结晶型硫化镍诱导的人支气管上皮细胞系转化细胞基因组不稳定性分析

目的　检测结晶型硫化镍对基因组不稳定性的影响 ,从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法　采用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA ,RAPD)技术对经结晶型硫化镍在诱导人支气管上皮细胞系 (16HBE)的恶变细胞中的基因组不稳定性进行分析。结果　本实验所选用的 7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带 ,条带数在 1～ 6条之间。 7条引物中第 4条、第 5条和第 7条两条扩增的片段在实验组和对照组之间无明显差异 ,其余 4条引物均有差异。对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论　结晶型硫化镍能诱发 16HBE细胞基因组不稳定     

硫酸镍诱导16HBE细胞恶变过程中的K—ras、P15基因的改变及基因组不稳定性分析

目的检测硫酸镍对K-ras基因和P15基因的改变及基因组不稳定性的影响,从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法探查硫酸镍在诱导16HBE细胞恶变过程中的K-ras基因Exon1和P15基因Exon2存在状况。采用随机扩增多态性技术对硫酸镍在诱导16HBE细胞恶变过程中的基因组不稳定性进行分析。结果K-ras基因Exon1和P15基因Exon2未发生改变。本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带,条带数在1~6条之间。7条引物中P1、P4、P7三条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余四条引物均有差异,对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论P15基因第2外显子和K-ras基因第一外显子可能不是硫酸镍作用的靶部位。在硫酸镍诱发细胞恶变转化过程中,基因组变得逐渐不稳定。     

乙酸镍诱导16HBE细胞恶变过程中的K-ras和P15基因的改变及基因组不稳定性分析

目的：检测乙酸镍对K—ras基因和P15基因的改变及基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性分析方法探查乙酸镍在诱导16HBE细胞恶变过程中的K—ras基因Exonl和P15基因Exon2存在状况。采用随机扩增多态性技术对乙酸镍在诱导16HBE细胞恶变过程中的基因组不稳定性进行分析。结果：K—ras基因Exonl和P15基因Exon2未发生改变。本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带，条带数在1-6条之间。7条引物中P4、P7二条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余5条引物均有差异，对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论：P15基因第2外显子和K—ras基因第1外显子(包括第12、13密码子)可能不是乙酸镍作用的靶部位。在乙酸镍诱发细胞恶性转化过程中，基因组变得逐渐不稳定。     

硫化镍对16HBE细胞中基因的影响

目的 检测结晶型硫化镍(NiS)对K-ras基因和P15基因的改变及基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 采用限制性片段长度多态性分析和聚合酶链反应一单链构象多态性分析方法探查结晶型NiS在诱导16人气管上皮细胞(HBE)恶变过程中的K-ras基因Exonl第12密码子及第12密码子以外的密码子改变情况。采用PCR-SSCP分析方法探查结晶型NiS在诱导16HBE细胞恶变过程中的P15基因Exon2存在状况。采用随机扩增多态性技术来对结晶型NiS在诱导16HBE细胞恶变过程中的基因组不稳定性进行分析。结果 K-ras基因Exonl和P15基因Exon2未发生改变。本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带。其中P4、P5、P7两条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异，其余4条引物均有差异。对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论 P15基因第2外显子和K-ras基因第1外显子(包括第12、13密码子)可能不是结晶型NiS作用的靶部位。在结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中，基因组变得逐渐不稳定。     

肠炎沙门菌随机扩增多态性DNA分子分型

目的对不同来源的12株肠炎沙门菌分离株进行分子分型。方法分别提取不同菌株基因组DNA,建立和优化随机扩增多态性DNA（RAPD）反应体系,试用22条随机引物对不同菌株进行RAPD扩增,筛选清晰稳定的扩增条带做统计分析。结果筛选到OPG-03、OPG-06、OPG-07和OPG-13共4条随机引物具有鉴别作用,每一菌株均可扩增出4~10条DNA片段,大多数片段在100~2000bp之间,共扩增出42条RAPD条带,其中共有条带7条,多态性条带35条,多态性为83.3%。不同来源的肠炎沙门菌分离株之间的遗传相似系数在42.6%~100%之间,在0.850的相似性水平上可将12株肠炎沙门菌分离株分为5个不同的亚型。结论应用RAPD技术在分子水平上对肠炎沙门菌进行鉴别和分型具有简便、快速和辨别能力高的优势,对肠炎沙门菌的分子流行病学研究具有较好的应用前景。     

