PPARα激活物影响HepG-2细胞PAI-1表达机制初探

目的探讨不同的过氧化体增殖物激活型受体α(PPARα)激活物对HepG-2细胞纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)活性和mRNA表达的影响及其可能的机制。方法分别以亚油酸和非诺贝特刺激HepG-2细胞,检测PAI-1活性和mRNA表达。基因瞬时转染含不同片段缺失的PAI-1启动子序列控制表达的报告基因质粒,测定亚油酸和非诺贝特诱导后的转录活性。结果亚油酸使HepG-2细胞PAI-1 mRNA表达及蛋白活性显著增加,而非诺贝特使其著降低。转染HepG-2细胞由PAI-1启动子全长控制的表达质粒,亚油酸诱导PAI-1转录活性显著增加,非诺贝特显著抑制其转录活性;转染PAI-1启动子序列核转录因子KB(NF-KB)反应元件缺失的质粒时,亚油酸和非诺贝特仍显著增加PAI-1转录活性;而转染PAI-1启动子序列极低密度脂蛋白(VLDL)／脂肪酸反应元件缺失的质粒时,亚油酸对PAI-1转录活性无诱导作用,非诺贝特可下调其转录活性。结论PPARα可能是亚油酸增强PAI-1表达所涉及的转录因子之一;非诺贝特下调PAI-1表达可能涉及对NF-κB信号转导途径的抑制作用。     

亚油酸对纤溶酶原激活物抑制剂-1表达的影响及其机制

目的探讨过氧化体增殖物激活型受体α（PPARα）的特异性激活物亚油酸对HepG2细胞1型纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）mRNA表达及其活性的影响和在该基因转录调控中的作用机制.方法用不同浓度亚油酸为诱导因素刺激HepG2细胞,采用半定量RT-PCR法检测PAI-1mRNA水平,发色底物法检测PAI-1的活性变化.构建四个含PAI-1启动子序列从-804～＋17间不同长度片段驱动的荧光素酶报告基因质粒,体外瞬时转染HepG2细胞,检测荧光素酶的活性.结果与对照组相比,亚油酸组能使HepG2细胞PAI-1mRNA表达及蛋白活性显著升高（P＜0.05,P＜0.01）,且呈一定剂量依赖性;亚油酸诱导可使PAI-1转录活性显著升高（P＜0.01）;与转染质粒PAI-pGL3-A（-804/＋17）相比较,当转染质粒含有PAI-pGL3-B（-636/＋17）、PAI-pGL3-C（-449/＋17）时,荧光素酶活性显著降低（P＜0.01）;共转染PPARα表达质粒（PPARα-pSG5）的细胞在亚油酸诱导下PAI-1转录活性显著升高（P＜0.01）.结论亚油酸可以增加HepG2细胞PAI-1mRNA表达及其蛋白活性,调节PAI-1的基因转录,PPARα参与亚油酸对PAI-1基因的表达调控;在PAI-1启动子-804～-636、-449～-276区域内存在亚油酸作用的调控PAI-1基因表达的序列.     

