M2蛋白氨基酸变异情况,为临床抗流感病毒药物的使用提供科学依据。     

安徽省阜阳市狂犬病街毒株G基因序列分析

目的了解安徽省阜阳市流行的狂犬病毒株与人用、兽用狂犬病疫苗株在G基因核苷酸和氨基酸水平的差异,为有效控制我国狂犬病疫情提供初步科学依据。方法在安徽省阜阳市收集犬脑组织162份,用酶联免疫吸附试验（ELISA）和小鼠颅内接种试验（MIT）检测样品带毒情况,对阳性样品用RT—PCR扩增G基因并测序,以TOPALi和DNAStar软件对G基因序列进行分析。结果从安徽省阜阳市162份犬脑样品中检出阳性样品15份;这15株病毒与我国现在使用的各种疫苗株在G基因的核苷酸和氨基酸水平上均存在不同程度的变异,与我国人用疫苗株CTN同源性较高。结论15株狂犬病毒为基因Ⅰ型狂犬病毒,在核苷酸或氨基酸水平上,与疫苗株CTN之闻的同源性要高于与其它疫苗株之间的同源性。     

不同来源H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白生物学分析

目的对不同来源的H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白进行生物信息学比较分析,以找出重要的生物信息学数据。方法从Genebank的基因数据库中获取18株H9N2亚型禽流感病毒H9血凝素蛋白的核苷酸和氨基酸序列,运用Clustal X,Bioedit等国际通用软件进行氨基酸和核苷酸的序列比对,计算核苷酸及氨基酸的同源性。在线软件Antheprot分析二级结构。结果 H9型血凝素蛋白编码框架长约1683bp,编码含560个氨基酸的多肽。18株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因同源率为90.6%~99.8%,血凝素蛋白的氨基酸同源率为93.0%~99.4%,多肽序列中有84个变异位点,变异率为15.03%。血凝素蛋白A1和A2裂解序列为位于aa333-aa341的PSRSSR↓GLF序列;其中1株出现A334T变异,另一株则出现R335G变异。H9血凝素蛋白富含潜在α螺旋(25%~27%),β折叠(29%~32%),β转角(25%~27%)及无规则卷曲(17%~19%)等结构;H9型血凝素蛋白受体结合位点是由R100、W161、T163、N191、198(A/V/T)、L202、Y203位氨基酸残基折叠构成。结论 H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白重要功能结构域的序列和空间结构相对保守稳定。     

2005～2006年宁波市甲1亚型流感病毒的病原学及基因特性分析

目的 了解2005～2006年宁波市流行的甲型流行性感冒病毒A(H1N1)亚型的病原学分子生物学特性.方法 将2005～2006年分离的流感病毒进行血清学分型,挑选H1N1亚型流感病毒的代表株进行血凝素基因(HA1)片断的核苷酸序列测定,分析抗原变异情况.结果 H1N1亚型在2005年3月起在宁波市开始活动加强,同年9月起逐渐形成优势成为主要的流行株.病毒核苷酸序列测定结果,2005年3～4月流行的H1N1与9月以后流行的H1N1氨基酸序列有较大的差异,两者为不同性状的毒株.而且后者的氨基酸序列在2006年又进一步发生了变异,与当前疫苗株A/New caledonia/20/1999的抗原性差异进一步加大.同源性降至96.3%.结论 H1N1亚型流感病毒重新引起流行并成为优势株与其抗原性的变异及人群中针对这一病毒的免疫力下降有关.     

