一种活性缺陷型小鼠端粒酶催化亚基过表达慢病毒载体的构建及功能初步测定

目的:构建含活性缺陷型小鼠端粒酶催化亚基(去除氨基酸702~712的mTERT,命名为mTERTΔ)基因的慢病毒载体,检测其表达和功能?方法:从先前构建的表达mTERT全长的pDC315-EGFP-mTERT质粒中,通过缺失突变PCR扩增小鼠mTERTΔ基因,构建真核表达载体GV287-EGFP/mTERTΔ?鉴定正确后将目的基因克隆入慢病毒载体pGC-LV,得重组载体pGC-LV/mTERTΔ-EGFP,采用Lipofectamine2000将其转染293T细胞,包装慢病毒颗粒LV-mTERTΔ-EGFP后感染神经干细胞和原代神经元,TRAP-PCR方法检测端粒酶活性,荧光显微镜观察目的片段表达和细胞增殖情况?结果:成功构建TERTΔ基因片段,测序证明重组慢病毒载体pGC-LV/mTERTΔ-EGFP构建成功?包装慢病毒颗粒LV-mTERTΔ-EGFP可以感染神经干细胞和神经元,端粒酶活性测试证明目的蛋白的端粒酶催化活性缺陷,抑制神经干细胞增殖,抑制内源性mTERT功能?结论:慢病毒载体LV-mTERT-EGFP构建成功,可以表达无活性mTERT片段?     

小鼠nNOS(AA1-133)基因慢病毒载体的构建及功能初步检测

目的:构建含nNOS(AA1-133)基因的慢病毒载体,检测其表达和功能?方法:采用RT-PCR扩增小鼠nNOS(AA1-133)基因,构建真核表达载体pIRES2-EGFP/nNOS(AA1-133)?鉴定正确后将目的基因克隆入慢病毒载体pGC-FU,得重组载体pGC-FU/nNOS(AA1-133),采用Lipofectamine 2000将其转染293T细胞,包装慢病毒颗粒后感染原代神经元,检测目的片段的表达和功能?结果:成功扩增小鼠nNOS(AA1-133)基因片段,测序证明重组慢病毒载体pGC-FU/nNOS(AA1-133)构建成功,包装后的慢病毒颗粒可以感染神经元,目的片段可在神经元中表达并与PSD95结合?结论:慢病毒载体pGC-FU/nNOS(AA1-133)构建成功,目的片段在原代神经元中可表达并发挥功能?     

腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞的比较

目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞（rMSCs）的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90％和71％,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79％和0．05％。扩增出1．2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。     

HRSP12慢病毒表达载体的构建及对宫颈癌HeLa细胞凋亡及增殖的影响

目的 构建热反应蛋白12（heat-responsive protein 12,HRSP12）慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装慢病毒颗粒并感染宫颈癌细胞HeLa,分析过表达的HRSP12对HeLa细胞凋亡和增殖的影响.方法 用反转录PCR扩增HRSP12全长编码顺序,构建慢病毒表达载体,利用人胚肾细胞HEK293T包装重组的慢病毒颗粒,感染HeLa细胞,用蛋白免疫印迹法检测剪切的半胱氨酸/天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）并用MTS比色法检测HeLa细胞增殖的情况.结果 编码全长HRSP12的cDNA片段为414bp,克隆至pWPI-linker载体成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装的慢病毒颗粒能够高效感染HeLa细胞,在细胞内表达Flag-HRSP12融合蛋白.HRSP12的过表达能够引起HeLa细胞caspase-3的剪切体增多,能够抑制HeLa细胞的增殖.结论 成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,初步结果表明,HRSP12可能具有诱导HeLa细胞凋亡、抑制细胞增殖的活性,为进一步研究HRSP12的生物学功能奠定了基础.     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs)。方法运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,MluⅠ、EcoRⅠ双酶切反应及测序分析加以鉴定。将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测。结果构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经MluⅠ和EcoRⅠ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致。三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装后慢病毒测定滴度为0.1×109~1×109TU/mL。pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞。结论成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性。     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs).方法 运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,Mlu Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切反应及测序分析加以鉴定.将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度.将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测.结果 构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经Mlu Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致.三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度为0.1×109～1×109TU/mL.pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞.结论 成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性.     

