EGF、bFGF、NGF、RA对小鼠神经干细胞定向分化的调控

目的 观察EGF、bFGF、NGF、RA对小鼠神经十细胞(NSCs)增殖及定向分化的影响。方法 用无血清培养与单细胞克隆技术对小鼠胚胎脑组织进行分离、培养，随后分别加人EGF、bFGF、NGF、RA等因子观察其对NSCs定向分化的影响。结果 EGF培养的小鼠NSCs，2d后见细胞集落形成(典型克隆球)；克隆球中的细胞成圆形，形态规则，未见细胞突起，呈桑椹状聚集；经血清诱导分化后，则主要为星形胶质细胞，仅有个别的神经元。而bFGF培养的NSCs，生长良好，但克隆球数目较EGF组少，克隆球体积略小。3bFGF与EGF共同培养的NSCs，除诱导分化后，分化的细胞性质与EGF组的不同外，其余同EGF组。NGF对神经球的形成无明显的影响。RA组的克隆球数目量很少，形态以球形为主，部分细胞贴壁并出现突起。结论 EGF，bFGF对NSCs的增殖及分化种类均有一定的影响。而NGF与RA则主要影响其细胞的分化，且两者的共同点都是促使其向神经元方向分化。     

不同促细胞分裂因子对人神经干细胞定向分化的影响

目的观察不同促细胞分裂因子对人神经干细胞(NSCs)增殖及定向分化的影响。方法对人NSCs用无血清DMEM培养基行原代培养的同时,分别加入表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、维甲酸(RA)等因子,观察其对NSCs定向分化的作用。结果EGF培养的NSCs,克隆球形成慢且较松散,经血清诱导分化后,主要为星形胶质细胞,仅有少数神经元。而bFGF培养的NSCs则生长良好。在加血清诱导分化后,不同浓度bFGF培养的NSCs分化的细胞不同。bFGF与EGF共同培养的NSCs,其生长及神经球形成良好。在加血清诱导分化后,分化的神经细胞比例更接近脑内神经细胞的组分。NGF对神经球的形成无明显影响,但可促使其向神经元分化。RA使神经克隆球形成,可使NSCs直接分化为神经元细胞的比例明显增加。结论不同促细胞分裂因子对人NSCs的增殖及定向分化均有一定影响。     

大鼠嗅鞘细胞和星形胶质细胞对神经干细胞分化作用的比较研究

目的比较大鼠嗅鞘细胞与星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响。方法分别从新生SD大鼠嗅球、海马、皮质分离、培养嗅鞘细胞、神经干细胞和星形胶质细胞。收集嗅鞘细胞、星形胶质细胞及其上清液,分别对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)进行诱导分化,倒置显微镜下观察细胞的生长情况,并采用免疫组化法对分化细胞鉴定和计数。结果嗅鞘细胞组分化为神经元比率高于星形胶质细胞组(P<0.01)。结论嗅鞘细胞较星形胶质细胞能更好地促进神经干细胞分化为神经元。     

悬浮培养与贴壁培养方式神经干细胞分化表型特点

目的观察神经干细胞在悬浮培养与贴壁培养方式下的形态学特点及分化表型。方法新生6 h内的大鼠皮质应用无血清悬浮培养与贴壁培养神经干细胞(NSCs)技术培养,观察神经干细胞的形态学特点。体外胎牛血清(FBS)诱导NSCs分化,通过巢蛋白(Nestin)和GFAP免疫荧光染色鉴定分化表型。台盼蓝活细胞计数法比较细胞增殖能力。结果新生大鼠皮质应用无血清悬浮培养可获得稳定的NSCs细胞球,应用贴壁培养形成长梭状NSCs,NSCs巢蛋白免疫荧光染色结果呈阳性。体外FBS诱导分化后,神经球内开始出现放射状的神经纤维丝,免疫荧光染色可见GFAP阳性细胞向外伸展以及Nestin阳性细胞边集。贴壁的NSCs分化成星形胶质细胞,免疫荧光染色可见Nestin和GFAP染色阳性细胞。在相同条件下,应用悬浮培养在第2~3 d时增殖速度最大,而以贴壁培养方式培养出的神经干细胞在第4~5 d时增殖速度最大。结论应用无血清培养物B27与b FGF、EGF组合的NSCs完全培养基通过悬浮培养法与贴壁培养法,都可以成功在体外培养出NSCs;悬浮培养法培养NSCs在早期增殖速率上优于贴壁培养法。     

