Kartogenin对兔滑膜间充质干细胞增值及成软骨分化的对比研究

【】 目的 探讨Kartogenin(KGN)对兔滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用方法 取6-10月龄新西兰大白兔(体重1.8~2.2kg)膝关节处滑膜分离培养SMSCs,通过形态学观察、流式细胞术对其进行鉴定.使用PELLET法,将聚丙烯管中的SMSCs团块分成3组,分别加入KGN,TGF-β3/BMP-2/地塞米松(Dexamethasone,DEX)以及二甲亚砜(DMSO)。通过比较增值速度、各组软骨微球的直径、重量,Ⅱ型胶原(免疫组织化学染色)表达,成软骨分化相关标志基因表达以及蛋白质合成量来评价KGN对SMSCs增值及成软骨能力的影响,结果 经鉴定,成功从兔膝关节滑膜分离出SMSCs。KGN对SMSCs增值能力弱于TGF-β3/BMP-2/DEX组,KGN组诱导产生的软骨微球直径最大,重量最重,均显著高于其他组(P<0.05),且Ⅱ型胶原合成量最多。qRT-PCR及Western Blot结果表明KGN组成软骨分和相关基因的表达水平最强,蛋白质合成量最大。结论 KGN促进SMSCs成软骨分化能力,但并没有增强SMSCs的增值能力。     

Kartogenin与TGF-β3/BMP-2/DEX对兔滑膜间充质干细胞增殖及成软骨分化的对比研究

目的：比较Kartogenin（KGN）与转化生长因子β3（TGF?β3）/骨形态发生蛋白2（BMP?2）/地塞米松（DEX）对兔滑膜间充质干细胞（synovial?derived mesenchymal stem cells, SMSCs）增殖及成软骨分化的作用。方法于6~10月龄新西兰大白兔膝关节处滑膜中分离培养SMSCs,并进行鉴定。设置KGN组（采用KGN干预）、T/B/D组（TGF?β3/BMP?2/DEX联合干预）及空白对照组,采用PELLET系统培养法分别培养各组细胞。通过比较各组细胞的增殖速度、软骨微球的直径和重量、Ⅱ型胶原（Col?Ⅱ）表达情况、成软骨分化相关标志基因表达及蛋白质合成量等指标来评价KGN对SMSCs增殖及成软骨能力的影响。结果成功从兔膝关节滑膜分离出SMSCs;KGN组的SMSCs增殖能力弱于T/B/D组,但KGN组软骨微球直径最大,重量最重,Ⅱ型胶原合成量最多,且均显著高于其他组;PCR及Western Blot结果表明KGN组成软骨分化相关基因的表达最强,蛋白质合成量最多。结论 KGN不能明显增强SMSCs的增殖能力,但对SMSCs的成软骨分化能力强于TGF?β3/BMP?2/DEX,将来可能应用于修复软骨损伤。     

TGF—β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]本研究通过选择对软骨细胞ECM合成具有促进作用的TGF-β1转染脂肪干细胞(ADSCs),观察转染后目的基因的稳定表达和对软骨细胞外基质(ECM)的两种重要组分:Ⅱ型胶原(type Ⅱ collage,ColⅡ)和aggrecan的合成,为构建新型的组织工程软骨提供实验依据.[方法]TGF-β1基因转染脂肪干细胞及阳性细胞克隆株的筛选;RT-PCR检测TGF-β1、纤连蛋白(fibronectin,FiN)、ColⅡ、Aggrecan的表达;Western-blot检测TGF-β1.[结果]RT-PCR结果显示:实验组(TGF-β1稳定转染组)的TGF-β1、FN、Col Ⅱ、Aggrecan的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01);Western blot检测实验组(TGF-β1稳定转染组)TGF-β1蛋白的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01).[结论]成功分离培养脂肪干细胞;以脂质体介导法将TGF-β1目的基因成功转染ADSCs,转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多,表明转染TGF-β1基因可以促使ADSCs向软骨细胞方向分化,从而为软骨组织工程提供新的思路和方法.     

