有序聚甲基丙烯酸甲酯电纺纳米纤维作为大鼠背根神经元负载支架的可行性研究

目的探讨具备有序或无序拓扑结构的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)电纺纳米纤维材料作为原代大鼠背根神经元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)负载支架的可行性。方法构建具有随机或有序拓扑结构的PMMA电纺纳米纤维;利用PMMA薄膜组作为对照,分离纯化大鼠原代DRGn,利用慢病毒技术转染绿色荧光蛋白基因作为显色手段,分析在随机及有序纤维支架上DRGn神经突的生长能力以及神经突和电纺纤维的依存关系。结果大鼠原代DRGn能够顺利在PMMA材料上贴壁并生长,在培养第2天,较之平面环境,DRGn未见平均神经突数量及神经突长度的明显区别,电纺纤维的拓扑结构对于DRGn神经突的生长具有明显的接触引导作用,在有序电纺纤维上DRGn能够生成和基质纤维延伸方向一致的神经突;通过GFP表达与背景纤维的合成图,发现在随机或有序电纺纤维上,DRGn神经突均能循纤维向前生长,但相比随机纤维,神经突似乎更倾向于接受有序电纺纤维的引导。结论有序PMMA电纺纳米纤维具有作为神经损伤后大鼠DRGn负载支架的潜力。     

有序排列聚甲基丙烯酸甲酯电纺纳米纤维作为大鼠原代雪旺细胞负载支架的可行性研究

目的:探讨有序聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)电纺纳米纤维作为雪旺细胞负载支架的潜力。方法:构建有序PMMA电纺纳米纤维,以随机PMMA电纺纤维作为对照,纯化大鼠原代雪旺细胞并在纤维结构上进行培养,利用慢病毒技术转染绿色荧光蛋白基因作为显色手段,观察有序PMMA电纺纤维的拓扑线索在定向引导SCs生长上的作用,分析细胞对纤维结构的依从性;并在此基础上,持续动态观察雪旺细胞对有序电纺纤维的依从性,从而评价有序PMMA电纺纳米纤维作为神经损伤后植入性雪旺细胞负载支架的潜力。结果:雪旺细胞在随机及有序PMMA电纺纤维上均能顺利贴壁并生长;较之随机电纺纤维,雪旺细胞对有序纤维具有更好的依从性,能够受其接触引导形成和纤维走行方向一致的定向生长,并能够生成更长的细胞突起(P=0.0079);动态的观察则进而显示SCs对有序电纺纳米纤维的拓扑线索能维持稳定的依从性。结论:有序PMMA电纺纳米纤维具有作为神经损伤后植入性雪旺细胞负载支架的潜力。     

聚甲基丙烯酸甲酯静电纺丝纳米纤维对大鼠原代星形胶质细胞生长的影响

目的探讨聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate, PMMA）电纺纳米纤维的拓扑线索对于大鼠原代星形胶质细胞生
长能力及方式的影响,为脊髓损伤后植入性细胞支架的构建提供前期基础。方法构建具有随机或有序拓扑结构的PMMA电
纺纳米纤维;分离并纯化大鼠原代星形胶质细胞;利用PMMA薄膜作为对照,利用慢病毒技术转染绿色荧光蛋白基因作为显色
手段,分析在星形胶质细胞不同拓扑结构纤维支架上的生长特点。结果随机及有序PMMA电纺纤维均能支持星形胶质细胞
的生长,其拓扑结构能够显著影响星形胶质细胞的生长方式,在有序纤维系统上细胞突起的生长方向能够和基质纤维的延伸方
向保持高度一致;通过绿色荧光蛋白和基质纤维的合成图,发现在两种拓扑结构的纤维系统上,细胞突起均能依附在纤维上向
远处延伸;较之PMMA薄膜,在有序纤维上的星形胶质细胞能生成更长的细胞突起（P<0.01）,而在随机纤维上的细胞则形成更
短的突起（P<0.01）。结论PMMA电纺纳米纤维的拓扑结构能够显著影响大鼠原代星形胶质细胞生长能力及方式,其作为植
入性支架具有减轻脊髓损伤后损伤灶胶质瘢痕形成的潜在价值。
     