体外神经干细胞培养特性观察

目的 探讨神经干细胞(NSCs)体外分离培养和增殖的特性.方法 从新生24h内的SD大鼠脑组织分离NSCs,采用无血清悬浮培养法进行NSCs体外扩增培养.倒置相差显微镜观察细胞形态,通过绘制细胞生长曲线观察NSCs的自我更新和增殖能力,采用免疫细胞化学法检测NSCs标志物神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表达.结果 从新生SD大鼠脑组织分离的细胞在无血清的培养基中形成悬浮的神经球.神经球具有自我更新和表达Nestin的能力,分化后的细胞能表达神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性抗原.结论 从新生大鼠的脑组织中成功分离出NSCs,其具有在体外自我更新和增殖、多向分化潜能及表达Nestin的能力.     

体外三步法诱导胚胎干细胞定向生成神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的方法。方法 模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境，以脑星形胶质细胞为支持细胞，用全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)等分三阶段诱导ESCs定向生成NSCs。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定；形态学观察结合免疫组织化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志OCT-4和神经干细胞标志Nestin蛋白和(或)基因表达对诱导全过程进行动态监测；NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。结果(1)体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养，仍保持向三胚层分化的能力；(2)随着诱导的进行，OCT-4表达逐渐减弱并消失，而Nestin表达逐渐增强，经三步法最终可诱导形成纯度高达90％以上的Nestin阳性细胞；(3)所诱导生成的细胞在NSCs选择性培养基中反复传代，仍表现为Nestin阳性和具有生成神经球的能力，在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用星形胶质细胞作为诱导基质，模拟体内神经分化过程的三步诱导法，可诱导ESCs生成较高纯度的NSCs，并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力。     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞分离、培养和分化特性

目的建立大鼠神经干细胞（NSCs）分离、培养方法，观察其生长、增殖和分化特点。方法利用无血清培养技术，从新生大鼠海马、室管膜下区分离NSCs，进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定NSCs及其分化结果。结果分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力，原代及传代培养均可形成细胞克隆，克隆中的细胞巢蛋白（nestin）表达阳性，显微镜下观察见典型的干细胞特征，诱导后可分化神经元和星形胶质细胞。结论上法分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs，可诱导分化为终末神经细胞。     

大鼠胚胎NSCs与人胚NSCs的比较

目的 探讨体外培养的大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）及人胚NSCs的生长增殖特点。方法 取孕15d的大鼠，采用胰酶消化法获取海马区细胞，以106个／ml的细胞密度接种到无血清NSCs培养基中培养，分离纯化至第5代后，以10％胎牛血清（FBS）和2％多聚赖氨酸诱导分化，免疫细胞化学鉴定。同样方法分离、培养人胚海马区细胞。结果 取大鼠胚胎NSCs和人胚NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定，细胞分别呈巢蛋白（nestin）、微管蛋白（β—tubulin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学反应阳性。结论 大鼠胚胎海马区与人胚海马区均有NSCs存在，离体培养时能分裂增殖，并能被诱导分化，且两者形态相似，但是其生长速度、体积大小有差异。     

胚胎大鼠嗅神经干细胞的培养及分化特性

目的建立胚胎大鼠嗅神经干细胞(NSCs)体外培养方法,研究其增殖和分化特性.方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养胚胎14 d(E14)大鼠嗅球NSCs,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSCs及自然分化为特异性神经细胞的类型,测定NSCs的生长曲线.结果从E14大鼠嗅球分离、培养出表达nestin,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSCs.嗅NSCs的增殖依赖表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF.结论从E14大鼠嗅球培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSCs.     

