聚合酶链反应技术

1 概述聚合酶链反应(Polymerase Chain Rea-ction,PCR)是一种在体外酶促合成特定DNA片段的方法。用一对寡核苷酸引物,结合到待扩增的模板DNA片段的特定区域的两相对单链上,延伸产生新链。如此重复进行模板变性(解链)、引物复性与延伸三步骤,结果以指数形式产生特定的DNA片段,几小时可得到百万倍的扩增产物(图1)。     

淋球菌PCR检测技术研究进展

聚合酶链反应（PCR）检测技术是一种体外DNA扩增技术。其基本原理是酶促DNA合成反应，即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在及DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。随着微生物基因组学的发展，对淋球菌的基因结构越来越清楚。1985年Korch等克隆出隐蔽性质粒基因（cppB），1988年Rossau等发现淋球菌16SrRNA存在着另一个独立的基因区域，这个基因区域的核苷酸系列靶目标较多，且较稳定，能把淋球菌与其它非淋球菌区别开来。     

聚合酶链反应在乙肝病毒检测中的应用

聚合酶链反应(Polymerase China Reaction,PCR)是近年建立的一种体外基因扩增技术。其原理是:靶DNA变性解链后与特异性引物杂交,在DNA聚合酶作用下使引物延伸,合成新的DNA。上述步骤反复进行,DNA就大量扩增,以指数递增放大。它具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点,故受到广大科学工作者普遍重视。该技术目前已广泛应用     

聚合酶键反应与DNA测序

用一对寡核苷酸引物和DNA聚合酶对基因组中一特定的DNA片段进行体外扩增,这一技术称为聚合酶链反应(Polymerase chain Reaction,PCR),又称体外DNA放大。其过程是;DNA加热而变性解链→退火时引物与相应的DNA顺序(靶基因)互补配对→DNA聚     

利用一种联合一步PCR技术同时检测HBV DNA和HCV RNA

检测HCV RNA的聚合酶链反应(PCR)被广泛用于HCV感染的诊断和疗效的评估,PCR也是检测HBV DNA最敏感的技术,它通常可定量检测到分子杂交法不能检出的HBV DNA,但这两种PCR技术的应用均受劳动强度、污染的危险性以及分析所需时间等限制。为了诊断HCV和HBV单独或合并感染,作者发展了一种联合一步PCR法,用于在单份血清标本中同时检测HCV RNA和HBV DNA。PCR引物有两     

应用自动改良的聚合酶链反应系统检测HBV DNA

本文作者曾报道用聚合酶链反应(PCR)检测乙型肝炎病毒HBV DNA。本文在上述研究的基础上,进一步筛选PCR所需的引物,探索Taq聚合酶用于引物杂交和基因扩增的温度.     

多重PCR-RFLP检测XRCC1基因两位点多态性

目的 探讨多重聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(多重PCR-RFLP)技术在单核苷酸多态性检测中的应用.方法 应用多重聚合酶链反应(Multiplex)(多重PCR)原理设计人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1基因)194、399位点引物,通过PCR-RFLP技术判断XRCC1基因2个SNP位点多态性.结果 设计的两对引物可同时PCR扩增分别含2个多态位点的DNA片段,MspI限制性内切酶酶切可判断2位点多态性,PCR和酶切效果均较好.结论 多重PCR-RFLP技术可应用于单核苷酸多态位点的检测,并节省时间和费用,提高检测效率.     

PCR检测HBV—DNA若干影响因素探讨

多聚酶链反应（PCR）技术是体外酶促会成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期。循环进行20～30周期，极微量DNA即可迅速扩增，增加106个拷贝。因此，检测标本中只需少量DNA，经放大即可检测到目的基因序列。PCR已在人体遗传学和临床微生物学等领域中得到广泛的应用。然而，由于PCR强大的扩增能力与检测的敏感性，往往在实际工作中有时会遇到一些问题，影响了PCR的检测，我们观察108份标本，PCR检测HBV-DNA，通过改变各种条件，改善了反应产物的产量和特异性，现将有关影响因素和防止…     

逆转录聚合酶链反应用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应系统,用于检测恶性疟原虫感染。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,分别采用RT－PCR技术和PCR技术进行检测恶性疟原虫血样并比较两才检测的敏感性。结果 从培养的恶性疟原血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。检测系统初步显示可检出恶性疟血样中0．34个疟原虫所含的RNA模板。以RNA为检测对象的RT－PCR肉眼可见条带的检测水平较以DNA为检测对象的PCR扩增高。结论 RT－PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,有一定的应用价值。     

