mTOR通路抑制剂依维莫司对不同胶质瘤细胞自噬作用的影响

目的 探讨mTOR抑制剂依维莫司对人脑胶质瘤细胞自噬作用的影响. 方法 体外培养胶质瘤细胞株87-MG、U251、SHG-44,给予不同浓度的依维莫司(0.1、0.5、1、10、20、100nmol/L)作用4-6d后用MTT法检测细胞的增殖并分析各细胞株的半数抑制浓度(IC50)值.Hoechst33342/PI荧光双染检测IC50的依维莫司作用48 h后细胞凋亡;单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色检测细胞自噬囊泡的形成;流式细胞术检测细胞周期的变化.Western blotting测定IC50的依维莫司作用24h后细胞磷酸化mTOR、p70S6K、4E-BP-1蛋白及非磷酸化mTOR、p70S6K蛋白的表达. 结果 MTT结果显示U87-MG、SHG-44、U251细胞的生长均受到明显抑制,IC50分别为0.1、0.5、10nmol/L;Hoechst 33342/PI荧光双染结果显示细胞没有发生明显的凋亡,可能为细胞白噬;MDC染色显示IC50的依维莫司作用后,细胞中荧光颗粒增加,荧光强度增强;流式细胞术检测显示3种细胞均有特异性的G0/G1期细胞阻滞;Western blotting检测显示随着依维莫司剂量的增加,胶质瘤细胞中磷酸化mTOR、p70S6K、4E-BP-1的表达水平均明显减少,非磷酸化4E-BP-1的表达水平减少,而非磷酸化p70S6K无明显变化. 结论 mTOR抑制剂依维莫司可以促进胶质瘤细胞的自噬,mTOR通路可能为潜在的新的胶质瘤的治疗靶点.     

三氧化二砷对人脑SHG-44胶质瘤细胞作用的体外实验研究

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对人脑SHG-44胶质瘤细胞株的增殖抑制及诱导凋亡机制.方法 将不同浓度的As2O3与体外培养的SHG-44胶质瘤细胞相互作用后,采用MTT比色法检测As2O3对胶质瘤细胞的增殖抑制;倒置显微镜、荧光显微镜下观察吉姆萨及Hochest33258染色后细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测细胞凋亡及对SHG-44胶质瘤细胞周期影响.结果 MTT比色法检测到As2O3对SHG-44胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性和时间依赖性;倒置显微镜及荧光显微镜下可观察到给药组细胞生长密度低以及出现细胞凋亡的特征性改变;流式细胞仪检测到给药组细胞凋亡比率明显高于空白对照组(P＜0.05),并具有剂量依赖性及时间依赖性,同时将胶质瘤细胞阻滞在S期,抑制了细胞周期的进程.结论 As2O3对SHG-44胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用、可诱导SHG-44胶质瘤细胞的凋亡,并抑制细胞周期进程.     

白藜芦醇抑制SHG-44胶质瘤细胞生长实验研究

目的探讨白藜芦醇(Res)在体外诱导脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡并抑制其生长的作用。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测量不同剂量的Res作用6h、24h和48h后对SHG-44胶质瘤细胞增殖的影响。HE染色、Hoechst33342荧光染色观察细胞形态改变,DNAladder检测细胞DNA裂解情况,流式细胞仪用异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V(AnnexinV-FITC)和碘化丙啶(PI)双染检测凋亡率,并测定细胞周期的改变。结果Res明显抑制SHG-44细胞的生长和增殖(P<0.01),呈浓度及时间依赖性反应;Res所致的SHG-44胶质瘤细胞凋亡为浓度依赖关系,随着浓度的增高,凋亡更明显。此凋亡细胞周期主要发生G1期比例升高,S、G2期比例降低。结论Res明显抑制SHG-44细胞生长并诱导其发生凋亡和细胞周期改变,为Res用于治疗脑胶质细胞瘤提供了实验依据。     

自噬在ALA-PDT诱导C6胶质瘤细胞死亡中的作用机制

目的 探讨自噬在光敏剂5-氨基乙酰丙酸(aminolaevulinic acid,ALA)介导的光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)C6胶质瘤细胞死亡中作用机制.方法 ALA-PDT处理后不同时间,用自噬特异染料MDC和免疫荧光法观察自噬水平变化,Western blotting检测自噬相关蛋白cathepsin B的表达水平.结果 MDC染色和免疫荧光观察可见ALA-PDT后C6胶质瘤细胞内有大量含点状荧光颗粒的自噬泡和自噬体标志物LC3绿色荧光蛋白,Western-blot示自噬相关蛋白cathepsin B表达水平明显升高,其白噬水平随AIA-PDT后时间而逐渐增强.结论 ALA-PDT可诱导C6胶质瘤细胞发生自噬,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与溶酶体酶cathepsin B大量释放有关.     