北京市1株人狂犬病病毒分离鉴定及其分子特征

目的研究北京市一株人狂犬病病毒的N、G基因的分子特征,比较与全国流行株以及疫苗株之间的差异。方法以直接免疫荧光技术检测病人脑组织,昆明乳鼠颅内接种法分离病毒株。以RT-PCR方法扩增病毒的核蛋白及糖蛋白基因,克隆测序后进行遗传学分析。结果直接免疫荧光检测到病人脑组织中的病毒颗粒,用乳鼠颅内接种法分离到了毒株。命名为Beijing（H）株。遗传分析表明Beijing（H）株与目前我国的主要流行株N基因和G基因的核苷酸序列同源性分别是97．6％～99．1％和97．5％～99．7％。推导的氨基酸序列同源性分别是97．6％-99．2％和97．7％-99.8％。结论Beijing（H）株为基因1型狂犬病毒,属于我国目前的流行株,其与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异。     

广东省东莞市2017-2018年登革病毒E基因进化分析

目的 测定广东省东莞市2017—2018年Ⅰ~Ⅳ型登革病毒（DENV-1~DENV-4）的E基因序列,分析其系统进化情况及流行基因亚型,从分子水平探讨病毒来源。方法 收集东莞市2017—2018年140例可疑登革热患者急性期血清,用实时荧光PCR方法检测病毒核酸,阳性血清用C6/36细胞分离培养登革病毒,测定分离株E基因序列,绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果 140份急性期血清中DENV核酸阳性54份,阳性率38.6%,DENV-1阳性占53.7%。分离得到17株毒株。序列比对和系统进化分析显示,10株DENV-1分离株间核苷酸同源性为90.0%~99.9%,氨基酸同源性为96.6%~99.8%,分属基因Ⅰ型和基因Ⅴ型。7株基因Ⅰ型分离株与泰国2015年、缅甸2015年、中山2015年及越南2016年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.9%),其中2018年本地株D2018078与2017年输入株D2017008核苷酸同源性达99.8%;3株基因Ⅴ型分离株与印度2014年、2017年株及新加坡2014年流行株核苷酸同源性较高(97.7%~99.1%)。4株DENV-2分离株间核苷酸同源性为91.0%~98.6%,推导氨基酸同源性为97.6%~99.8%,分属混合型和亚洲Ⅰ型,2株混合型分离株与马来西亚2014年、台湾2015年流行株核苷酸同源性较高(99.6%~99.7%);2株亚洲Ⅰ型分离株分别与越南2015年、泰国2011年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.5%)。2株DENV-3分离株间核苷酸同源性为98.4%,氨基酸同源性为99.4%,均属基因Ⅰ型,与缅甸2017年、马来西亚2015年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.7%)。1株DENV-4分离株与越南2013、2016年流行株同源性较高(99.3%~99.5%),属基因Ⅰ型。结论 2017—2018年东莞市登革热的病原体主要为DENV-1,其次是DENV-2,各至少有2种基因亚型同时在流行;DENV-3和DENV-4各至少有1种基因亚型在流行。流行方式主要为南亚和东南亚国家及我国中山、台湾等地输入病例引起的本地暴发流行,存在输入引起本地感染的风险。     

北京地区呼吸道合胞病毒分离株F蛋白基因序列分析

目的分析中国北京地区4株呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的基因序列并与RSV原型株A2进行比较,得出中国北京地区RSV F蛋白基因是否存在变异及变异特征。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分2段扩增F蛋白的基因核苷酸序列,将得到的P1、P22段切胶纯化标记后测序,应用Bioedit软件对得到的序列做碱基配对和比较分析。结果4株RSV F蛋白核苷酸序列的同源性为94.92%~95.62%。信号肽区的同源性为99.36%~99.73%。F1、F2亚单位同源性分别为98.93%~99.31%和96.69%~97.33%。氨基酸同源性分别为:F蛋白的蛋白编码区97.39%~97.74%,信号肽区99.13%~99.65%,F1、F2亚单位98.78%~99.48%、98.61%~99.30%。结论中国RSV北京株与原型株A2之间的F蛋白基因变异小,具有很高的同源性。氨基酸在抗原位点Ⅱ保守,此段氨基酸可作为RSV疫苗的候选位点。     