滑膜间充质干细胞成纤维软骨分化条件初步探索

目的采用正交实验研究滑膜间充质干细胞(synovial derived MSCs,SMSCs)成纤维软骨分化的条件。方法 5只成年新西兰白兔,活检取滑膜组织。贴壁法获取SMSCs后采用流式细胞仪及成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定。根据预实验与文献综述寻找与SMSCs成纤维软骨分化可能相关的条件,采用缺失实验初筛必要条件后,TGF-β1、BMP-2、地塞米松、脯氨酸、柠檬酸(ascorbic acid,ASA)、丙酮酸、胰岛素+转铁蛋白+亚硒酸预混液、牛血清白蛋白、b FGF、间断静水压、BMP-7、IGF纳入正交实验,采用SPSS18.0统计软件设计L60(212)正交实验及表头,定义2水平条件,在SMSCs-三维小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)支架上诱导成纤维软骨分化。使用流式细胞仪计数,检测CD151+/CD44+细胞并记录SMSCs向纤维软骨分化的转换率,采用免疫组织化学染色,结合细胞形态、甲苯胺蓝染色、半定量RT-PCR检测SOX9、聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,ColⅠ)、ColⅡ、ColⅨ基因表达,进一步验证结果。检验指标rate是CD151+/CD44+细胞与高表达ColⅠ细胞的比例乘积。同时采用Pico Green Assay测量细胞总DNA量,以反映细胞扩增情况。正交实验结果采用直观观察和主体间方差分析方法,考虑部分因子间的1阶交互作用,组间差异采用LSD和q检验验证,使用Ⅲ型平方和校正模型,检验水准α=0.05。结果实验获取的细胞为SMSCs,细胞倍增时间为28 h。成纤维软骨分化过程中SMSCs-三维SIS支架体积5 d倍增,14 d后得到甲苯胺蓝染色阳性的细胞-支架复合物。正交实验结果直观分析示,TGF-β1对成纤维软骨分化转化率的作用最明显,BMP-7采用水平2有利于得到更高的转化率,但与BMP-2存在交互作用;其余第1区组水平值加和高于22.5的因子有DEX、ASA、ITS、转铁蛋白、b FGF,模型的相关性好。方差分析校正模型P=0.000,能够满足实验设计;截距P=0.000,说明各因子对因变量影响差异不完全相同。TGF-β1、ASA、b FGF、IGF对因变量调控作用较其他因子显著,差异有统计学意义,与直观观察结果相似。结论 TGF-β1、ASA、b FGF、IGF显著影响SMSCs成纤维软骨分化,通过合理调整上述因子浓度,可显著提高SMSCs成纤维软骨分化转化率;精确的调控条件和调控机制有待进一步探索。     

微小RNA-564基因下调对滑膜间充质干细胞成软骨分化的影响

目的探究下调微小RNA-564(miR-564)基因对滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用。 方法取第3代的人滑膜间充质干细胞(SMSCs)作为实验细胞,实验设计为3组：SMSCs空白对照组(空白组);miRNA抑制剂转染SMSCs对照组(对照组);miR-564抑制剂转染SMSCs实验组(实验组)。将3组SMSCs同时成软骨诱导培养,观察诱导后软骨细胞的组织形态,并检测诱导前7 d内的3组细胞增殖曲线,和软骨分化特异性基因和蛋白[Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)、母亲DPP同源物4(Smad4)];本次实验所有数据均采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。 结果甲苯胺蓝染色观察细胞形态与特点基本符合软骨细胞,实验组细胞数量更多,蓝染更明显;细胞增殖曲线表明实验组细胞增殖速度明显快于对照组(F＝0.842, P <0.01);RT-PCR检测与Western Blotting检测表明实验组软骨细胞分化特异基因和蛋白表达较对照组明显升高(F＝2274.75, F＝447.31, F＝30476.22; P <0.01),并且实验组TGF-BMP关键基因及蛋白Smad 4有所升高(F＝457.02, P <0.01)。 结论下调miR-564基因的表达可促进滑膜间充质干细胞向软骨细胞增殖与分化,并且有可能是通过作用于TGF-BMP通路实现。     