碘125粒子内放疗后胶质瘤U251细胞自噬的发生

目的探讨碘125（125I）内放疗后胶质瘤U251细胞发生自噬的情况。方法用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法检测不同照射时间及剂量下125I粒子对U251细胞增殖活性的影响。通过单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色,自噬溶酶体活性的检测以及Western blotting蛋白印迹检测微管相关蛋白轻链3（LC3）来证实125I粒子对U251细胞自噬发生的影响。结果125I粒子照射U251细胞后细胞活性明显下降并呈现时间和剂量相关性。MDC染色和溶酶体活性检测以及LC3-Ⅱ蛋白印迹均证实内放疗照射后U251细胞自噬明显增加。结论125I粒子内放疗后U251细胞自噬明显增加。     

丙戊酸诱导胶质瘤细胞自噬及其机制研究

目的对丙戊酸诱导胶质瘤细胞发生自噬性死亡的过程进行观察,并初步探讨其可能的机制。方法丙戊酸处理人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295,台盼蓝染色检测细胞活性并计算细胞存活率;流式细胞仪测定细胞周期,透射电子显微镜和荧光测定仪观察细胞超微结构及自噬水平,West-ern blotting检测经丙戊酸处理后细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt和p-p70S6K等蛋白质的表达水平。结果经不同浓度丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295细胞活性明显受到抑制,其胶质瘤细胞半数抑制浓度分别为(2.45±0.32)、(4.78±0.62)和(6.62±0.95)mmol/L,其中丙戊酸对人脑胶质瘤细胞系U87具有较明显的杀伤作用(P<0.05)。透射电子显微镜观察可见人脑胶质瘤细胞系U87细胞胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体,其自噬水平随丙戊酸浓度的升高而逐渐增强。经丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显升高,而p-Akt和p-p70S6K表达水平明显降低。结论丙戊酸可诱导胶质瘤细胞发生自噬,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与阻断Akt信号转导通路有关。     

Beclin 1 基因对恶性胶质瘤细胞 U87 自噬活性和增殖的影响简

目的研究BeclinJ基因对U87胶质瘤细胞自噬和增殖的影响。方法实验分5组：空白对照组．pSUPER—Bec组（表达BeclinsiRNA）与其阴性对照组（pSUPER—non组）,pcDNA3．1-Bec组（表达BeclinJ基因质粒）与其阴性对照组（pcDNA3．1-non组）。分别转染U87细胞,采用免疫印迹检测Beclin1、LC3和p62蛋白在各组的表达;用氚标胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）检测各组细胞增殖率。结果转染后48h,pSUPER—Bec组Beclin1、LC3B—11蛋白表达下降,p62蛋白表达升高。pcDNA3．1-Bec组Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表达升高,p62蛋白表达下降。与空白对照组或pcDNA3．1-non组相比．pcDNA3．1-Bec组细胞增殖速度降低（P〈0．05）,其他各组细胞增殖速度无明显差异。结论恶性胶质瘤细胞中自噬相关基因Beclinj表达下降,过表达Beclinl蛋白能增强细胞的自噬活性,抑制细胞的增殖活性。     

125Ⅰ诱导大鼠脑内胶质瘤凋亡实验研究

目的研究125Ⅰ诱导人脑胶质瘤细胞系SHG-44体内外凋亡的可能性及其机制.方法体外培养SHG-44细胞,采用流式细胞仪法检测125Ⅰ诱导SHG-44细胞凋亡及对细胞周期影响,采用立体定向的方法建立大鼠脑内人胶质瘤模型,1周后经MRI检测后,于肿瘤区接种125Ⅰ,2周后复查MRI检测肿瘤大小,3周后处死大鼠,取对照组及肿瘤周边组织及肿瘤组织行Bcl-2、p53免疫组织化学染色.结果SHG-44细胞接种1周,MRI示脑内形成实体瘤;125I可抑制肿瘤生长,诱导细胞凋亡,延长荷瘤鼠生长周期,抑制Bcl-2基因表达,促进p53蛋白表达.结论125Ⅰ具有体内、外抑制SHG-44细胞增殖,诱导凋亡的作用;其诱导凋亡机制可能与抑制Bcl-2蛋白表达,促进p53蛋白表达有关.     