东莞市2015—2016年柯萨奇病毒A6型流行情况及特征分析

目的 研究东莞市2015—2016年手足口病(HFMD)病例中柯萨奇病毒A6型(CVA6)的流行情况及基因特征。方法 采用RT-PCR方法对HFMD疑似病例标本进行检测,CVA6阳性标本上送广东省疾病预防控制中心,进行病毒分离及鉴定,扩增并测定VP1基因序列。从GenBank中选取其他CVA6代表株进行参考比对,利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4.0.2软件构建亲缘性进化树。结果 在1 145份标本中检出CVA6阳性标本580份,阳性率为50.66%(580/1 145)。序列比对显示,20株CVA6分离株VP1基因之间核苷酸同源性为93.6%~100.0%,氨基酸同源性为97.7%~100.0%。东莞市CVA6分离株VP1与近年来全球各地流行株核苷酸和氨基酸的同源性分别为93.4%~98.5%和97.0%~99.7%,与CVA6原型株Gdula以及我国山东省1996年分离株核苷酸和氨基酸相似性仅为82.5%~85.8%和94.1%~96.4%。系统进化树分析显示,2015—2016年东莞地区CVA6与近年来流行于世界各地的CVA6分离株同源性较高,而与原型株进化距离较远。结论 2015—2016年东莞市HFMD病原以CVA6为主,流行株为近年来流行于全国各地的CVA6新变种。     

海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因特性

目的 分析海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化特征与关键氨基酸位点变异情况。 方法 从海南省流感监测网络实验室分离的流感毒株中按照不同时间选取16株H3N2亚型分离株进行一代全基因序列测定,应用DNA Star 7.0.1软件进行神经氨酸酶基因同源性分析,应用MEGA 10.8.1软件构建神经氨酸酶基因系统进化树,并分析耐药性位点与抗原决定位点氨基酸替换情况。 结果 神经氨酸酶基因同源性分析与系统进化分析显示,16株分离株与疫苗株A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016（2018—2019）核苷酸与氨基酸相似性分别为98.5%~99.1%、98.3%~98.7%,进化上属于3c.2a1分支。14株分离株发生神经氨酸酶抗原性位点N329S变异,11株分离株发生E344K变异,未发生耐药性位点氨基酸替换。 结论 2019—2020年海南省流行的H3N2亚型流感病毒属于3c.2a1分支,与2018—2019年疫苗株亲缘关系较近;大部分分离株在神经氨酸酶抗原决定位点发生了一定的改变,但变异程度不大,未发生耐药位点变异。今后应持续加强流感病毒病原学监测,密切关注H3N2亚型流感病毒耐药性基因变异,及时跟踪关键氨基酸位点替换情况,为科学防控提供理论依据。     

河南省2010年县区层面狂犬病病例空间聚集性的Poisson分布与负二项分布拟合

目的:对2010年河南省狂犬病病例县区层面空间聚集性进行Poisson分布与负二项分布的拟合。方法:对河南省2010年狂犬病病例县区层面分布数据按发病数进行归类整理,利用Poisson分布与负二项分布原理在县区层面对病例进行拟合与检验。结果:河南省2010年狂犬病病例在县区层面既符合Poisson分布(χ2=4.3317,P=0.2278),又符合负二项分布(聚集性参数k=1.5204,χ2=0.3726,P=0.8300)。结论:河南省2010年狂犬病病例具有空间聚集性,这种聚集的县区同时又有一定的随机分布倾向。     

湖南狂犬病毒P基因和M基因分子遗传特征

目的了解湖南省狂犬病毒的分子流行病学特征以及其与疫苗株的差异。方法对4株湖南狂犬病病毒P和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果同源性分析表明，4株湖南街毒P和M基因核苷酸同源性分别为97．3％-99．4％和98．4％-99．8％；与其它I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸同源性比较，P基因分别为78．4％-90．2％和81．8％-86．8％；M基因的分别为81．8％-92．1％和84．7％-90．6％。4株野毒P和M基因氨基酸同源性分别为98．0％-99．3％和98．5％-99．0％。结论4株病毒P基因和M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异。进化关系表明，4株病毒均为基因I型狂犬病毒；与我国宁夏分离株最近；与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚的毒株亲缘关系较近；而与翼手目的毒株关系最远。     