聚合酶链反应和地高辛标记的核酸杂交技术用于钩端螺旋体的检测

目的为钩端螺旋体快速诊断和流行病学调查建立一种比较理想的方法.方法根据钩端螺旋体赖株DNA合成一对flaB引物,用PCR技术对钩端螺旋体菌株、疫区现场动物标本等进行flaB基因扩增,用地高辛（DIG）标记flaB基因探针,用琼脂糖凝胶电泳和斑点杂交技术进行检测.结果纯化钩端螺旋体DNA 5pg经flaB-PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳可以目测.用DIG标记的flaB探针可以检测到5fg及以下的DNA扩增产物.疫区70份蛙肾标本,分离细菌8株,阳性率11.43%.flaB扩增阳性14份,阳性率20%;DIG标记探针斑点杂交检测,阳性19份,阳性率为27.14%.结论PCR-斑点杂交是一种灵敏、特异、快速的钩端螺旋体检测方法,既可用于快速检测和早期诊断,也可用于疫情监测和流行病学调查.     

荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定中的应用

[目的 ]　用taqman技术建立沙门菌荧光定量聚合酶链反应 (PCR)检测方法 ,尝试快速、准确地鉴定沙门菌。　 [方法 ]　根据沙门菌GenBankAccessionNOU2 5 3 5 2基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的沙门菌基因片段克隆导入载体 ,构建的重组质粒经筛选、鉴定后 ,作为阳性模板 ,用于标准曲线的制定。利用荧光定量聚合酶链反应 (PCR)技术进行各类菌株的定性鉴定。　 [结果 ]　应用重组质粒制作的定量曲线 ,其循环阈值与模板浓度的对数值具有良好的线性关系 ,相关系数为 0 .999。检测各类菌株 ,其中沙门菌 41株、H抗原丢失的沙门菌 16株均阳性 ;非沙门菌 10 9株均阴性。　 [结论 ]　建立了鉴定沙门菌的荧光定量PCR方法 ,该方法简便、快速、准确 ,有很好的应用前景和研究价值     

合成肽检测巨细胞病毒酶联免疫方法的建立及应用

目的：应用合成肽建立检测人巨细胞病毒（HCMV）特异敏感的酶联免疫方法，并用于临床检测患者血清中HCMV－IgM。方法：根据人巨细胞病毒PP150氨基酸序列，利用计算机辅助设计。决定含HCMV PP150国强抗原决定簇的单链多肽序列，合成肽作抗原，建立检测抗HCMV－IgM的酶联免疫吸附试验（ELISA）法，并用聚合酶链反应（PCR）方法检测全血中HCMV DNA，比较ELISA与PCR两种方法的相关性。结果：本实验所建立的检测抗HCMV－IgM的ELISA方法具有较好的特异性，正常孕妇血清中抗HCMV－IgM阳性率与HCMV DNA存在相关性。结论：本研究所建立的以合成多肽作抗原检测巨细胞病毒酶联免疫方法具有较好的特异性，简单，快速，适用与临床标本的检测。     

聚合酶链反应在HSV潜伏感染研究中的应用

潜伏感染的形成、持续和激活机制尚不清楚.为此,作者采用改进后的聚合酶链反应(PCR)检测了实验动物和人体各组织中的HSV-1 DNA和RNA序列.改进后的PCR技术包括(1)用套式引物进一步提高PCR     

双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。     

PCR检测血清HBV—DNA与HBV标记检测的相关性

聚合酶链反应(PCR)是新近发展的一种体外基因扩增技术,以待检的DNA序列为模板,用聚合酶催化引物限制的DNA合成反应。是一种具有高度敏感的检测血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA的方法。我们采用PCR技术检测111例乙肝病毒携带者血清HBV—DNA,并观察其与HBV五项标记的关系。材料和方法1.检测对象对111例乙肝病毒携带者,依据患者HBV五项标记的检测结果,将检测对象分为四组:第1组为HBsAg、HBeAg、抗-HBc均阳性者;第2组为HBsAg、抗-HBe,抗-HBc阳性者;第3组为HBsAg,抗HBc阳性者;第4组为抗-HBe,抗-HBc阳性者。2.实验方法血清HBV—DNA采用PCR方法检测,试剂盒购自浙江医科大学传染病研究所。严格按说明书规程操作。HBV五项标记HBsAg、抗-HBs,HBeAg、抗-HBe、抗-HBe,采用ELZSA法检测,试剂盒购自上海科华生化实验公司,均严格按说明书规程操作。     