Wnt/β连环蛋白信号在人真皮成纤维细胞表型转化中的作用及机制

目的 了解Wnt/β连环蛋白信号在人正常真皮Fb向肌成纤维细胞(MFb)表型转化中的作用及机制.方法 采用酶消化法分离培养人正常皮肤真皮Fb.(1)实验1.按随机数字表法将细胞分为4组:对照组,采用无血清DMEM培养液(以下简称培养液)培养;TGF-β1组,用含10 ng/mL重组人TGF-β1(浓度下同)的培养液培养;Wnt3a组,用含150 ng/mL重组人Wnt3a(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+Wnt3a组,用含重组人TGF-β1和重组人Wnt3a的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法,检测Fb β连环蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平.(2)实验2.按照随机数字表法将细胞分为4组:对照组、TGF-β1组,处理方法均同实验1;SB415286(糖原合酶激酶3β阻断剂)组,用含10 μmol/L SB415286(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+ SB415286组,用含重组人TGF-β1和SB415286的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Fb α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;用免疫荧光细胞化学法检测α-SMA阳性表达情况.各项检测重复3次,对数据进行方差分析及LSD-t检验.结果 (1)实验1.①β连环蛋白的mRNA表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组和TGF-β1+Wnt3a组Fb组间比较,差异无统计学意义(F=0.302,P=0.823).②β连环蛋白的蛋白表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=16.713,P=0.001).与对照组表达水平(0.34±0.11)相比,TGF-β1组、Wnt3a组均显著上调(0.73±0.12、0.82±0.17,t值分别为3.028、3.727,P＜0.05或P＜0.01).TGF-β1+Wnt3a组(1.23±0.21)显著高于其余3组(t值分别为6.911、3.883、3.184,P值均小于0.01).③α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=31.830,P=0.001);与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为6.759、2.535,P＜0.05或P＜0.01);TGF-β1+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.532,P＜0.01).④α-SMA蛋白表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组、TGF-β1+ Wnt3a组分别为0.83±0.17、1.43±0.20、0.53±0.12、0.89±0.14(F=16.597,P=0.001).与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为4.582、2.291,P＜0.05或P ＜0.01);TGF-β1 +Wnt3a组低于TGF-β1组(t =4.123,P＜0.01).(2)实验2.①α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=34.101,P=0.001).SB415286组明显低于对照组(t =2.511,P＜0.05),TGF-β1+SB415286组明显低于TGF-β1组(t=3.587,P＜0.01).②α-SMA蛋白表达水平:4组细胞比较,差异有统计学意义(F =11.381,P=0.003).SB415286组显著低于对照组(t=2.364,P＜0.05),TGF-β1+ SB415286组低于TGF-β1组(t=2.556,P＜0.05).③免疫荧光细胞化学法检测显示,对照组Fb α-SMA表达微弱;TGF-β1组α-SMA表达较对照组显著增强(t =11.198,P＜0.01);SB415286组表达较对照组减少,TGF-β1+ SB415286组表达较TGF-β1组显著减少(t=5.902,P＜0.01).结论 Wnt/β连环蛋白信号可能参与Fb细胞表型转化,并且对TGF-β1所介导的促转化效应起负性调控作用.     

PPARβ/δ激动剂联合人自体关节液来源的间充质干细胞治疗骨关节炎的实验研究

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)β/δ激动剂(GW0742)对人关节液来源的间充质干细胞(hSF-MSC)成软骨分化及炎性环境下炎症因子释放的影响。方法抽取膝关节骨关节炎患者患侧关节腔内的关节液并分离培养及鉴定。设置空白对照组(不完全成软骨诱导培养基)、转化生长因子(TGF)-β1组(含浓度为10ng/mL TGF-β1的成软骨诱导培养基)、TGF-β1+GW0742组(含10ng/mL TGF-β1、1μmol/L GW0742的成软骨诱导培养基)及GW0742组(含浓度为1μmol/L GW0742的成软骨诱导培养基),采用Pellet法诱导hSF-MSC成软骨分化。通过比较各组成软骨分化相关标志物SOX-9基因表达和蛋白合成以及阿利新蓝、甲苯胺蓝染色等来评估GW0742对hSF-MSC增殖及成软骨分化能力的影响。另设置空白对照组(20%关节液+80%完全培养基)、hSF-MSC组(20%关节液+80%完全培养基+1×105个/mL hSF-MSC)、hSF-MSC+GW0742组(20%关节液+80%完全培养基+1μmol/L GW0742+1×105个/mL hSF-MSC),通过比较第1、3天各组培养液中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α表达来评估GW0742+hSF-MSC组免疫抑制能力。结果应用直接贴壁法成功从炎性关节液中分离培养hSF-MSC。TGF-β1、TGF-β1+GW0742及GW0742对hSF-MSC增殖能力无明显影响;聚合酶链反应(PCR)和Western Blot检测表明,GW0742组hSF-MSC成软骨分化作用最为明显;甲苯胺蓝和阿利新蓝染色显示,GW0742组hSF-MSC能分泌较多的蛋白聚糖,且较TGF-β1+GW0742组细胞分泌的蛋白聚糖更为致密;hSF-MSC+GW0742组炎症因子表达显著低于hSF-MSC组。结论 PPARβ/δ激动剂GW0742不仅能提升hSF-MSC成软骨分化能力,还能增强hSF-MSC抗炎能力。     