雪旺细胞及神经干细胞与Chitosan-PLGA导管的细胞相容性

目的研究雪旺细胞(SCs)、神经干细胞(NSCs)与内置纵行排列纳米纤维丝的静电纺丝壳聚糖-聚羟基乙酸(Chitosan-PLGA)纳米导管材料的细胞相容性,探讨细胞在导管材料上的黏附及定向生长情况。方法实验分为SCs组、NSCs组、SCs-NSCs共培养组,3组细胞分别与Chitosan-PLGA纳米导管材料复合培养,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞存活率,扫描电镜下观察SCs、NSCs在Chitosan-PLGA上的生长。结果细胞存活率排序由高至低依次为共培养细胞组、SCs组、NSCs组。SCs及NSCs能贴附在Chitosan-PLGA内置纳米纤维丝上生长并沿纤维丝定向生长。结论雪旺细胞及神经干细胞共培养可促进细胞与Chitosan-PLGA材料的相容性。内置纵行排列的纳米纤维丝有引导细胞定向生长与迁移的作用。     

雪旺细胞与脊髓前角运动神经元共培养对其功能的影响

目的 探讨脊髓前角运动神经元在间接共培养情况下是否可以对雪旺细胞(Schwann cells,SCs)的功能产生影响.方法 从孕15 d的SD胎鼠的脊髓内分离培养脊髓前角运动神经元;从新生1 d的SD大鼠的坐骨神经内分离培养SCs.将上述两种细胞分别种植于Transwell培养板的上、下室内,通过细胞计数、3H-TdR掺入观察SCs的存活与增殖情况,Western blot检测SCs表达脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)情况.然后将经共培养处理和未经共培养处理的SCs分别与经1%低氧预处理4 h的脊髓前角运动神经元共培养72 h,通过细胞计数、MTT法检测脊髓前角运动神经元存活情况.结果共培养组SCs增殖指数为(24 197.6±739.8),明显优于直接培养组的(17 451.2±512.7)(P＜0.05),共培养组SCs表达BDNF的水平明显高于直接培养组(P＜0.05).缺氧后处理组脊髓前角运动神经元存活数量及MTT分别为(89.6±2.3)、(0.238 4±0.006 7),分别优于对照组的(66.4±4.8)、(0.196 2±0.005 9)(P＜0.05).结论 在间接共培养情况下,脊髓前角运动神经元可以促进SCs的增殖及分泌BDNF等功能;SCs对缺氧后的脊髓前角运动神经元具有更明显的保护作用.利用Transwell进行间接共培养,可以获得活化状态的SCs.     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

静电纺纳米纤维支架在组织工程中的研究进展

静电纺丝技术(简称"电纺")是一种在高压电场作用下形成超细纤维的聚合物加工技术。通过控制电纺过程的各种参数可以制得性能不同的纳米纤维支架。本文主要介绍了电纺纳米纤维支架在皮肤、血管、骨、肌腱、神经等组织工程领域中的应用研究进展。     

半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对缺血性损伤后神经元形态的作用

目的:观察半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对原代神经元缺血性损伤后形态变化的作用。方法:在不同浓度孟鲁司特存在条件下,以缺氧缺糖(OGD)2 h和再灌(R)24 h(OGD/R)诱导大鼠原代神经元及皮层混合培养细胞的神经元损伤;以免疫染色法检测神经元数量、胞体大小、胞体总神经突起数量、一级神经突起数量、长度及其分支数量等指标,观察神经元形态的变化。结果:OGD/R可明显减少神经元的数量,显著改变神经元的形态。而孟鲁司特(0.0001～1μmol/L)能减轻单独神经元培养中OGD/R诱导的神经元数量减少,抑制一级神经突起分支数量增加;在混合培养中,孟鲁司特(0.0001～0.1μmol/L)增加OGD/R后一级神经突的长度,减少神经突起数量以及一级神经突起分支数量。结论:半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对大鼠原代神经元缺血性损伤有保护作用。     