蛋白酶体抑制诱导的PC12细胞帕金森病模型

目的探讨蛋白酶体抑制剂对PC12细胞的作用以及用该药物制作帕金森病(PD)模型的可能性。方法用不同浓度蛋白酶体抑制剂PSI作用于PC12细胞24、48、72 h后,以MTT法检测细胞活性,荧光染色检测凋亡细胞百分率,HE染色观察细胞形态变化,透射电镜观察细胞超微结构变化。结果不同浓度PSI作用于PC12细胞24 h时,细胞存活率无变化;作用48~72 h时,1~20μmol/L PSI使细胞存活率分别降至47.03%~58.98%和19.58%~34.72%;凋亡细胞由1.15%升至5.27%。HE染色显示经PSI处理的PC12细胞胞浆内有嗜酸性包涵体出现,透射电镜下细胞呈凋亡的超微结构特点。结论PC12细胞蛋白酶体受抑模拟了PD的两大病理特点,蛋白酶体功能异常可能是PD的发病因素之一,短期抑制PC12细胞的蛋白酶体功能可作为PD的细胞模型。     

125I对体外培养的胶质瘤细胞C-myc、p53基因表达及细胞增殖的影响

目的探讨125I对体外培养的胶质瘤细胞SHG-44C-myc、p53基因表达及细胞增殖的影响。方法利用免疫组化技术检测经125粒子放射处理3d后,SHG-44细胞的C-myc蛋白表达与p53蛋白表达水平。结果经1粒、3粒125粒子放射处理3d后,SHG-44细胞C-myc蛋白表达明显减弱,而p53蛋白表达显著增强。二者呈负相关。结论125I可以通过影响C-myc基因与p53基因的表达抑制人脑恶性胶质瘤细胞株SHG-44增殖,从而抑制胶质瘤的生长。     

五味子甲素通过ATP结合盒转运子B1逆转胶质瘤干/祖细胞耐药性研究

目的探讨五味子甲素对胶质瘤干/祖细胞耐药性的影响及作用机制。方法自人胶质瘤细胞系SHG-44中分离培养胶质瘤干/祖细胞SHG-44s,予五味子甲素0、12.50、25.00和50.00μmol/L联合长春新碱400、800和1200 nmol/L,细胞活性检测试剂盒CCK-8细胞毒性实验检测SHG-44s细胞增殖活性,罗丹明123染色检测SHG-44s细胞泵出药物能力,实时聚合酶链反应(PCR)和Western blotting法检测SHG-44s细胞ATP结合盒转运子B1(ABCB1)基因转录和翻译能力。结果五味子甲素50μmol/L即可抑制SHG-44s细胞增殖活性(P=0.001,0.001,0.039),剔除这一浓度后无论长春新碱浓度为400、800或1200 nmol/L,联合应用五味子甲素均可抑制SHG-44s细胞增殖活性(长春新碱400 nmol/L组:P=0.007,0.001;长春新碱800 nmol/L组:P=0.001,0.000;长春新碱1200 nmol/L组:P=0.000,0.000)。倒置荧光显微镜观察,五味子甲素12.50μmol/L组和25.00μmol/L组SHG-44s细胞可见明显绿色荧光。流式细胞术显示,随着五味子甲素浓度的增加,SHG-44s细胞罗丹明123染色阳性细胞比例分别为10.40%、39.20%和45.20%。实时PCR法显示,五味子甲素12.50μmol/L组和25.00μmol/L组SHG-44s细胞ABCB1基因表达水平较0μmol/L组降低(P=0.027,0.006),尤以25.00μmol/L组显著(P=0.034)。Western blotting法显示,随着五味子甲素浓度的增加,SHG-44s细胞P-糖蛋白表达水平下降。结论五味子甲素通过抑制胶质瘤干/祖细胞表面已存在的ABCB1基因编码的P-糖蛋白泵出药物能力并降低ABCB1基因转录和翻译能力,逆转胶质瘤干/祖细胞耐药性。     