乙型肝炎病毒X基因对c-met基因启动子区的调控作用

目的 明确乙型肝炎X基因(HBx)对c-met基因启动子区的调控及其在肝细胞癌侵袭和转移中的机制.方法 将HBx表达质粒转染HepG2细胞,采用Western blot方法比较转染前后HBx对原癌蛋白质c-met(c-met)表达的影响,进一步将c-met基因启动子区分成5个(包括全部序列)不同长度的片段,然后与PGL3-Basic荧光素酶报告基因系统连接构建成重组质粒,将上述质粒与HBx表达质粒共转染于HepG2细胞中,通过荧光素酶测定、启动子区突变分析及侵袭试验比较转染前后HBx对c-met表达调控的影响.荧光素酶活性值采用ANOVA单因素方差分析,侵袭细胞数统计采用t检验.结果 HBx能够增强c-met的表达;通过对c-met基因启动子区缺失分析,确定了c-met基因启动子区(-183 bp～-100 bp)是HBx作用的调控区域,进一步对该区域可能的转录因子结合位点(SP1-1、SP1-2、AP-2)进行突变分析,发现这3个结合位点均参与了HBx对c-met基因启动子区的调控.测定全部缺失构建体荧光素酶活性结果显示,-184上游部分序列缺失后对HBx的反应有轻微的降低,当-183 bp/-122 bp、-121 bp/-100 bp两个片段缺失后,启动子对HBx的反应均有明显降低,F=40.37,P<0.01;c-met启动子突变分析显示,HBx诱导的荧光素酶活性在SP-1-1、SP-1-2,AP-2突变体组中明显下降,F=235.3,P<0.01.Matrigel侵袭试验检测结果显示,转染pCEP4-X-FLAG表达质粒的HepG2细胞侵袭性增加,穿膜细胞数为(74.33±6.24)个,而未转染组穿膜细胞数为(28.24±3.05)个,t=9.68,P<0.01.结论 HBx引起肝细胞癌的侵袭转移可能是通过对c-met基因启动子区(-183 bp～-100 bp)转录因子SP-1、AP-2结合位点的调控来实现的,但是该过程中所涉及的信号通路仍有待进一步研究.     

载脂蛋白M基因启动子区域－778C→T置换对其表达的影响

目的构建含载脂蛋白M(ApoM)基因启动子区的荧光素酶报告基因的真核表达载体,探讨ApoM基因启动子区域-778C→T置换对ApoM表达的影响。方法采用PCR法扩增人染色体中含ApoM基因-1316 bp至+73 bp的DNA片段,筛选出含ApoM-778TT基因型(-778 bp无变异)及ApoM-778CT/CC基因型(-778bp变异)的DNA片段,构建含以上两个基因片段的PGL3重组载体。并采用阳离子脂质体转染法将携带萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒转染HepG2细胞,经48 h培养,检测荧光素酶的活性,以反映ApoM的表达水平。结果荧光素酶报告基因活性显示,ApoM-778C基因型携带者引起荧光素酶相对活性明显低于ApoM-778T基因型者。结论 ApoM基因启动子-778C→T对ApoM转录活性起抑制作用,它可能是影响ApoM基因表达的重要因素。     

脂肪酸影响血管内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂-1表达的机制初探

目的 探讨脂肪酸影响血管内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂－1 机制。方法 以PAI－1启动子控制表达氯霉素转移乙酰酶（CAT）报告基因的重组质粒－PAI－pCAT转染人血管内皮细胞株ECV304，并且部分共转染不同量的过氧化增殖物激活型肥体（PPAR）α或PPARγ表达载体。分别以亚麻酸，亚油酸，油酸，硬脂酸诱导转染细胞，酶联免疫吸附CAT表达量显示启动子片面转录活性。结果 亚麻酸，亚油酸，油酸诱导以及增加PPARα表达可提高PAI－1启动子转录活性，硬脂酸诱导和增加PPARγ表达无影响。结论 不饱和脂肪酸可通过提高PAI－1转录活性诱导其在血管内皮细胞的表达，此作用涉及PPARγα对PAI-1基因转录的诱导调节。     