神经干细胞诱导分化神经元培养方法的建立

目的:诱导大鼠神经干细胞(NSCs)向神经元细胞系分化,建立体外培养神经元的模型。方法:从Wistar大鼠胚胎大脑分离、培养NSCs,小剂量碱性成纤维生长因子(bFGF)无血清条件培养基诱导NSCs定向分化,以免疫组化技术检测,与直接培养的海马细胞中NF200阳性细胞数以及神经元生长情况进行比较。结果:应用小剂量bFGF无血清培养基诱导NSCs定向分化7、10d,神经元生长良好,通过免疫组化检测到NF200阳性神经元数量多于直接培养的海马神经元(P<0.01)。结论:应用小剂量bFGF无血清条件培养基对NSCs进行定向诱导分化,培养的神经元生长良好,可作为体外神经元培养模型之一。     

基质细胞衍生因子-1诱导神经干细胞靶向性迁移的实验研究

目的 观察基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对神经干细胞(NSCs)迁移的影响.方法 由胚胎大鼠脑组织获取NSCs并进行传代培养和分化鉴定,使用流式细胞术检测NSCs纯度及SDF-1特异性受体CXCR4的表达情况,之后利用Blind-Well小室体外迁移体系观察不同浓度的SDF-1(0 ng/L、1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL和1000 ng/mL)对NSCs迁移数量的影响,并使用μ-载片观察SDF-1对NSCs迁移距离的影响.结果成功分离培养得到了能够在体外不断分裂增殖、具有多向分化潜能的NSCs,连续传3代后绝大部分细胞nestin表达阳性,nestin和CXCR4的共表达率达到80%左右.细胞趋化实验结果表明,SDF-1对NSCs有较强的趋化作用,随着SDF-1浓度的升高,发生迁移的细胞数量也随之增加,并于SDF-1浓度为500ng/mL时达到最高峰[(256.79±38.27)个细胞/每高倍视野].在μ-载片细胞生长通道两侧的SDF-1浓度梯度(500ng/mL→0ng/mL)作用下,由细胞克隆球迁出的细胞呈不对称分布,通常有更多的迁出细胞分布于趋化因子浓度较高的一侧,且该侧细胞的最大迁移距离也比对侧远.结论 SDF-1与其特异性受体CXCR4相巨作用能够诱导NSCs发生靶向性迁移.     

Wistar大鼠胚胎脑源性神经干细胞分离、培养及其鉴定

目的 分离培养、鉴定Wistar大鼠胚胎脑源性神经干细胞.方法 从Wistar大鼠胚胎脑组织中分离胚胎脑源性神经干细胞,采用无血清培养技术进行培养、传代,应用免疫细胞化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定.结果 分离培养获得大量悬浮生长的细胞团,该细胞具有连续增殖的能力,并能分化为神经元和神经胶质细胞,经传代培养8代后仍具干细胞特性.结论 Wistar大鼠胚胎脑组织中可成功分离培养神经干细胞,该细胞在体外适宜的条件下能够大量增殖,并具有多向分化潜能.

Abstract：

Objective To isolate and culture the brain-derived neural stem cells (NSCs) from Wistar rat embryos and identify the ability of proliferation and differentiation of NSCs. Methods The neural stem cells were obtained from the brain of Wistar rat embryos. They were cuhured and passaged with serum-free medium. Cultured and differentiated cells were identified with immunocytochemistry staining. Results Clusters of neural stem cells were obtained in suspension and these cells could be continuously proliferated. And the cells could be differentiated into neurons and astrocytes which maintaining the main characteristics of NSCs after 8 passages of culture. Conclusions The neural stem ceils derived from rat embryonic brains are able to proliferate and multiple potent for differentiation.     