Iduna过表达慢病毒的构建、包装及鉴定

目的构建大鼠Iduna cDNA的慢病毒表达质粒(pCDH-Iduna),包装Iduna过表达慢病毒,以期上调原代神经元细胞中Iduna的表达。方法提取SD大鼠脑组织总RNA,利用RT-PCR的方法获取大鼠Iduna cDNA序列,将其插入慢病毒过表达载体pCDH质粒中,经酶切和测序验证重组质粒pCDH-Iduna。将pCDH-Iduna(以pCDH-EGFP为阴性对照)及包装质粒共转染HEK293T细胞,包装Iduna过表达慢病毒,显微镜下观察HEK293T细胞的形态变化,了解病毒包装情况。用慢病毒感染原代神经元细胞,Western blot检测靶细胞中Iduna的表达效率。结果琼脂糖凝胶电泳显示Iduna的PCR扩增产物大小为1068 bp左右片段,酶切鉴定可见重组质粒pCDH-Iduna有约1000bp左右片段释放,与预期相符,测序结果提示克隆正确。将Iduna过表达慢病毒表达载体pCDH-Iduna及包装质粒共同转染HEK293T细胞后,镜下可见细胞呈现出毒时特有的致细胞病变效应。Iduna过表达慢病毒及其对照病毒感染原代神经元细胞,免疫荧光观察感染率达70%后,Western blot检测病毒感染的神经元细胞中Iduna表达显著增加。结论成功构建大鼠Iduna慢病毒过表达载体pCDH-Iduna并获得具有良好感染效率的过表达慢病毒,后者能够显著上调原代神经元中Iduna的表达。     

MMP-2基因RNAi重组慢病毒的构建

目的 构建MMP-2基因RNAi重组慢病毒,以便客观研究该基因的作用.方法 筛选确定的MMP-2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pLVTHM载体连接产生LV2siMMP-2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV2siMMP-2,pCMV2dR8.74和pMD2G3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功构建MMP-2 siRNA的慢病毒载体LV2siMMP-2,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为8×1010 TU/L.结论 成功构建人MMP-2基因RNAi慢病毒载体,为后期研究MMP-2基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗奠定基础.     

携带BMP-2基因的慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞定向分化

目的构建含有人骨形态发生蛋白2（human bone morphogenetic protein 2, hBMP2）cDNA的重组慢病毒DNA，在293T细胞中进行慢病毒包装和表达检测。用慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞后，观察其向成骨细胞分化的情况。方法从GenBank中调出hBMP2基因序列，设计带有NheⅠ、AgeⅠ酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA，再反转录成cDNA，扩增出hBMP2 cDNA的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上，通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒DNA。将该重组慢病毒DNA同辅助质粒一起共感染293T细胞，通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞，通过碱性磷酸酶（AP）、钙沉积定量测定、Ⅰ型胶原蛋白表达观察干细胞向成骨细胞转化的情况。结果①扩增出1．2kb左右的hBMP2全长cDNA与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致；②成功构建和克隆了含hBMP2基因的慢病毒重组DNA（pHIV-hBMP2）；③对重组慢病毒DNA进行了成功包装和分析。④大鼠骨髓间质干细胞感染慢病毒后，碱性磷酸酶分泌增加，钙沉积增加，Ⅰ型胶原蛋白表达增加，成功向成骨细胞转化。结论重组慢病毒携带hBMP2基因感染大鼠骨髓间质干细胞可以使其向成骨细胞定向分化，为组织工程研究提供良好的种子细胞。     

重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶（IDO）基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应（PCR）方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况;采用Wester blot 检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108 TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值

目的 探讨降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值.方法 选取住院治疗的细菌性肺炎患者72例,根据治疗效果分为治疗有效组(有效组)47例和治疗无效组(无效组)25例,对治疗有效组和无效组中的降钙素酶原变化及影响肺炎治疗效果的危险因素进行分析.结果 有效组治疗后3天及治疗后7天的降钙素酶原显著低于无效组的患者(P＜0.05);年龄＞65岁、心功能≥3级、COPD、糖尿病、肺部双侧受累(X线示)、菌血症、感染性休克和3天内降钙素酶原变化率＜30％是影响细菌性肺炎治疗效果的危险因素;感染性休克、肺部双侧受累、3天内降钙素酶原变化率＜30％及心功能≥3级是影响细菌性肺炎治疗效果的独立危险因素.结论 测定降钙素原变化率对细菌性肺炎的疗效评估具有重要临床意义,可在临床推广应用.     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。