DNA甲基转移酶1基因低表达的人支气管上皮细胞基因组甲基化水平的体外试验

目的 观察人支气管上皮细胞(16HBE)的DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因低表达细胞株细胞周期和基因组整体甲基化水平的改变.方法 用慢病毒介导的RNA干扰方法将4个不同的短发夹RNA片段转染16HBE细胞,并用免疫印迹法(Western blotting)检测该细胞DNMT1蛋白表达水平,用流式细胞仪和5-甲基胞嘧啶(5-mC)免疫荧光法检测该细胞的细胞周期和细胞基因组整体甲基化水平.结果 16HBE-shDNMT1-4细胞株的DNMT1蛋白表达与对照组相比平均降低约44%,差异有统计学意义(P＜0.05),但细胞周期和基因组整体甲基化水平无明显改变.结论 成功建立DNMT1基因低表达的16HB细胞株,其细胞周期和基因组整体甲基化水平无明显改变.

Abstract：

Objective To construct DNA methyltransferase 1 (DNMT1) low expression 16HBE cell line and observe the variation of cell cycle and global genomic DNA methylation. Methods The method of Lenti-virus induced RNA interference was applied to introduce four different shRNA fragment into 16HBE cells. Flow cytometry and 5-mC immunofluorescence methods were used to observe the cell cycle and global DNA methylation status of DNMT1 low expression 16HBE cells. Results The DNMT1 protein relative expression level of 16HBE-shDNMT1-4 cell line was down regulated about 44%(P＜0.05 ) compared with the control. No obvious differences of cell cycle and global genome DNA methylation status were observed between the 16HBE and 16HBE-shDNMT1. Conclusion The DNMT1 gene low expression cell is successfully constructed, and there are no obvious changes happened on the cell cycle and global genomic DNA methylation.     

随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术用于蚊细胞的鉴定

本文应用随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术筛选出引物Pm,用此引物对淡色库蚊细胞系(CPP-512)、中华按蚊卵巢细胞系(Anso-242)、嗜人按蚊细胞系(Ana-104)、白纹伊蚊细胞株(C6/36)4种蚊细胞基因组DNA进行扩增,得出4个相异的多态性DNA扩增产物图谱,各自的DNA扩增条带的分子量(kb)为CPP-512:0.5、0.7、0.8、0.88、1.02、1.22;Anso-242: 0.5、0.88、1.02、1.13、1.22、1.5、2.1、2.4、2.5;Ana-104:0.64、0.98、1.2、1.28、1.4、1.53、1.8、2.3、2.6、3.3;C6/36:0.66、0.8、0.94、1.4、1.42、1.5、1.52、2.9。实验结果表明,随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术是一种简便易行、结果重复性好的先进生物学分类技术,引物Pm能满足同时鉴别3属蚊虫的4种蚊细胞的需要。     

三种伊蚊细胞系基因组多态性DNA的研究

目的：探讨3种伊蚊细胞系基因组多态性DNA。方法：应用3个引物，通过随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术（RAPD-PCR），对东乡伊蚊、埃及伊蚊和白纹伊蚊的细胞系基因组DNA进行扩增。结果：分别扩增出不同数量和分子大小的多态DNA图谱；3种伊蚊细胞的基因组DNA扩增产物除了有部分相同分子大小的DNA条带外，还有各自独特的DNA条带。结论：此方法简便、快速、精确，可用于蚊虫的分子分类研究。     