低氧诱导因子1α及2α在人BMSCs成软骨分化中的表达规律

目的通过诱导人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)成软骨分化,观察低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、HIF-2α在分化过程中的表达趋势,为阐明HIF参与调控成软骨分化机制提供依据。方法对已消化的悬浮hBMSCs进行离心沉淀,形成细胞微球。将细胞微球分为2组,对照组加入含2%FBS的H-DMEM培养基,成软骨诱导组加入软骨诱导液,于低氧(2%O2)条件下培养。培养3周后行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,培养1周行Western blot检测HIF-1α、HIF-2α蛋白表达,培养1、2、3周行实时定量PCR检测成软骨分化关键转录因子及相关标志基因表达。结果甲苯胺蓝染色示,对照组染色细胞核整体分布稀疏,而成软骨诱导组分布致密;成软骨诱导组细胞外基质染色明显较对照组深。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示阳性信号主要位于细胞质内;与成软骨诱导组相比,对照组细胞核分布较稀疏且着色浅。Western blot检测示,培养1周成软骨诱导组HIF-1α和HIF-2α蛋白相对表达量均显著低于对照组(t=8.345,P=0.001;t=7.683,P=0.002)。实时定量PCR检测示,与对照组比较,成软骨诱导组HIF-1αmRNA相对表达量在培养1周时降低、2周时显著升高,差异均有统计学意义(P0.05);3周时两组比较差异无统计学意义(P0.05)。成软骨诱导组培养各时间点HIF-2αmRNA相对表达量均显著低于对照组,Sox-9 mRNA相对表达量均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P0.01)。培养过程中,Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原表达呈逐渐增加趋势,第2、3周时两者的mRNA相对表达量显著高于对照组(P0.05)。而成软骨诱导组多聚蛋白聚糖mRNA相对表达量在各时间点均高于对照组(P0.05)。结论 HIF-1α参与诱导hBMSCs成软骨分化过程,但HIF-2α表达在该分化过程中受抑制。     

膝骨关节炎滑膜间充质干细胞多向分化及免疫抑制能力

目的观察骨关节炎(OA)患者膝关节滑膜来源的间充质干细胞(SMSCs)多向分化能力以及免疫抑制能力。方法无菌环境下通过关节镜取出中山大学孙逸仙纪念医院10例OA患者膝关节滑膜组织,分离培养出SMSCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,通过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化培养基对SMSCs诱导分化,于诱导第21天分别行茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色。将SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的人外周血单核细胞(PBMC)进行共培养,通过流式细胞术对PBMC的增殖率进行检测,组间比较通过方差分析总体差异后再通过Bonferroni法进行组间两两比较。结果OA患者SMSCs第3天开始进入对数增长期,第7天细胞增殖进入平台期。SMSCs经过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化后,茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色均为阳性。SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的PBMC进行共培养5 d后,阴性对照组PBMC增殖率为(3.8±0.4)%,几乎不增殖,阳性对照组PBMC增殖率为(80.9±8.1)%,实验组PBMC的增殖率为(52.3±5.1)%,实验组与阳性对照组的差异具有统计学意义(t=8.97,P0.01)。结论 OA患者SMSCs同样具有多向分化能力和免疫抑制能力,可作为组织工程理想的种子细胞来源。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子 -βⅠ、Ⅱ型受体的表达及调控

目的：了解瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)－βⅠ、Ⅱ型受体的表达及TGF－β1,β3对其的影响。方法；体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFB）和正常皮肤成纤维细胞（NFB），利用免疫组化及计算机图像分析系统测定TGF-βⅠ、Ⅱ型受体含量。结果：KFB胞浆内阳性信号明显强于NFB（P＜0．05）；经TGF－β1,β3处理组胞浆内阳性信号差别均不明显（P＞0．05）。结论：KFB存在高表达的TGF－βⅠ、Ⅱ型受体；TGF－β1,β3均能促进KFB TGF－βⅠ、Ⅱ型受体的表达。     

