依地酸二钠在兔结膜成纤维细胞体外培养中的应用

目的研究EDTA溶液在体外培养兔结膜成纤维细胞的应用。方法将无菌条件下取得的兔结膜用2.5g/L的胰蛋白酶消化后,置于50mL/CO2、37℃培养箱中,在细胞贴壁长满后以0.4g/L EDTA溶液消化,传代、接种,共18瓶。兔的另1眼结膜用2.5g/L的胰蛋白酶作传代消化液,同样条件培养18瓶。接种48h后观察2组结果。结果EDTA组兔结膜成纤维细胞生长良好,胰蛋白酶组18瓶中有6瓶生长不良。结论0.4g/L EDTA溶液用于兔结膜成纤维细胞培养传代时的消化,可减少消化时对细胞的损伤。     

兔眼Tenon囊成纤维细胞体外培养方法的研究

探索体外培养兔眼Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞的简便方法。把兔结膜和结膜下组织剪碎后直接接种在培养瓶中,加入ＤＭＥＭ培养液进行培养,省略胰蛋白酶消化过程或者组织块干固贴壁过程。此方法简单而且有效。本文对此进行了详细的介绍,同时还介绍了如何分离培养时混杂生长的结膜上皮细胞,并且对体外培养的兔Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞的生长速度进行了研究。     

兔结膜成纤维细胞的体外培养

目的：探索兔眼结膜成纤维细胞体外培养的方法。方法：分别采用组织块培养法、机械分离法、消化培养法、细胞悬液法和混合消化组织块培养法培养兔结膜成纤维细胞,观察细胞形态和生长特性。结果：单纯机械分离和消化培养法都可以得到单层贴壁细胞,细胞消化后再培养可缩短生长周期。结论：混合酶充分消化的组织块连同细胞悬液一同培养的方法,步骤简便且周期短。通过差别消化法和多次传代可以得到较纯的成纤维细胞。     

结膜松弛症球结膜成纤维细胞培养的研究

目的：为了筛选适合结膜松弛症结膜成纤维细胞培养的方法,对不同培养基培育及杞精明目汤药物血清作用前后的结膜松弛症和正常球结膜成纤维细胞进行观察。 方法：收集结膜松弛症松弛结膜组织16例、翼状胬肉组织11例和正常球结膜组织5例,观察成纤维细胞的生长状态,筛选最适合结膜松弛症成纤维细胞生长的培养基。 结果：采用DMEM/F12培养基可使结膜松弛症成纤维细胞少量从组织块内溢出,但不能传代。采用含100mL/L胎牛血清、1μL/mL成纤维细胞生长添加物（FGS）的DMEM-H培养基可使结膜松弛症成纤维细胞顺利生长,且能够传代。 结论：最适宜培养结膜松弛症成纤维细胞的培养基是含100mL/L胎牛血清、1μL/mL FGS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM-H培养基。     

结膜松弛症球结膜成纤维细胞的原代培养及形态学观察

目的：观察原代培养的结膜松弛症(CCH)球结膜成纤维细胞生长状况及形态变化,确定最佳传代时间以获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。

方法：采用组织块贴壁法获得CCH原代球结膜成纤维细胞,胰蛋白酶差速消化法进行成纤维细胞纯化,倒置显微镜下观察并记录不同时期成纤维细胞的生长状况及形态变化,免疫荧光细胞化学染色行成纤维细胞鉴定。

结果：CCH结膜组织贴壁24h即可见少量细胞从组织块周围爬出,第2～7d为细胞生长对数期,细胞生长快、增殖旺盛,轮廓清晰,分布均匀,数目增多,细胞核清晰; 第9～15d细胞生长进入平台期,组织块逐渐老化失去活性,细胞增长缓慢,排列疏松,体积变大,形状扁平,细胞浆内见大量颗粒状物质和小泡产生,部分细胞从培养瓶底脱落,细胞之间出现较大空隙。传代纯化后细胞的大小、形态基本一致,经鉴定为成纤维细胞,呈长梭形、扁平星状或多突的纺锤形,中间宽大,有卵圆形细胞核,两头相对细小,伴向外伸出2～3个长短不一的细长突起。