军团菌D-RAPD基因分型研究

〔目的〕建立军团菌的基因分型方法。〔方法〕采用D—RAPD技术 ,应用 6条简并随机引物对 5株军团菌 (包括 3株嗜肺军团菌 )进行基因分型研究。〔结果〕除引物 4 ,其余 5个随机引物均能对军团菌菌株扩增出特异性的DNA条带 ,其中引物 2的分型效果较好。用引物 2、引物 3两引物 ,引物 2、引物 5两引物 ,引物 3、引物 5两引物 ,分别对 5株军团菌DNA进行扩增 ,结果 3对引物在扩增条带的数量和长度上均能有效区分 5株军团菌。〔结论〕D—RAPD技术快速、简便 ,是在分子水平对致病微生物进行检测、发病机理分析、流行病学研究的理想方法。     

金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法优化

目的 优化金黄色葡萄球菌细菌基因组重复序列PCR(REP-PCR)指纹图谱分型方法,并在临床分离株分型研究中应用,为构建金黄色葡萄球菌同源性追踪体系提供依据.方法 试剂盒法提取金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923基因组DNA作为模板,根据参考文献设计REP引物,PCR扩增其基因组中靶序列.优化反应体系Mg~(2+)浓度、模板量、引物浓度和退火温度,以得到最佳指纹图谱.以优化好的REP-PCR方法对10株金黄色葡萄球菌临床分离株进行分型.结果 PCR反应体系Mg~(2+)浓度2.5 mmol/L,DNA模板量125 ng/25 μL,引物REP1R、REP2浓度各0.6 μmol/L,退火温度40℃时,指纹图谱条带最清晰、明亮;10株临床分离株指纹图谱均在0.5～1.0 kb之间出现1条相同条带,其中1～3,4,5,8,9号菌株图谱相同;7和10号菌株除在0.5～1.0 kb出现1条条带外,还在1.0～1.5 kb出现1条条带,在1.5～2.0 kb出现1条条带;6号菌株共产生5条条带,分别出现在0.5～1.0 kb(2条),1.0～1.5 kb(2条)和1.5～2.0 kb(1条).结论 成功建立优化的金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法;10株临床分离株用该法分为3型.     

硫酸镍对永生化人支气管上皮细胞系的恶性转化研究

目的 建立硫酸镍(NiSO4)对永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶性转化模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法 通过克隆形成率实验确定NiSO4对16HBE细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒：每隔20d染毒一次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成实验和棵鼠体内致瘤实验鉴定细胞恶性转化程度。结果 经NiSO4多次处理16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内形成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞瘤。结论 NiSO4具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

扶正解毒含药血清对硫化镍诱导人支气管上皮细胞转化的保护作用

目的探讨硫化镍诱导人支气管上皮(16HBE)细胞恶性转化作用以及扶正解毒汤(FJD)的保护作用,研究硫化镍致癌的分子机制以及扶正解毒汤对防癌治癌的作用。方法用不同浓度的硫化镍在体外多次处理16HBE细胞,利用刀豆凝集素A(ConA)凝集实验和软琼脂集落形成实验进行转化细胞的恶性鉴定;测定16HBE细胞内镍离子和自由基含量,同时加入扶正解毒含药血清,观察其保护作用。结果硫化镍可诱导16HBE细胞的恶性转化,转化细胞的生长速度加快、排列紊乱、失去接触抑制、呈交叉重叠生长、转化率呈剂量—效应关系。转化细胞可被低浓度ConA凝集并在软琼脂内生长。硫化镍暴露组细胞内镍离子和自由基含量明显增加。中、高剂量的扶正解毒含药血清可通过细胞内、外途径发挥抗氧化、清除自由基效应。结论硫化镍有较强的诱导16HBE细胞恶性转化的能力,具有致癌性。FJD血清对于硫化镍诱导的16HBE细胞恶性转化具有保护作用。     