无血清条件下体外分离培养鼠胚胎脑组织神经干细胞

背景：神经干细胞的体外培养成功为治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路,但神经干细胞的分化和功能修复机制尚不甚清楚,移植后的细胞能否与体内细胞结合以及建立起正常的神经系统突触联系急需解决。 目的：在无血清条件下体外分离培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-03/2008-01在天津市环湖医院神经干细胞室完成。 材料：孕14~16 d的SD大鼠,由北京维通利华实验动物中心提供。 方法：取孕鼠胚胎的脑海马组织,通过机械分离和胰蛋白酶消化结合法体外分离培养神经干细胞,在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及B27的无血清DMEM/F12培养基中传代扩增。取原代培养7 d的神经干细胞,制备单细胞悬液,接种后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液诱导3 d。 主要观察指标：倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化过程,并行免疫荧光染色鉴定。通过细胞免疫化学染色检测诱导分化后的细胞类型。 结果：分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断分裂增殖,8 d左右即可形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,悬浮生长,免疫荧光染色巢蛋白呈阳性表达。神经干细胞球诱导5 d,免疫细胞化学染色后可见胶质纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇酶呈阳性表达的细胞。 结论：体外无血清条件下,分离培养的神经干细胞生长状态良好,且具有自我更新和增殖能力,诱导后能够向神经元及星形胶质细胞方向分化。     

Wnt3a影响神经干细胞分化的体外研究

目的探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞（NSCs）体外分化的影响。方法采用机械分离、无血清传代培养法从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对其干细胞特性及其受体Fzd3蛋白表达进行鉴定,观察Wnt3a对NSCs体外分化的影响。结果海马NSCs表达特异性标志物巢蛋白及胞膜蛋白Fzd3;体外诱导分化,Wnt3a处理组神经元及星形胶质细胞分化的比例分别为11．25％±0．62％和56．26％±4．82％,而对照组则为8．54％±0．48％和168．42％±5．54％;组间分化差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论体外环境下Wnt3a能够促进NSCs向神经元分化,并抑制其向星形胶质细胞分化。     

成年小鼠嗅球神经干细胞的培养和鉴定

目的 建立完善的成年小鼠嗅球神经千细胞分离培养和鉴定方法,探索新的成年神经干细胞种子来源. 方法 用无血清方法 分离培养成年小鼠嗅球来源的神经干细胞;用克隆培养、5-溴2-脱氧尿嘧啶核昔(BrdU)整合的方法 检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学的方法 检测BrdU、神经干细胞标记物巢蛋白(nestin)和SOX2、分化的细胞标记物Tuj1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、04的表达. 结果 从成年小鼠嗅球能够分离、培养出具有自我更新、增殖能力的神经球.构成神经球的细胞呈nestin和SOX2阳性,它们分化后产生TuJ1阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞、04阳性的少突胶质细胞. 结论 成年小鼠嗅球存在神经干细胞,其能够在体外进行培养、增殖、分化.是神经干细胞的新的种子来源.     

嗅鞘细胞诱导神经干细胞分化后神经元电生理特性的研究

目的探索大鼠嗅鞘细胞对神经干细胞(NSC)分化的影响,以及分化后神经元电生理特性。方法取新生鼠大脑皮质,原代培养大鼠NSC。NSC分为实验组和对照组,实验组将无血清培养的NSC中加入嗅鞘细胞条件培养液,对照组单纯无血清培养NSC。光镜下观察细胞分化情况,免疫组化法分别检测巢蛋白(nestin)、神经生长因子受体(NGFRp75)、神经丝蛋白(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,膜片钳检测神经元电生理特性。结果实验组嗅鞘细胞主要诱导NSC分化为神经元,少量分化为胶质细胞。对照组NSC逐渐萎缩,最终死亡。分化后的神经元记录到快速激活、快速失活能被河豚毒素特异阻断的钠电流,以及慢激活、慢失活能被四乙铵特异阻断的延迟整流性钾电流。结论嗅鞘细胞能诱导NSC分化成神经元,分化后的神经元具有活跃的电生理特性。     