人间充质干细胞成软骨分化中DNA甲基化调控X型胶原表达

目的在人间充质干细胞(hMSCs)诱导成软骨分化过程中,探讨X型胶原与其启动子甲基化状态之间的关系,为揭示表观遗传学调控参与成软骨分化的可能机制提供理论基础。方法收集6例来源于深圳市第二人民医院脊柱外科患者的腰椎椎体骨髓间充质干细胞为研究对象,运用离心沉淀法进行细胞微球培养,用含有转化生长因子β3(TGF-β3)及2%胎牛血清(FBS)的高糖细胞培养基(DMEM)进行成软骨诱导并作为实验组(3例);在该诱导液中加入5’-氮杂胞苷(5’-AZA)作为诱导组(3例);不含TGF-β3的2%胎牛血清的高糖细胞培养基的为对照组(3例)。在分化3 d后进行定量PCR,检测成软骨分化相关基因表达以及X型胶原启动子区域甲基化改变情况,采用方差分析及多样本间的均数比较(q检验)分析基因水平表达差异;组间DNA甲基化水平差异采用Kruskal-Wallis检验统计学差异。结果通过生物信息学预测X型胶原的启动子区域可能存在CpG富集区域,在含有5’-氮杂胞苷的成软骨诱导分化过程中,X型胶原表达逐渐上升,与对照组相比差异具有统计学意义(F=37.526,P 0.001),而X型胶原启动子区域的甲基化水平与对照组相比逐渐下降,差异也具有统计学意义(F=11.066,P0.01)。结论在体外诱导人间充质干细胞成软骨分化过程中,参与维持X型胶原启动子甲基化状态降低,分化能力得到增强;提示表观遗传学调控方式是影响干细胞分化方式之一。     

基质金属蛋白酶9及TGF-β1 mRNA和蛋白在骨关节炎中的表达

目的 TGF-β1对骨关节炎(osteoarthritis,OA)关节软骨起保护作用,探讨OA中基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、TGF-β1 mRNA和蛋白表达的相关性,为临床治疗OA寻找有效的干预靶点提供理论依据。方法取自愿捐赠的关节软骨及滑膜标本,其中OA患者60例(实验组),外伤截肢、交叉韧带断裂、盘状软骨损伤与半月板损伤患者20例(正常对照组)。行HE染色观察关节软骨与滑膜的病理组织学改变,免疫组织化学染色观测MMP-9及TGF-β1蛋白表达,原位杂交技术检测MMP-9及TGF-β1 mRNA表达;并进行相关性分析。结果 HE染色显示实验组关节软骨细胞固缩、坏死、排列紊乱,细胞外基质断裂,关节滑膜细胞肥大增生、淋巴细胞和单核细胞浸润,多数小血管增生;正常对照组软骨细胞排列整齐、基质染色均匀,滑膜组织无慢性炎症表现、无明显增生。两组均可见MMP-9、TGF-β1 mRNA和蛋白阳性表达,阳性细胞包括软骨细胞、滑膜衬里层细胞及滑膜下层的血管内皮细胞、成纤维细胞、炎性浸润细胞等。实验组MMP-9及TGF-β1 mRNA和蛋白表达均高于正常对照组(P<0.01)。实验组MMP-9 mRNA与蛋白表达成正相关(r=0.924,P=0.000),TGF-β1 mRNA及蛋白表达亦成正相关(r=0.941,P=0.000);实验组MMP-9及TGF-β1蛋白表达成负相关(r=—0.762,P=0.000),MMP-9 mRNA及TGF-β1 mRNA表达成负相关(r=?0.681,P=0.000)。结论 OA中TGF-β1的高表达下调了关节软骨与滑膜中MMP-9的表达,对OA关节软骨起保护作用,从而延缓OA进展。     

CD105+滑膜间充质干细胞成软骨能力

目的 分选CD105+滑膜间充质干细胞(SMSCs),观察其增殖和向软骨细胞分化的能力.方法 酶消化滑膜组织分离SMSCs,流式细胞仪分选CD105+ SMSCs;第3、7天采用WST-1测定SMSCs的增殖能力;软骨诱导21 d进行免疫组织化学染色,检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原.结果 酶消化获取的SMSCs为星形或梭形,分选后SMSCs形态无明显变化.免疫荧光显示分选组CD105+细胞较未分选组明显增多.WST-1增殖检测提示两组细胞吸光度值3 d(0.376±0.012、0.329±0.012)、7 d(0.581±0.009、0.524±0.007)比较差异有统计学意义(P＜0.05).成软骨诱导培养21 d后,分选组甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色均较未分选组多且深,说明CD105+ SMSCs合成更多软骨细胞外基质.结论 CD105+ SMSCs具有较强的增殖和成软骨能力,CD105+ SMSCs可成为软骨组织工程良好的种子细胞.     