致癌物诱导恶变细胞中线粒体高变区序列分析

目的检测苯并（a）芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘（反式-BPDE）及结晶型硫化镍（NiS）诱发永生化人支气管上皮细胞系（16HBE）恶性转化过程中线粒体DNA控制区序列变化。探讨线粒体DNA控制区在环境致癌物苯并（a）芘及硫化镍致癌作用中是否存在靶分子序列。方法 应用银染PCR-单链构向多态性（SSCP）方法及测序方法分析恶变细胞中线粒体DNA高变区的序列变化。结果 经反式-BPDE和NiS诱导恶变的人支气管上皮细胞系线粒体高变区均未发现异常改变。结论 线粒体基因控制区可能并非是化学致癌物诱发肺癌的靶序列。     

癌基因高表达人上皮细胞转化模型的构建及应用

目的 构建癌基因高表达人支气管上皮细胞模型并应用于致癌物诱导细胞恶性转化活性的检测.方法 在永生化人支气管上皮细胞株16HBE中依次导入人端粒酶催化亚基(hTERT)、癌基因H-RasV12或c-Myc或空白载体,构建细胞株16HBETR、16HBETM和16HBETV.检测所构建细胞株的生物学特性如细胞形态、细胞生长、染色体畸变等指标.用已知致癌物硫酸镍(NiSO4)和二氢二醇环氧苯并(a)芘(BPDE)多次染毒,利用软琼脂试验及荷瘤试验检测化学物诱导细胞转化的活性.结果 经过端粒酶活性测定以及蛋白印迹验证上述转基因16HBE细胞株均构建成功.癌基因H-Ras和c-Myc的表达分别使细胞的增殖加速30.3%和10.4%,但是细胞染色体的畸变率没有发生改变.癌基因高表达细胞株只在软琼脂中形成少数背景克隆,但不能在裸鼠皮下形成肿瘤.BPDE诱导16HBETR、16HBETM细胞发生恶性转化的间期分别为5周、11周,比对照组细胞16HBETV的20周分别提前了15周和9周;而硫酸镍诱导16HBETR、16HBETM细胞转化的间期分别为11周、14周.比对照组细胞的32周分别提前了21周和18周.结论 癌基因高表达的细胞转化模型可大大缩短试验间期,有望应用于环境致癌物的筛查及化学致癌机制的研究.     

氯化镉诱发人支气管上皮细胞恶性转化中hMSH2基因表达和序列的变化

目的 观察氯化镉(CdCl2)诱发人支气管上皮(16HBE)细胞系恶性转化过程中human MutS homologue 2(hMSH2)基因mRNA和蛋白动态变化的规律及其序列突变情况,进一步探讨CdCl2的致癌机制.方法 用反转录-聚合酶链反应(PT-PCR)和免疫组织化学(SP)法检测16HBE细胞、CdCl2恶性转化16HBE细胞系不同阶段(第5、15、35代细胞及成瘤细胞)hMSH2基因mRNA和蛋白的表达情况;并测序分析hMSH2基因第6、7、8、9、12外显子的序列情况.结果 随着转化代数的增加,hMSH2基因mRNA和蛋白的表达水平逐渐降低,到第35代细胞后表达明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01).hMSH2基因第8外显子在第1、2、7位点上均出现胸腺嘧啶T缺失,第9外显子在第20、182位点出现腺嘌呤A缺失,第12外显子在241位点上出现腺嘌呤A插入,所有的突变均为移码突变.结论 CdCl2的分子致癌机制可能与hMSH2基因的下调和突变有关.     

硫化镍对支气管上皮细胞中磷酸化细胞外信号调节蛋白表达的影响

目的通过结晶硫化镍在支气管上皮细胞(16HBE)中磷酸化细胞外信号调节蛋白(P-ERK1)的表达,探讨镍致癌的分子机制。方法用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交(W estern b lot)法检测16HBE细胞中P-ERK1的表达。结果硫化镍不能明显激活P-ERK1的表达,染镍组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论镍不能激活P-ERK1的表达,其机制尚不清楚,硫化镍有可能激活P38和JNK通路,从而直接或间接发挥致癌作用。