乙型肝炎病毒的液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用探讨

目的 利用液相杂交技术,将核酸杂交技术进行简化,建立乙型肝炎病毒(HBV)的液相杂交的聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA)方法.方法 以HBV为目的靶DNA,引物P15'端标记Bio-PCR扩增37个循环.PCR扩增产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合,85cC 2.5 min,60C1 min进行杂交,杂交后产物均经过链霉素亲和素酶标板进行固定,经过酶标仪记录抗地高辛标记抗体,结合、显色.结果 液相杂交酶联免疫检测条件的优化:地高辛的探针浓度为2.4 pmol/次,液相杂交时间为2.5min,固相杂交时间为100 min,检测结果差异无统计学意义(P＞0.05);本试剂对87份“HBsAg+、HbeAg+、抗HBc+”标本的阳性检出率为91.95％; 72例“HBsAg+、抗-Hbe+、抗HBc+”标本的阳性检出率为68.06％,其他免疫检测指标组合标本为16份.结论 HBV的液相杂交技术应用于聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA),该杂交技术的实验操作简便,快速,适合于临床实验室的检测.     

基于非对称发夹探针的杂交链反应技术应用于病原菌检测的实验研究

目的 应用基于非对称发夹探针的杂交链反应技术,检测肺炎克雷伯菌不对称PCR产物,建立一种新的病原菌快速检测方法.方法 采用Array Designer 4.0软件,针对肺炎克雷伯菌的16S rDNA可变区域设计非对称发夹式DNA探针,优化探针浓度,以不对称PCR扩增肺炎克雷伯菌16rDNA可变区所制备的单链DNA为靶序列,采用HCR进行检测和分析.结果 HCR体系中发夹探针最佳浓度为1μmol/L;当靶序列初始浓度≥0.05μmol/L时,通过琼脂糖凝胶电泳可观察到明显的HCR聚合物;不对称PCR法制备的单链DNA可以启动杂交反应.结论 应用基于非对称发夹探针的杂交链反应技术检测病原菌具有反应体系简单,无需酶促反应等优点,可对血流感染病原菌基因组进行简便、快速、特异的检测.     

聚合酶链反应(PCR)技术的新发展——原位PCR

<正> 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术诞生于1985年,它是根据生物体内DNA复制过程而设计的在体外对特定基因序列进行快速扩增的一项新技术。它以待扩增的DNA为模板,由一对人工合成的寡核苷酸介导,通过DNA聚合酶的酶促反应,快速体外扩增特异的DNA序列。随着     

逆转录酶——聚合酶链反应检测肠道病毒

建立一种特异、敏感的检测肠道病毒的逆转录酶—聚合酶链(RT—PCR)方法。在肠道病毒RNA高度保守的5’端非编码区设计、选择、合成三对引物,采用RT—PCR对175株已知肠遭病毒和23份粪便标本进行检测。三对引物RT—PCR均显示高度特异性、敏感性。对23份粪便标本检测,E_1E_2引物有9份阳性,C_1C_2引物为7份阳性,P_1P_2均为阴性,与常规检测结果基本一致。这一检测方法具有较高特异性和敏感性,可用于临床快速检测肠遭病毒。     

PCR技术及其在卫生检验中的应用

PCR技术即聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)是在体外酶促扩增特定DNA或RNA片段的技术。具有特异、快速、敏感、操作简便等优点 ,已广泛用于生命科学的各个领域 ,被誉为近半世纪以来生命科学中最伟大的发明。发明者在报道该技术 5年后 ,于 1993年因此荣获诺贝尔化学奖。本文将根据多年工作经验和卫生检验的需要 ,简要介绍PCR技术的基本原理及常用种类、基本操作及条件优化 ,及其在卫生检验中的应用举例 ,以促使该技术在我国卫生检验领域的广泛应用。1　PCR技术基本原理及常用种类1.1　PCR技术的基本原理及体系组成　PC…