脂质体介导CD基因转染SHG-44胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD重组表达质粒转染SHG-44胶质瘤细胞，体外观察5-氟胞嘧啶（5-FC）对转染CD基因的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；脂质体Lipofectamine 2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选培养获取抗性细胞克隆（即SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学检测SHG-44／CD细胞的CD基因蛋白水平表达；流式细胞仪、TUNEL实验及透射电子显微镜观察5-FC对表达CD基因的SHG-44／CD细胞凋亡的诱导作用。结果含CD基因的pCMVCD质粒成功转染进入SHG-44细胞，获取了含CD基因的SHG-44／CD细胞，免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。在含5-FC的培养液中培养，SHG-44／CD细胞出现典型的凋亡形态，TUNEL显示凋亡细胞比例极高；透射电镜可见凋亡改变；流式细胞术检测凋亡率达18．6％，凋亡率呈剂量依赖性。结论建立了SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞的CD／5-FC自杀基因系统。诱导SHG-44／CD胶质瘤细胞产生凋亡可能是脑胶质瘤CD基因疗法的重要机制。     

TNF-α基因与依托泊甙联合诱导胶质瘤凋亡的实验研究

目的在体外水平(invitro)建立对胶质瘤杀伤作用的TNF-α基因/VP16系统,研究该系统诱导胶质瘤凋亡的作用。方法用逆转录病毒载体将TNF-α基因转染人胶质瘤细胞株SHG-44,经生长抑制试验,比较转TNF-α基因前后SHG-44细胞对依托泊甙(Etioposide,VP16)的敏感性,并通过形态学及流式细胞仪检测VP16诱导转基因细胞凋亡的情况。结果生长抑制试验表明,转染TNF-α基因后的SHG-44细胞对VP16的敏感性是转基因前细胞的10倍(P＜0.01),IC50为0.8μg/mL。流式细胞检测表明,VP16对转TNF-α基因细胞有较强的诱导凋亡的能力。结论VP16对转TNF-α基因SHG-44细胞诱导凋亡的能力大大增加,表明TNF-α基因/VP16系统对胶质瘤的基因治疗有效。     

Induction of autophagy in temozolomide treated malignant gliomas

Autophagy is a dynamic process of protein degradation. Induction of autophagy by temozolomide (TMZ) has been noted in glioma cell lines. Twenty‐eight specimens, obtained from 14 patients before and after TMZ treatment, were analyzed to investigate whether induction of autophagy could be detected in surgical specimens by immunohistochemical analysis. Macroautophagy was monitored by immunohistochemical analysis employing anti‐light chain 3 isoform B (LC3B) and anti‐lysosome‐associated membrane protein 1 (LAMP1) antibodies; chaperone‐mediated autophagy was monitored by anti‐LAMP2A antibody immunostaining. Furthermore, detection of LC3B protein by Western blotting was performed on six specimens obtained from the preserved frozen tissues of three patients. All specimens showed dot‐like staining for each immunostain in the cytoplasm of glioma cells, indicating induction of autophagy. LC3B, LAMP1 and LAMP2A immunostains were semiquantitatively scored from 1 to 3 points. Combination of the three scores after TMZ treatment (6.4 ± 1.2) showed a significant increase (P = 0.020) compared to pre‐treatment scores (5.2 ± 1.5). Western blotting for LC3B showed increased LC3B‐I and LC3B‐II expression after TMZ treatment. The present study proved that autophagy monitoring by immunohistochemical staining of surgical specimens was feasible. These results suggest that autophagy is induced by TMZ.     

替莫唑胺缓释剂胶质瘤间质内化疗的实验研究

目的观察肿瘤间质内应用替莫唑胺缓释剂(P-TMZ)对人脑胶质瘤的抑瘤效应。方法先以MTT法测定P-TMZ对SHG-44胶质瘤细胞的抑瘤效应,加药96h后检测不同药物浓度在570nm处的OD值,计算其IC50;再将SHG-44细胞接种于NC系裸小鼠右腋皮下,待肿瘤生长至体积约100mm3时,将荷瘤鼠随机分为P-TMZ组、替莫唑胺(temozolomide,TMZ)组、卡莫斯汀(BCNU)组和不载药微球(P-0)组,然后将P-TMZ(500mg/kg)、TMZ(50mg/kg)、BCNU(40mg/kg)和P-0(500mg/kg)以DMEM培养液混悬至终体积150μl,经皮多点穿刺缓慢注入相应组肿瘤间质内,每周测量皮下肿瘤大小2次。结果P-TMZ、TMZ和BCNU对SHG-44胶质瘤细胞的体外抑瘤效果明显,三者的IC50均<10μg/ml;与P-0组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01)。在体内抑瘤实验中,P-TMZ、BCNU、TMZ抑瘤率均明显高于P-0(P<0.01)。P-TMZ和BCNU的抑瘤效应优于TMZ组(P<0.05)。结论P-TMZ保留了TMZ的抑瘤活性,兼具高稳定性和长时程药物作用时间等药代...     