挫伤脑组织对人胚神经干细胞影响的体外研究

目的 建立人胚胎来源的神经干细胞体外培养方法，初步研究挫伤脑组织提取液(TBITE)对人胚神经干细胞(HNSCs)存活、增殖能力和分化的影响。方法 10周龄左右的胎儿大脑皮层细胞体外培养，神经干细胞增殖2～3代后，剔除生长因子，分别加入不同浓度的脑外伤病人的挫伤脑组织提取液，培养2～3周后，免疫细胞化学方法鉴定细胞分化后的类型。用Laemrnli凝胶电泳法分析培养液上清。结果成功获得以神经球形式生长的人胚神经干细胞，Nestin表达阳性；与空白对照相比，TBITE组中的神经干细胞有明显的增殖，并分化为神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。随着TBITE含量的增加，星形胶质细胞的比例增加。结论 脑外伤的局部微环境可促进神经干细胞增殖和分化。     

The effect of bone marrow stromal cells on neuronal differentiation of mesencephalic neural stem cells in Sprague-Dawley rats

There are numerous parallels between the heamatolymphopoietic and nervous systems in terms of the mechanisms regulating their development. We proposed that neural stem cells (NSCs) may respond to the microenvironmental signals provided by bone marrow stromal cells (BMSCs) which regulate the differentiation and maturation of hematolymphopoietic stem cells. First, we isolated and proliferated BMSCs from the femur and tibia, and NSCs from the midbrain of Sprague-Dawley (SD) rats, and then investigated the effects of BMSCs on the differentiation of NSCs into neurons, astrocytes and oligodendrocytes by directly plating neurospheres on BMSC monolayers in serum-free conditions. The results confirmed that BMSCs induced NSCs to differentiate selectively into neurons. The percentage of neurons significantly increased in 7 days in vitro co-cultures of NSCs and BMSCs as compared to NSCs cultures alone. When the duration of the cultures was extended to 12 days in vitro, BMSCs enhanced the survival of neurons derived from these NSCs; our investigation then focused on the underlying mechanism for this effect of BMSCs. NSCs were cultured with BMSC conditioned-medium and co-cultured with membrane fragments of live BMSCs or paraformaldehyde fixed BMSCs, the inducing activity of BMSCs was solely detectable in BMSC conditioned-medium, indicating that soluble factors secreted by BMSCs were responsible for its effect on the neuronal differentiation of NSCs. Therefore, BMSCs may provide a powerful tool for therapeutic neurological applications.     

胚胎小鼠脊髓源性与纹状体源性神经干细胞的培养及分化特点

目的 探讨小鼠脊髓源性神经干细胞与纹状体源性神经干细胞的分离培养方法 及增殖特点,比较两种来源的神经干细胞发育时期上的异同,寻找更有利于脊髓损伤修复的种子细胞.方法 利用显微解剖、无血清培养和单细胞克隆技术在孕14 d小鼠的胎鼠的脊髓及纹状体中分离培养具有单细胞克隆能力的细胞,免疫荧光染色检测克隆细胞的神经巢蛋白(nestin)抗原和诱导分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达,并比较两种来源的干细胞在培养及分化方向上的异同点.结果从胎鼠的脊髓和纹状体中成功分离出神经干细胞.两种来源的干细胞均具有连续克隆能力可传代培养,表达nestin.脊髓血清诱导分化后脊髓源性神经干细胞β-tubulinⅢ阳性细胞(13.5±0.8)较纹状体源性神经干细胞(17.4±1.1)减少,而nestin、GFAP阳性细胞明显增多(45.7±0.3vs 39.2±1.2;25.2±1.3 vs 18.8±0.9),差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 依据细胞增殖特点和分化结果的区别,证实纹状体源性神经干细胞更适合用于移植修复脊髓损伤.