蛋白激酶C在高糖诱导近端小管上皮细胞细胞外基质及转化生长因子β1高表达中的作用

目的：探讨高糖作用下近端肾小管上皮细胞蛋白激酶C（PKC）活性的变化,以及PKC 激活对近端肾小管上皮细胞外细胞基质（ECM）及转化生长因子β1(TGF-β1）表达的调控作用。方法：采用LLC－PK1细胞株,将细胞分为正常对照组NG(5.5mmol/L D－葡萄糖）、高糖组HG（25mmol/L D-葡萄糖）、高渗组HM（25mmol/L甘露醇）、NG＋PKC抑制剂（PKCI）组（10μmol/L chelerythrine chloride)、HG＋PKCI组、HM＋PKCI组。分别检测各组细胞PKC活性,并运用原位杂交和免疫细胞化学法检测各组Ⅳ胶原（Co1Ⅳ）、纤连蛋白（FN）及TGF-β1mRNA和蛋白表达。结果：HG组细胞胞膜PKC活性较NG组升高3．3倍。HG组细胞Co1Ⅳ、FN及TGF－β1mRNA和蛋白水平均较NG组显著升高,HM组无此变化。高糖导致的ECM和TGF－β1高表达可被PKC抑制剂chelerythrine chloride所阻断。结论：由高糖诱导的近端小管上皮细胞ECM和TGF－β1高表达是通过激活PKC通路所介导。     

骨髓基质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对兔骨髓基质干细胞(BMSC)体外增殖、分化为软骨样细胞的影响。方法 24只兔等分为4组,抽取骨髓,分离基质干细胞,体外连续传代培养,A组为基础培养液,B、C、D组分别加入TGF-β1、b-FGF、TGF-β1和b-FGF,观察细胞生长情况及形态特征,阿新蓝染色,Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果B组细胞形态变化、C组增殖速度、D组增殖速度及形态变化均较A组加快。阿新蓝染色:原代阴性,传代细胞,A、c组淡染或阴性,B组呈蓝色,D组呈深蓝色。Ⅱ型胶原mRNA表达:A、c组未检出,B组阳性,D组有较强阳性表达。结论 兔BMSC在体外适当条件下可分化为软骨样细胞,TGF-β1能诱导BMSC向软骨方向分化,b-FGF不仅能促进BMSC的增殖,且能延长其生存时间。     

封闭式负压引流技术治疗糖尿病足对创面组织中TGF-β_1及其受体表达的影响研究

目的探讨封闭式负压引流技术(vaccum sealing drainage,VSD)治疗糖尿病足后,创面组织中TGF-β_1及其Ⅱ型受体(typeⅡof TGF-β-receptor,TβRⅡ)表达的变化,分析VSD加快创面愈合的机制。方法将2012年5月—2016年5月收治的80例糖尿病足患者纳入研究,随机分为两组(n=40)。采用相同基础治疗的同时,VSD组创面给予VSD治疗,对照组给予外用油纱换药治疗。两组患者性别、年龄、病程、体质量、足部溃疡面积以及Wagner分级比较,差异均无统计学意义(P0.05),具有可比性。记录两组患者创基准备时间、住院时间;治疗前及治疗后7 d时取创面组织行免疫组织化学染色,计算TGF-β_1、TβRⅡ表达阳性指数。结果 VSD组患者经1~3次VSD治疗后行植皮术,平均2次;对照组患者经1~6次换药后行植皮术,平均4次。VSD组患者创基准备时间及住院时间均较对照组明显缩短,比较差异有统计学意义(t=–13.546,P=0.036;t=–12.831,P=0.041)。两组植皮均顺利成活,创面愈合良好。免疫组织化学染色示,治疗前VSD组TGF-β_1、TβRⅡ表达阳性指数分别为5.3±2.4、14.0±2.6,对照组分别为4.4±2.3、14.7±3.1,比较差异无统计学意义(t=1.137,P=0.263;t=1.231,P=0.409)。治疗7 d后,VSD组TGF-β_1、TβRⅡ表达阳性指数分别为34.3±2.9、41.7±3.7,对照组分别为5.8±2.0、18.1±2.5,比较差异有统计学意义(t=–35.615,P=0.003;t=23.725,P=0.002)。结论 VSD可提高糖尿病足创面组织中TGF-β_1、TβRⅡ的表达,促进肉芽组织生长,加快创面愈合。     