高纯度大鼠胚胎背根神经节神经元的培养与鉴定

目的：建立一种取材容易、存活时间长、纯度高的原代大鼠胚胎背根神经节神经元（DRGn）的培养模型.方法：在解剖显微镜下取得胎鼠背根神经节（DRG）,通过胰蛋白酶消化,使用Neurobasal （NB）培养基联合抗有丝分裂药物纯化等方法获得DRGn.采用神经丝蛋白免疫细胞化学染色法和hoechst染核鉴定并测定DRGn的纯度.结果：原代培养的DRGn在含有神经生长因子（NGF）的NB培养基中生长良好,存活时间可达45 d,纯度可达到95％以上.结论：该培养模型简单易行,培养稳定,可获得大量高纯度和存活时间长的DRGn.     

NRG1过表达施万细胞对糖氧剥夺PC12细胞的保护作用

目的探讨神经调节蛋白1(neuregulin 1, NRG1)过表达施万细胞(Schwann cells, SCs)对糖氧剥夺PC12细胞的保护作用。方法从大鼠坐骨神经中分离培养SCs,并转染NRG1基因。建立糖氧剥夺PC12细胞模型,将实验分3组:A组,对照组;B组,糖氧剥夺模型组;C组,糖氧剥夺PC12细胞与NRG1-SCs共培养组。倒置相差显微镜观察各组PC12细胞形态变化,TUNEL染色检测PC12细胞凋亡状况,比色法检测各组PC12细胞中MDA和总SOD含量。结果成功分离培养SCs,并转染NRG1基因。光学显微镜下观察,A、C组PC12细胞突起细长,胞体透亮,呈串状生长;B组PC12细胞多呈圆形或不规则形,细胞突起短,趋于团簇状生长。TUNEL染色显示,B组PC12细胞凋亡率明显高于A组和C组(P0.05)。比色法检测示,B组PC12细胞中MDA含量显著高于A、C组(P0.05),总SOD含量明显低于A、C组(P0.05)。结论 NRG1过表达SCs对糖氧剥夺PC12细胞具有保护作用,其机制可能与减轻PC12细胞氧化应激有关。     

Biocompatibility evaluation of electrospun aligned poly(propylene carbonate) nanofibrous scaffolds with peripheral nerve tissues and cells in vitro

Background  Peripheral nerve regeneration across large gaps is clinically challenging. Scaffold design plays a pivotal role in nerve tissue engineering. Recently, nanofibrous scaffolds have proven a suitable environment for cell attachment and proliferation due to similarities of their physical properties to natural extracellular matrix. Poly(propylene carbonate) (PPC) nanofibrous scaffolds have been investigated for vascular tissue engineering. However, no reports exist of PPC nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering. This study aimed to evaluate the potential role of aligned and random PPC nanofibrous scaffolds as substrates for peripheral nerve tissue and cells in nerve tissue engineering.

Methods  Aligned and random PPC nanofibrous scaffolds were fabricated by electrospinning and their chemical characterization were carried out using scanning electron microscopy (SEM). Dorsal root ganglia (DRG) from Sprague-Dawley rats were cultured on the nanofibrous substrates for 7 days. Neurite outgrowth and Schwann-cell migration from DRG were observed and quantified using immunocytochemistry and SEM. Schwann cells derived from rat sciatic nerves were cultured in electrospun PPC scaffold-extract fluid for 24, 48, 72 hours and 7 days. The viability of Schwann cells was evaluated by 3-[4,5-dimethyl(thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl] tetrazolium bromide (MTT) assay.