不同疫区家犬携带狂犬病毒的比较研究

目的比较河南和陕西两省外观健康的家犬狂犬病毒携带率，为加强当前犬只管理、控制我国狂犬病不断上升的疫情提供参考依据。方法调查河南和陕西两省近年来人间狂犬病疫情；分别采集河南和陕西两省外观健康的家犬脑组织样品121份和645份，以免疫荧光实验（IFA）、小鼠颅内接种试验（MIT）以及逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）检测样品带毒情况；以MEGA及DNAStar等生物信息学软件对病毒核蛋白基因进行分析。结果从河南省121份犬脑样品中栓出阳性结果9份，陕西省645份样品无阳性；9株狂犬病毒与我国人用精制狂犬病疫苗CTN株系统发育关系较近。结论外观健康的家犬能够携带狂犬病毒；犬养殖量大、免疫率低以及狂犬病毒携带率高仍是当前我国狂犬病流行的主要原因。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲（A）型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因与世界各地不同年代分离的A/H1N1代表株HA基因的进化关系。方法:从NCBI数据库下载2009年新型A/H1N1亚型流感病毒的HA基因序列以及以往流行的人、猪和禽的A/H1N1亚型流感病毒参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件进行序列比对和构建系统进化树,并分别比较2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因与北美地区、欧洲地区、亚洲地区A/H1N1流感病毒HA基因编码蛋白的氨基酸序列。结果:不同时期人A/H1N1亚型流感病毒代表株HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1976~2007年北美地区分离的7株人A/H1N1亚型流感病毒具有较高的同源性,与欧洲和亚洲地区的同源性较低。不同种属间A/H1N1亚型流感病毒HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1998和2007年北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒的HA基因进化关系较近,与欧洲及亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。氨基酸比对结果显示2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因的重要抗原位点与北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒相近,与欧洲和亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及人类流感病毒疫苗株相比变化较大。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因可能是北美地区甲型H1N1猪流感病毒长期进化并与该地区人A/H1N1流感病毒部分基因片段重排的结果,对人H1N1甲型流感病毒疫苗可能并不敏感。     

Characterization of hemagglutinin gene of influenza A virus subtype H9N2

Objective　To determine the origin of human influenza A (H9N2) virus and the relationship among H9N2 strains isolated from different hosts, on the basis of molecular biology. Methods　Viruses were passed in embryonated hen eggs, and virion RNA was extracted from allantoic fluid and reverse transcribed to synthesize cDNA. cDNA was amplified by PCR and the PCR product was purified with a purification kit. Afterwards RNA sequence analysis was performed by dideoxynucleotide chain termination and a cloning method. Finally, phylogenetic analysis of the sequencing data was performed with MegAlign (version 1.03) and Editseg (version 3.69) softwares. Results　The amino acid sequences at the cleavage site between HA1 and HA2 domains of H9N2 viruses isolated in China are R-S-S-R. One pigeon strain contains seven potential glycosylation sites on the HA protein molecule, while all others have eight. There are 2 to 15 differences of amino acid sequences distributed at 24 different positions on the HA protein molecules among six H9N2 viruses. The H9N2 viruses with multiple lineages of HA genes were co-circulating in China recently. Conclusion　The highest possibility is that human influenza A (H9N2) virus was derived from Chicken H9N2 virus, and not derived from pigeon H9N2 virus. However, it is still unknown whether the H9N2 virus could transmit from person to person. The H9N2 viruses with multiple lineages of HA genes are co-circulating in China.     

葡萄糖脑苷脂酶基因多态性与帕金森病的相关性研究

目的研究中国山东人群帕金森病患者的葡萄糖脑苷脂酶（Glucocerebrosidase,GBA）基因N370s、V394L和L444P突变位点多态性,探讨GBA基因突变与帕金森病的相关性。方法应用PCR产物直接DNA4序法对60例帕金森病患者及60例正常对照组的9、10号外显子进行检测,然后进行测序对比分析。结果测序结果显示帕金森病患者和正常对照组的GBA基因外显子9和外显子10核苷酸序列完全一致,未发现突变点。结论该研究不支持GBA基因N370S、V394L和L444P突变位点是中国山东人群帕金森病的危险因素。     