软骨前体细胞的分离鉴定及IL-1β对其成软骨分化的影响

目的对正常软骨中的软骨前体细胞进行分离、鉴定,并对不同浓度IL-1β对软骨前体细胞的成软骨分化影响进行研究。方法取正常成年新西兰大白兔的软骨细胞,通过纤连蛋白粘连分离出软骨前体细胞,采用流式细胞仪对其细胞表型进行鉴定,倒置相差显微镜观察其克隆增殖,并行成骨、成脂、成软骨三系分化观察。培养软骨前体细胞团并分为4组,分别加入普通H-DMEM培养基(A组)、成软骨诱导分化培养基(B组)、成软骨诱导分化培养基+0.1 ng/mL IL-1β(C组)、成软骨诱导分化培养基+1.0 ng/mL IL-1β(D组),培养3周行组织学、生物化学、实时荧光定量PCR等检测,观察IL-1β的影响。结果在正常软骨细胞中存在软骨前体细胞,经鉴定有干细胞表型阳性表达,有与干细胞相似的克隆增殖能力及分化能力。HE染色示,C、D组中细胞团块较B组明显减小,细胞呈肥大样改变。番红O、Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原染色示,B组较A组染色深,C、D组均浅于B组,D组浅于C组。生物化学成分测定示,C、D组的总胶原、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)相对含量及GAG/DNA比值均显著低于B组,D组显著低于C组,差异均有统计学意义(P0.05);C、D组DNA相对含量均显著高于B组(P0.05),但C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示,C、D组Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox-9 mRNA相对表达量均显著低于B组,D组显著低于C组,差异均有统计学意义(P0.05);而C、D组Runx-2和MMP-13mRNA相对表达量均显著高于B组,D组显著高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论在正常软骨组织中存在一种有干细胞特性的软骨前体细胞,其有克隆和潜在分化的能力。IL-1β对软骨前体细胞成软骨分化有抑制作用,并有促进成骨分化的可能。     

TNF-α诱导滑膜MSCsMSCs与BMSCs凋亡的比较研究

目的通过比较TNF-α诱导滑膜MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs)与BMSCs凋亡,探讨SMSCs的抗凋亡能力。方法取患者自愿捐赠的滑膜组织及骨髓,分别采用组织贴壁法和密度梯度离心法分离培养SMSCs和BMSCs并传代,取第3~5代细胞行细胞免疫表型及三系分化鉴定后进行实验。实验分为4组,其中SMSCs、BMSCs凋亡诱导组(SMSCs、BMSCs实验组)用20 ng/m L TNF-α和10μg/m L放线菌酮对细胞进行凋亡诱导,其对应对照组以正常培养基培养。倒置相差显微镜下观察凋亡诱导细胞形态变化;培养24 h取各组细胞,采用细胞计数试剂盒8及流式细胞术检测细胞存活率及凋亡率,Western blot法检测细胞半胱氨酶天冬氨酶蛋白酶降解产物8、3(Cleaved Caspase-8、3)的表达。结果经细胞表型及三系分化鉴定培养获得的细胞均符合MSCs鉴定标准。倒置相差显微镜观察示,随凋亡诱导培养时间延长,两实验组细胞形态及生长均较对应的对照组差。培养24 h,两对照组细胞存活率均为100%,未见细胞凋亡;SMSCs、BMSCs实验组细胞存活率分别降至60.13%±8.63%及46.55%±10.54%,均显著低于对照组(P0.05),SMSCs实验组细胞存活率显著高于BMSCs实验组(t=3.152,P=0.006)。SMSCs和BMSCs对照组细胞凋亡率分别为1.12%±0.24%和1.35%±0.31%,两实验组分别增高至36.54%±8.63%及53.77%±11.52%,均显著高于对照组(P0.05),且SMSCs实验组细胞凋亡率显著低于BMSCs实验组(t=3.785,P=0.001)。两对照组细胞Cleaved Caspase-8、3蛋白几乎不表达,且SMSCs实验组和BMSCs组细胞Cleaved Caspase-8、3蛋白明显高表达;其中BMSCs实验组明显高于SMSCs实验组(t=13.870,P=0.000;t=7.309,P=0.000)。结论经TNF-α诱导培养,SMSCs凋亡明显少于BMSCs,具有更强的抗凋亡能力。     