Results  The diameter of aligned and random fibers ranged between 800 nm and 1200 nm, and the thickness of the films was approximately 10–20 μm. Quantification of aligned fiber films revealed approximately 90% alignment of all fibers along the longitudinal axis. However, with random fiber films, the alignment of fibers was random through all angle bins. Rat DRG explants were grown on PPC nanofiber films for up to 1 week. On the aligned fiber films, the majority of neurite outgrowth and Schwann cell migration from the DRG extended unidirectionally, parallel to the aligned fibers. However, on the random fiber films, neurite outgrowth and Schwann cell migration were randomly distributed. A comparison of cumulative neurite lengths from cultured DRGs indicated that neurites grew faster on aligned PPC films ((2537.6±987.3) μm) than randomly-distributed fibers ((493.5±50.6) μm). The average distance of Schwann cell migration on aligned PPC nanofibrous films ((2803.5±943.6) μm) were significantly greater than those on random fibers ((625.3±47.8) μm). The viability of Schwann cells cultured in aligned PPC scaffold extract fluid was not significantly different from that in the plain DMEM/F12 medium at all time points after seeding.

Conclusions  The aligned PPC nanofibrous film, but not the randomly-oriented fibers, significantly enhanced peripheral nerve regeneration in vitro, indicating the substantial role of topographical cues in stimulating endogenous nerve repair mechanisms. Aligned PPC nanofibrous scaffolds may be a promising biomaterial for nerve regeneration.

     

丝素蛋白纳米纤维排列走向对星形胶质细胞生长发育的影响

目的探讨家蚕丝素纳米纤维的排列走向对星形胶质细胞生长发育的影响。方法取新生大鼠大脑皮层,原代培养获得混合细胞培养体系,并通过反复传代对星形胶质细胞进行纯化。将纯化的星形胶质细胞以2.5×105/ml的密度接种至直径为800nm不同走向（平行、乱序）的丝素纳米纤维上,对细胞的存活、铺展以及迁移进行检测。设立多聚赖氨酸（PLL）包被组作为对照。结果成功地建立了新生SD大鼠大脑皮层原代混合细胞培养体系;传至第4代时,星形胶质细胞得到纯化,GFAP阳性率达到92%以上;接种到材料上之后,细胞和家蚕丝素纳米纤维之间表现出很高的亲和力,细胞的胞体和突起按照纤维的走向排列。家蚕丝素纳米材料上的星形胶质细胞的存活率和铺展面积与PLL对照组之间的差异具有统计学意义（P〈0.05）。平行材料上细胞的突起长度比乱序材料上的要长（P〈0.05）,3种材料（平行、乱序、PLL）上的细胞迁移效率差异具有统计学意义（P〈0.05）,其中平行材料上的细胞迁移效率最高。结论家蚕丝素纳米纤维能支持星形胶质细胞的存活和生长,表现出良好的生物相容性;丝素纳米材料的走向影响了细胞的排布以及迁移。     

静电纺丝聚乳酸-乙醇酸聚合物膜与大鼠嗅鞘细胞的生物相容性研究

目的 探索静电纺丝技术制作的聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）膜与大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）的生物相容性。方法 体外培养纯化成年大鼠OECs,将细胞接种于静电纺丝PLGA膜上,使用相差显微镜观察静电纺丝PLGA膜上OECs的细胞形态与分布;用CFDA SE荧光染色检测接种后1～5 d内静电纺丝PLGA膜上OECs的增殖情况;以多聚赖氨酸（PLL）包被细胞做对照。将静电纺丝PLGA膜植入大鼠体内观察其与大鼠的组织相容性。结果 体外培养纯化所得的OECs的细胞纯度大于90%。相差显微镜下示OECs在静电纺丝PLGA膜孔隙中的纳米纤维上黏附良好,细胞状态佳,且特异性地沿纳米纤维方向生长。接种后1～5 d内OECs在静电纺丝PLGA膜上均正常增殖,细胞数目与对照组相比差异无统计学意义。静电纺丝PLGA膜局部移植后大鼠无死亡,PLGA膜与周围组织融合并部分降解。结论 静电纺丝PLGA膜具有良好的生物相容性,OECs在其膜上的黏附和增殖状况良好,是有潜力的神经修复组织工程化神经移植物。     