甲型流感病毒H9N2亚型毒株血凝素基因特性的研究

目的　了解人甲型流感病毒H9N2亚型毒株的来源及从分子生物学角度来弄清不同宿主来源的H9N2亚型毒株间相互关系。方法　病毒在鸡胚中传代 ,从收获的尿囊液中提取病毒粒RNA ,通过逆转录合成cDNA。cDNA通过PCR进行扩增 ,接着PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。而后 ,RNA序列测定是采用双脱氧链末端终止和克隆法。最后用MegAlign( 1.0 3版 )和Editseq( 3.69版 )软件进行种系发生学分析。结果　从中国所分离出的H9N2亚型毒株。它们的HA1与HA2间裂解部位的氨基酸序列均为R S S R ,除一株鸽病毒其HA蛋白分子上仅含 7个潜在的糖基化位点外 ,而其余的均含 8个。 6株H9N2毒株HA蛋白分子上氨基酸序列有 2 - 16个不同 ,这些不同分布在 2 4个不同的位点上。近来在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2亚型毒株。结论　人甲型流感病毒H9N2亚型毒株可能性最大来自鸡的H9N2毒株 ,而不是来源于鸽的H9N2毒株。但 ,H9N2毒株是否具有人传人能力 ,至今仍不清楚。在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2毒株。     

河南省麻疹病毒基因分型及中和抗体水平研究

目的了解河南省流行的麻疹野病毒的基因特征,以及人群中麻疹中和抗体水平,探讨免疫水平对麻疹流行的影响。方法采集麻疹患者咽拭子标本分离病毒,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增麻疹野病毒分离株的核蛋白(N)基因羧基末端450个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析。用微量中和试验测定健康人群、麻疹患者血清中和麻疹疫苗株和野毒株的中和抗体水平。结果共分离麻疹病毒147株,挑选其中73株测序后均为H1基因型。检测麻疹患者血清351份,中和分离株和疫苗株,其中和抗体GMT值分别为1∶75.7和1∶75.7,差异无统计学意义(Z=0.560,P>0.05);通过免疫史分析发现,不管有无免疫史,麻疹患者血清中和两种抗原的抗体水平差异均无统计学意义。检测健康人群血清306份,中和两种毒株,其抗体GMT值分别为1∶81.9和1∶55.0,抗体滴度差异有统计学意义(Z=6.861,P<0.05)。结论河南省麻疹流行是以H1基因型为主。麻疹中和抗体达到一定水平,对于阻止麻疹病毒传播,降低发病率起到了积极的作用,但不排除当前疫苗对流行株抵御不足。     

Distribution of Avian Influenza A Viruses in Poultry-Related Environment and Its Association with Human Infection in Henan, 2016 to 2017

ObjectiveTo survey avian influenza A viruses (AIVs) in the environment and explore the reasons for the surge in human H7N9 cases.MethodsA total of 1,045 samples were collected from routine surveillance on poultry-related environments and 307 samples from human H7N9 cases-exposed environments in Henan from 2016 to 2017. The nucleic acids of influenza A (Flu A), H5, H7, and H9 subtypes were detected by real-time polymerase chain reaction.ResultsA total of 27 H7N9 cases were confirmed in Henan from 2016 to 2017, 24 had a history of live poultry exposure, and 15 had H7N9 virus detected in the related live poultry markets (LPMs). About 96% (264/275) Flu A positive-environmental samples were from LPMs. H9 was the main AIV subtype (10.05%) from routine surveillance sites with only 1 H7-positive sample, whereas 21.17% samples were H7-positive in H7N9 cases-exposed environments. Samples from H7N9 cases-exposed LPMs (47.56%) had much higher AIVs positive rates than those from routine surveillance sites (12.34%). The H7+H9 combination of mixed infection was 78.18% (43/55) of H7-positive samples and 41.34% (43/104) of H9-positive samples.ConclusionThe contamination status of AIVs in poultry-related environments is closely associated with the incidence of human infection caused by AIVs. Therefore, systematic surveillance of AIVs in LPMs in China is essential for the detection of novel reassortant viruses and their potential for interspecies transmission.