结论：采用组织块贴壁法可成功获得原代CCH球结膜成纤维细胞,当细胞生长至第8d时行消化、传代可获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。     

角膜缘干细胞克隆化培养影响因素的研究

目的探讨丝裂霉素C处理Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的条件,了解兔角膜缘干细胞克隆化培养的增殖状况。设计对照实验研究。研究对象兔角膜缘干细胞单纯培养组,兔角膜缘干细胞与Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的混合培养组。方法采用DMEM/F12培养基进行细胞培养,观察4.0μg/ml丝裂霉素C作用不同时间后3T3细胞数量的变化。DispaseⅡ酶消化兔角膜缘上皮细胞,与饲细胞混合接种,观察干细胞克隆形成情况,比较各代、各组的细胞克隆形成率(CFE)。用EDTA去除饲细胞,间接免疫荧光染色检测角膜缘干细胞克隆团表达增殖细胞核抗原(PCNA)情况。主要指标细胞数/毫升,细胞克隆形成率。结果4.0μg/ml丝裂霉素C处理2.5小时的Swiss3T3细胞,培养期间(约12日)细胞数量无明显变化,可作为饲细胞。与饲细胞共同培养的兔角膜缘干细胞形成细胞克隆团,细胞的平均CFE比较:有饲细胞组角膜缘干细胞明显高于无饲细胞组(t=2.982,P<0.01)。兔角膜缘干细胞冻存复苏后平均CFE比较,有饲细胞组明显高于无饲细胞组(t=3.007,P<0.01)。兔角膜缘干细胞克隆团中细胞PCNA染色为阳性。结论角膜缘干细胞与作为饲细胞的Swiss3T3成纤维细胞共同培养形成细胞克隆,其中含有干细胞,且具有高增殖力。     

人胚胎和兔结膜成纤维细胞对抗肿瘤药物敏感性的比较

比较了体外培养条件下人胚胎和兔结膜成纤维细胞对5种抗肿瘤药的敏感性。结果表明长春新碱和阿霉素在0.001~10mg/L、5-FU在1~1000mg/L、顺铂在0.01~10mg/L的浓度范围内时，人胚胎结膜成纤维细胞对这几种药物的敏感性显著低于兔结膜成纤维细胞（P＜0.01）；两种细胞对VP-16的敏感性差别不明显（P＞0.05）.提示在进行眼内增殖性疾病防治药物的体外筛选时，用人结膜成纤维细胞较好；将动物实验结果用于临床时，要考虑种属之间的药物敏感性差异。 （中华眼底病杂志，1994，10：223-225）     

几丁聚糖生物膜对结膜下成纤维细胞的作用

目的 评价羧甲基壳聚糖生物膜对体外培养的兔眼结膜下成纤维细胞的抑制作用.方法 成年健康新西兰白兔1只,取结膜下Tenon囊组织进行体外结膜下成纤维细胞培养,传至第3代后进行细胞鉴定,第4代细胞进行生长曲线测定,将培养的第4代兔眼结膜下成纤维细胞接种于合成的羧甲基壳聚糖生物膜上,接种后24 h、48 h、72 h采用MTT比色法评价细胞的增殖情况.结果 体外培养的兔眼结膜下成纤维细胞融合后呈梭形外观,角蛋白染色为阴性,波形蛋白染色为阳性,证明其为成纤维细胞.生长曲线测定表明培养的细胞在接种后第1-5天为指数生长期,第6天后进入细胞生长平台期.接种于羧甲基壳聚糖生物膜后24 h、48 h、72 h的细胞的光密度值分别为0.207 1±0.082 6、0.173 6±0.079 6和0.181 4±0.047 5,而对照组的平均光密度值为0.283 7±0.011 0、0.272 1±0.083 3和0.307 0±0.055 6,同一时间点2组结果比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 羧甲基壳聚糖生物膜具有抑制体外培养的兔眼结膜下成纤维细胞增殖的作用.     