分离培养大鼠背根神经节神经元的一种优化培养基

目的 在含胶质细胞源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor,GDNF)的NB1中建立胚胎大鼠背根神经节神经元分离培养体系。方法 取E15大鼠背根神经节,采用原代分离培养方法制成单细胞悬液,接种在含GDNF的NB1中培养,观察神经元的体外生长情况。结果 培养的背根神经节神经元可存活3～4周,并长出突起,形成密集的网络,神经元纯度较高。结论 神经元在优化的NB1培养基中生活状态良好。     

神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的探索神经膜（旧称许旺细胞）与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法用10μmol／ml BrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人T神经桥接体，移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋门免疫组化染色鉴定许旺细胞，倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养．石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长，移植入神经缺损处4周后，坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解．黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养．构建成人工神经桥接体．填补神经缺损。     

IL-1β激活后的许旺细胞与人发角蛋白三维培养构建人工神经桥接体

目的 探索白细胞介素-1β（IL-1β）激活后的许旺细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体,修复神经缺损.方法 体外培养纯化的许旺细胞经IL-1β激活前、后与细胞外基质凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人工神经桥接体,移植入SD大鼠坐骨神经缺损处.S-100蛋白免疫组化染色鉴定许旺细胞,倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白共培养情况,原位杂交法观察人发角蛋白降解及神经生长因子（NGF）在坐骨神经内的表达,移植术4周后检测坐骨神经功能指数.结果 经IL-1β激活后的许旺细胞能更好地黏附于人发角蛋白表面,进行分裂、增殖.3～4周,桥接体内的人发角蛋白开始降解,其周围可见IL-1β激活后的处于增殖分裂期的许旺细胞NGF表达强阳性,坐骨神经功能恢复时间提前.结论 经IL-1β激活后的许旺细胞与细胞外基质凝胶修饰的人发角蛋白复合培养构建成人工神经桥接体,具有修复神经缺损的同时还能够加速坐骨神经损伤后功能的恢复.     

聚己内酯电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞增殖及分化的影响

目的:观察聚己内酯(PCL)电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞(BMSCs)增殖及分化特点的影响,评价其作为骨组织工程的支架材料的应用前景.方法:将兔BMSCs与PCL电纺纤维支架材料在培养板内共培养.采用形态学观察、MTT法及ALP检测等方法检测BMSCs在PCL电纺纤维表面的粘附、增殖和分化能力.结果:体外培养的BMSCs能在PCL电纺纤维表面正常粘附和增殖,并且表达较高的碱性磷酸酶活性.结论:PCL电纺纤维适合作为支架材料应用于BMSCs为种子细胞的组织构建.     

大鼠骨髓间充质干细胞在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的培养及成神经诱导

目的通过将骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上,研究BMSCs的生长及成神经分化情况。方法用家蚕丝素、柞蚕丝素分别与聚乳酸共混制成静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维,将第5代大鼠BMSCs培养其上,于24h后通过活细胞工作站观察细胞的黏附情况,并进行表型鉴定及存活检测。接种后待细胞长至60%左右,用bFGF/BHA诱导细胞成神经分化,并设多聚赖氨酸组进行对照。在诱导5h和维持48h时,观察细胞的形态学改变,通过免疫荧光法鉴定神经细胞特异性标志物Nestin,β-Ⅲ-Tubulin和NCAM的表达并进行定量统计分析。结果BMSCs在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的黏附情况良好,细胞生长于纳米纤维上。存活检测中几乎未发现死细胞,多数细胞在材料上可存活。神经分化的形态学改变与多聚赖氨酸组一致,并且培养在纳米纤维上的细胞分化时出现的突起可缠绕在纺丝纤维上。神经特异标志的表达情况与多聚赖氨酸对照组的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维具有良好的生物相容性,可支持BMSCs的黏附及成神经分化,且对细胞生存无毒性。