霉酚酸酯对IgA肾病患者血清和尿液TGF-β1表达的影响

目的 探讨IgA肾病(IgAN)患者血清、尿液TGF-β1表达以及霉酚酸酯(mycophenolate mofetil,MMF)对其表达的影响,揭示MMF治疗IgAN可能的机制.方法 用ELISA法检测健康对照组19例(Ⅰ组)、与MMF组匹配初诊未治疗IgAN 39例(Ⅱ组)、MMF治疗组48例(Ⅲ组)血清、尿液TGF-β1的水平,并比较各组表达差异性.结果 血清中TGF-β1的表达,Ⅱ组较Ⅰ组表达增加(P＜0.05);Ⅲ组较Ⅱ组表达下降(P ＜0.0001).尿液中TGF-β1的表达,Ⅱ组、Ⅲ组均较Ⅰ组表达增加(P＜0.05);Ⅲ组较Ⅱ组表达下降(P＜0.05).IgAN患者血清TGF-β1的表达与病理级别、尿蛋白排泄呈正相关(P=0.044、0.001),尿液TGF-β1的表达与GFR呈负相关(P=0.012),与病理级别、血肌酐、尿蛋白排泄呈正相关(P=0.01、0.013、＜0.0001).血清TGF-β1与尿液TGF-β1的表达呈正相关(P=0.001).IgAN LEE分级≤3级与＞3级的患者相比,后者血清、尿液TGF-β1表达增加,差别有统计学意义(P =0.049,0.028).MMF治疗组疗程3～6个月与≥6个月的患者相比,后者血清、尿液TGF-β1表达下降,差别有统计学意义(P=0.001,0.026).结论 IgAN患者血清、尿液TGF-β1表达显著增加,并且其表达水平与肾功能进展及严重程度等密切相关,MMF可显著下调IgAN患者血清、尿液中TGF-β1表达.因此,血清、尿液TGF-β1可作为预测IgAN疾病进展及评估MMF疗效的重要指标.     

TGF-β1在大鼠睾丸支持细胞的作用及对紧密连接的影响

目的:探讨TGF-β1在大鼠睾丸支持细胞增殖和凋亡中的作用以及对紧密连接相关蛋白基因表达的影响。方法:体外分离和培养大鼠睾丸支持细胞,分空白对照组、TGF-β1受体阻滞剂组、TGF-β1刺激组和TGF-β1+受体阻滞剂组共4组。CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;建立支持细胞原代双室培养模型,应用跨上皮电阻测定法(TER)检测单层细胞两侧跨细胞电阻值;RT-PCR和Western印迹检测支持细胞闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白1(ZO-1)和紧密连接蛋白Ⅱ(ClaudinⅡ)的相对表达量。结果:各组细胞增殖组间差异有统计学意义(F=5.05,P0.05),TGF-β1刺激组与空白对照组相比细胞增殖率增加(P0.05),而TGF-β1+受体阻滞剂组与TGF-β1刺激组相比细胞增殖率降低(P0.05)。各组细胞凋亡率组间差异无统计学意义(F=1.13,P0.05);各组细胞间TER差异有统计学意义(F=38.99,P0.01),与空白对照组比较TGF-β1刺激组TER降低(P0.01),与TGF-β1刺激组比较,TGF-β1+受体阻滞剂组和TGF-β1受体阻滞剂组细胞TER升高(P均0.01);各组支持细胞中ZO-1、ClaudinⅡmRNA及蛋白在各组中的表达量差异均无统计学意义(F_(mRNA)=0.49,0.93,P均0.05;F_(蛋白)=0.28,1.31,P均0.05),而Occludin mRNA及蛋白在各组中的表达量差异均有统计学意义(F_(mRNA)=6.86,F_(蛋白)=6.87,P均0.05);与空白对照组相比,TGF-β1刺激组Occludin mRNA及蛋白表达明显降低(P均0.01),而加入受体阻滞剂后,Occludin mRNA及蛋白表达明显回升(P均0.05)。结论:TGF-β1对睾丸支持细胞的增殖有促进作用,并能通过调节Occludin蛋白的表达而影响大鼠支持细胞间的紧密连接。