蛇毒制剂对体外培养的兔结膜下成纤维细胞的影响

目的　观察蛇毒制剂对体外培养的兔结膜下成纤维细胞与胶原黏附及细胞移行和增殖的影响。方法　将培养的第3～5代兔结膜下成纤维细胞于不同浓度的蛇毒制剂孵育后,接种于涂有鼠尾胶原的24孔板中,去除未黏附的细胞,用目镜网格器计数法和四甲基偶氮唑盐法记录贴壁细胞量。在第3代生长融合细胞的培养板上划线,造成无细胞的裸露区,在不同浓度的蛇毒制剂下孵育,用目镜网格器每6h观察记录移行至裸露区的细胞数。第3代兔结膜下成纤维细胞接种于24孔板与不同浓度的蛇毒制剂共育24、48h后,用四甲基偶氮唑盐法记录各孔细胞数量的吸光度(A)值。结果蛇毒制剂抑制结膜下成纤维细胞黏附呈剂量依赖性。抑制成纤维细胞黏附的半数有效量(ID50)为1.0×10     

培养猫角膜内皮细胞的新方法——联合酶消化法

目的 寻找一种可以快速获得大量猫原代角膜内皮细胞的方法.方法 揭取猫角膜后弹力层,反复剪碎,用2 g·L-1复合胶原酶消化40 min,再用2.5 g·L-1胰蛋白酶-EDTA消化2 min,离心、细胞计数后以50×106 L-1的浓度接种.待细胞长满皿底后传代,接种浓度同原代培养.记录细胞的形态以及原代细胞的数目、原代细胞铺满皿底的时间、细胞传代时间和传代次数,并与组织块贴壁法和揭膜消化法相比较.结果 联合酶消化法获得的原代细胞可以形成典型的铺路石样结构,无基质细胞污染,每片角膜可以收获(100～200)×103个细胞,只需5 d就可以首次传代,传代后4 d即可达到80%融合,连续传代8次仍可以维持小多边形的形态.结论 胶原酶和胰蛋白酶联合消化法可以快速获得大量的猫角膜内皮细胞.     

同一猴、兔眼角膜细胞成分原代培养的实验研究

目的建立从同一角膜片上分离培养角膜上皮、基质和内皮细胞的方法，为研究角膜细胞间的相互作用机制奠定基础。方法采用消化法分离培养猴眼角膜内皮细胞、上皮细胞和兔眼角膜上皮细胞．组织块培养法培养基质成纤维细胞和兔角膜内皮细胞。细胞接种于12孔培养板，并于培养不同时间行Wright染色检查细胞生长情况。结果采用消化法和组织块培养法能成功地培养猴、兔角膜上皮、基质和内皮细胞。猴、兔角膜内皮细胞培养1wk后，均能形成内皮细胞单层，细胞类似天然的六角形态．且以猴内皮细胞明显；猴角膜上皮细胞培养3～4d生长旺盛、但难以形成细胞单层，兔上皮细胞生长旺盛，1wk后已达融合状态，细胞呈膜状伸出板层伪足；猴、兔基质成纤维细胞易培养，1wk后已融合成单层细胞，细胞排列整齐，类似纤维走行样外观。结论从同一角膜材料中能分别培养出角膜3种细胞成份，消化法和组织块培养法相结合既能节省材料，又简单易行。     

PHEMA对兔角膜成纤维细胞增殖度的影响

目的 通过材料浸渍液法测定兔角膜成纤维细胞的相对增殖度来评价微孔和无孔聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯(PHEMA)的生物相容性。方法 用消化法原代培养兔角膜成纤维细胞，分别将微孔PHEMA和无孔PHEMA浸入细胞培养基24h并用此浸渍液培养兔角膜成纤维细胞，分别于2、4、7d后用分光光度计测定吸光度并计算细胞相对增殖度。结果微孔PHEMA组及无孔PHEMA组的细胞相对增殖度均大于80％，细胞毒性为一级。结论微孔PHEMA和无孔PHEMA对兔角膜成纤维细胞生长影响较小。     

兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻兔角膜缘干细胞体外培养方法。方法 分别用20％小牛血清营养液和20％胎牛血清营养液兔角膜缘干细胞行体外培养，观察细胞贴壁生长情况；同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果 20％胎牛血清营养液组，角膜缘干细胞在培养48－72h有80％贴壁生长，7－10天形成良好单层，细胞呈圆形、卵圆形或多边形，类似角膜上皮细胞；传代培养细胞形态仍正常，生长良好，但混有成纤维细胞。20％小牛血清营养液培养72h，仅有20％细胞贴壁生长，且细胞形态极不规则，有细胞“拉网”现象，培养14天仍未形成单层。结论 角膜缘干细胞的培养较常规细胞培养难，需要特殊培养基。20％胎牛血清营养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。     

DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞及鉴定

目的研究DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观察其体外生长特性,并采用免疫组织化学染色鉴定培养的上皮细胞。方法 DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观察不同时期细胞的生长情况、细胞形态,做广谱角蛋白、MUC5AC免疫荧光染色及PAS染色鉴定;并比较不同部位结膜上皮细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达阳性情况。结果 DispaseⅡ消化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞,细胞生长增殖快,能传代4～5代;绝大多数细胞广谱角蛋白免疫荧光染色阳性,少数细胞MUC5AC表达阳性及PAS染色阳性。睑结膜、穹隆部结膜和球结膜细胞PCNA阳性率分别为:(32.14±1.69)%、(27.67±1.20)%、(22.76±1.73)%,兔睑结膜上皮细胞PCNA阳性率较穹隆部及球结膜上皮细胞的PCNA阳性率高,各部位PCNA阳性率间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的理想方法,兔眼睑结膜处可能存在结膜干细胞。     

正常球结膜与翼状胬肉成纤维细胞生长增殖状况的对比观察

目的对比观察相同的培养条件下翼状胬肉与正常结膜成纤维细胞的生长增殖状况,对两种成纤维细胞的生长增殖特性作出评价。方法用10%胎生牛血清的RPMI1640培养液,在相同的培养条件下分别培养正常球结膜与初发翼状胬肉组织成纤维细胞;倒置相差显微镜下观察培养的两种成纤维细胞的特点及生长增殖状况。对传第3代的两种成纤维细胞,分别于接种后2、5、8d行噻唑蓝[3-（4,5-dimethyl -2thiazol）-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid,MTT]比色试验,检测细胞增殖活力（细胞数）。结果翼状胬肉成纤维细胞较正常结膜成纤维细胞生长快,增殖旺盛;MTT检测结果显示：5d翼状胬肉成纤维细胞的细胞总数多于正常结膜成纤维细胞（P〈0.05）,8d更明显（P〈0.01）。结论体外翼状胬肉成纤维细胞的生长、增殖特性明显强于正常结膜成纤维细胞。提示治疗翼状胬肉药物的筛选和疗效评价的实验研究应直接应用翼状胬肉成纤维细胞为研究对象,才能作出较为符合客观实际的评价。     

人晶体上皮细胞的体外培养

目的:提供一种简单可行,易于掌握的体外培养人晶体上皮细胞的方法。方法:用无齿显微镊子将晶体囊膜分离出来,剪碎后直接移至细胞培养瓶中培养,当细胞长出融合后,用胰蛋白酶消化传代。结果:接种培养4天后,可见晶体上皮细胞开始长出,并以贴壁方式生长。结论:用此方法体外培养人晶体上皮细胞,具有简单、快捷、成功率高的优点。眼科学报1997;13:170—172。     