Growth and radiosensitivity of irradiated human glioma cell progeny

BACKGROUND： Progenitors of the immortalized human glioma cell line, SHG-44, are significantly less sensitive to irradiation. Two hypotheses regarding the mechanism of this effect exist： several studies have suggested that there is a subgroup with different radiosensitivities in identical cell group, and the progenitors of irradiate is a adaptive response subgroup, so its radiosensitivity is descend. A second hypothesis suggests that irradiated glioma progeny have a stronger ability to repair DNA damage. This would suggest that when progeny are continuously irradiated, resistance to irradiation-induced DNA increases, and radiosensitivity decreases. OBJECTIVE： To investigate radiosensitivity and growth features after irradiation to progeny of the human glioma cell line SHG-44. DESIGN, TIME AND SETTING： A randomized, controlled experiment, which was performed at the Department of Radiology Laboratory, the First Hospital Affiliated to Soochow University, between September 2004 and January 2006. MATERIALS： The glioma cell line SHG-44 was provided by the Institute of Neuroscience, First Affiliated Hospital of Suzhou University. Propidium iodide reagent was provided by Coulter Corporation. A linear accelerator, KD-2 type, was provided by Siemens, Germany. The flow cytometer EPICS-XL was provided by Coulter Corporation. METHODS： Brain glioma SHG-44 cells were divided into four groups： SHG-44, SHG-44-2, SHG-44-6, and SHG-44-10 . The SHG-44-2, SHG-44-6, and SHG-44-10 cells were vertically irradiated with varying doses of 2, 6 and 10 Gy by a linear accelerator （6 MVX）. The cells were passaged for 15 generations and cultured in RPMI-1640 culture media. MAIN OUTCOME MEASURES： Community re-double time, mean lethal dose （D0）, extrapolation number （N）, fraction surviving fraction irradiated by 2 Gy dose （SF2）, quasi-threshold dose （Dq）, and cell cycle. RESULTS： The Population doubling time （PDT） of SHG-44-2, SHG-44-6, and SHG-44-10 cell groups was not significant （P = 0.052）. Compare     

地塞米松对嘧啶亚硝脲诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的影响

目的观察地塞米松（DEX）对嘧啶亚硝脲（ACNU）诱导的人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法分别以ACNU、DEX、ACNU联合DEX,作用于体外培养的人脑胶质瘤细胞系SHG—4460h,通过细胞形态学及流式细胞仪分析检测细胞凋亡。结果①形态学观察：ACNU组、ACNU联合DEX组,大部分瘤细胞呈现细胞凋亡的形态学改变。而DEX组及正常对照组仅个别细胞出现上述形态改变。②荧光显微镜观察及流式细胞仪分析：ACNU组、ACNU联合DEX组有典型的凋亡峰,且其瘤细胞的凋亡率明显高于DEX组及正常对照组瘤细胞的凋亡率（P〈0．01）,但ACNU组的SHG～44细胞的凋亡率与ACNU联合DEX组相差不显著（P〉0．05）。结论DEX对ACNU诱导人脑胶质瘤细胞凋亡没有明显影响。     

九节龙皂苷诱导胶质瘤SHG-44细胞凋亡及其机制研究

目的研究九节龙皂苷对胶质瘤SHG-44细胞潜在的治疗作用及其机制。方法用四甲基偶氨唑蓝（MTT）法检测不同剂量九节龙皂苷于不同时间（6、12、24、72h）对人胶质瘤SHG-d4细胞活性的影响和细胞流式术检测SGH-44细胞调亡情况;Western—blot检测caspase-3和Bcl-2在SHG-44细胞中的表达情况。结果流式细胞仪检测显示,随着九节龙皂苷浓度的增大和时间延长,SHG-44细胞的凋亡率明显上升,Western—blot结果提示九节龙皂苷下调了凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达并激活了凋亡蛋白caspase-3,九节龙皂苷明显抑制SHG-44细胞的生长与增殖。结论九节龙皂苷引起胶质瘤细胞大量凋亡,具有显著的抗肿瘤作用,通过调控caspase-3和Bcl-2诱导胶质瘤SHG-44细胞凋亡。