活血散结中药复方含药血浆对PDGF干预下兔RPE细胞增殖的影响

目的：观察活血散结中药复方含药血浆对血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)干预下兔RPE细胞增殖的影响。

方法：酶消化法获取RPE原代细胞,进行RPE细胞的原代培养和传代; 制备活血散结中药复方含药血浆; 选取第4代兔RPE细胞为实验细胞,PDGF低、中、高剂量(5、10、20μg/L)干预48h后,CCK-8法检测并选取适宜细胞实验干预浓度; 建立PDGF干预下RPE细胞增殖模型。实验分组为空白对照组(DMEM)、正常血浆组、PDGF(10μg/L)组、PDGF(10μg/L)+AG1296(10μmol/L)组、PDGF(10μg/L)+10%含药血浆组,PDGF(10μg/L)+20%含药血浆组,分别加入相应处理因素干预24h后,Transwell法测定兔RPE细胞迁移力; 而干预48h后,CCK-8法测定兔RPE细胞的细胞活力OD值。

结果：10%和20%浓度的活血散结中药复方含药血浆能有效抑制PDGF干预下RPE细胞的细胞活力、细胞迁移。

结论：活血散结中药复方含药血浆能够抑制PDGF干预下兔RPE细胞增殖,这可能是其有效治疗增殖性玻璃体视网膜病变的机制之一。     

结膜松弛症患者球结膜成纤维细胞的培养和鉴定

目的研究组织贴壁法原代培养结膜松弛症球结膜成纤维细胞,并对细胞进行鉴定,为结膜松弛症体外实验提供大量的细胞。设计实验研究。研究对象体外培养的人结膜松弛症球结膜成纤维细胞。方法以结膜松弛症患者手术切除的球结膜为材料,采用组织贴壁法培养细胞,胰酶消化、传代,并对细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定、流式细胞术检测成纤维细胞胞浆特异性蛋白的表达。主要指标细胞形态、结构、纯度。结果组织块贴壁法原代培养2～5天见组织块能紧密贴附于六孔板,倒置显微镜下观察组织块周围有细胞溢出,10～15天即可见细胞增生,细胞呈马赛克样,界线不清。传代至第2代细胞倒置显微镜下观察形态一致,大小均一,呈放射状排列,为长梭形或两头尖的长条状,胞质中有一个卵圆形的细胞核,周围有长短不等的细胞突起相互交联。细胞免疫化学染色,荧光显微镜下可见结膜松弛症球结膜成纤维细胞Vimentin表达阳性,Keratin(C11)表达阴性。流式细胞术检测成纤维细胞Vimentin表达阳性,Keratin(C11)表达阴性。结论采用组织贴壁法培养能够获得稳定的结膜松弛症球结膜成纤维细胞,经形态学观察、免疫荧光鉴定及流式细胞术检测为结膜松弛症球结膜成纤维细胞。     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。     

TGF-β2特异性siRNA载体干扰人结膜囊成纤维细胞表达的研究

目的:探讨人转化生长因子TGF-β2特异性siRNA真核表达载体转染人结膜囊成纤维细胞后对其TGF-β2mRNA表达的影响。方法:体外分离并培养人结膜囊成纤维细胞,在培养后传代3次的细胞以TGF-β2特异性siRNA真核表达载体进行转染,并以未转染细胞作为对照。转染后分别于24,48和72h收集细胞,采用RT-PCR技术检测TGF-β2特异性siRNA真核表达载体对TGF-β2mRNA表达的影响。结果:分离的人结膜囊成纤维细胞于接种约4h左右开始贴壁,同时细胞变长成为梭形,表现出明显的成纤维细胞特性,约36h后达到融合状态;RT-PCR结果示:与对照组相比,转染24,48和72h后的细胞TGF-β2表达抑制率分别为17.40%,52.80%和79.20%,抑制效率呈现随时间延长有所加强的趋势。结论:TGF-β2特异性siRNA真核表达载体能抑制人结膜囊成纤维细胞TGF-β2mRNA的表达。