缺氧诱导热休克蛋白70-2表达的分子机制

目的 观察缺氧对HepG32细胞中热休克蛋白(HSP)70-2(基因名为HSPA2)表达的影响,探讨缺氧条件下缺氧诱导因子(HIF)-1在转录水平调控HSP70-2表达的具体机制. 方法 以物理缺氧法和化学缺氧诱导剂(DFO或CoC12)诱导法分别模拟肿瘤缺氧环境,Western blot检测HIF-1α和HSP70-2蛋白表达的变化,荧光素酶报告基因分析技术检测缺氧对HSPA2基因的激活作用.HIF-1α抑制剂(YC-1)或HIF-1α小干扰RNA(siRNA)处理后检测缺氧HepG2细胞中HSP70-2的表达变化.构建一系列截短和突变的HSPA2基因启动子荧光素酶报告基因质粒,将其与HIF-1α siRNA共转染HepG2细胞,荧光素酶分析技术检测HSPA2启动子活性的变化,寻找HIF-1在HSPA2启动子上的结合位点.各组间比较用方差分析,两组间比较用t检验. 结果 缺氧培养6 h后,HepG2细胞中HIF-1α和HSP70-2表达增加,其表达量随着缺氧培养时间的延长而逐渐增加(F=77.369,P<0.01;F=108.854,P<0.01).各组分别加终浓度为0、50、100 μmol/L的化学缺氧诱导剂DFO或终浓度为0、100、200 μmol/L的CoCl2,培养24 h后检测,随着DFO浓度增加,HIF-1α和HSP70-2蛋白表达逐渐增加(F=443.174,P<0.01;F=589.238,P<0.01);随着COCl2浓度增加,HIF-1 α和HSP70-2蛋白表达也逐渐增加(F=637.724,P<0.01;F=692.918,P<0.01).与常氧培养相比,缺氧培养后HSPA2启动子活性增加7.09倍(t=43.551,P<0.01).随着YC-1浓度升高,HIF-1α表达受到明显抑制(F=883.614,P<0.01),HSP70-2表达水平也相应下降(F=218.112,P<0.01).转染HIF-1α siRNA后HIF-1α表达受到明显抑制(F=577.130,P<0.01),HSP70-2表达水平也相应下降(F=465.598,P<0.01).构建系列截短的HSPA2启动子报告基因载体转染HepG2细胞后检测,转染HSPA2(-1114/+62)-LUC和HSPA2(-653/+62)-LUC细胞的相对荧光素酶活性无明显改变,但转染HSPA2(-385/+62)-LUC细胞的相对荧光素酶活性较前明显降低(t=13.717,P<0.01).分别构建突变缺氧反应元件(HRE)1和HRE2的HSPA2启动子报告基因载体,转染HepG2细胞后检测,突变HRE1后HSPA2启动子活性显著降低(t=10.954,P<0.01),但是突变HRE2后HSPA2启动子活性无明显改变.结论 缺氧显著上调HepG2细胞中HSP70-2的表达,其机制可能是HIF-1与HSPA2启动子上HRE1结合后激活该基因的转录.     

人XAF1基因启动子的克隆及其在人肝癌细胞株中活性的测定

目的分析XAF1基因启动子在肝癌细胞株中的活性,为研究XAF1基因转录调控的基本机制奠定基础。方法从肝癌细胞株中扩增XAF1基因的1395bp启动区域片段并分别克隆到报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1中,分别将含有XAF1基因启动子的报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721,检测萤火虫荧光素酶的活性并观察绿色荧光蛋白的表达。通过转染细胞、荧光素酶活性测定及观察绿色荧光蛋白的表达,检测其启动子活性。结果重组的质粒经双酶切和测序结果证实克隆的XAF1启动子片段序列正确;转染后的HepG2、SMMC7721荧光素酶相对发光强度分别是6．97±0．74、6．12±0．59。其绿色荧光蛋白强度明显低于对照组。结论本实验构建的含XAF1启动子的报告基因质粒为研究XAF1基因的转录调控提供实验依据。     

蛋白激酶Cβ_2通过调控PPARα介导高糖诱导的人内皮细胞损伤

目的 研究蛋白激酶C(PKC)β_2、PPARα在高糖诱导入脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA中的作用及相互关系.方法 将培养的HUVECs分为以下8组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖)组、高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)组、渗透压对照(L,NG+20 mmol/L L-葡萄糖)组、正常糖卒载体转染(NN,NG+Ad5-null)组、高糖PKCβ_2转染(HB,HG+Ad5-PKCβ_2)组、高糖+非诺贝特(HF,HG+40 μmol/L非诺贝特)组、高糖PKCβ_2转染+非诺贝特(HBF,HB+40μmol/L非诺贝特)组,另以非诺贝特共孵育20 min作为HF20组,以上各组细胞均培养6 d.以RT-PCR 检测VEGF、VCAM-1 mRNA的表达水平,用Western印迹法测定PPARα蛋白表达,采用激光共聚焦检测PKCβ_2蛋白的表达和转位.结果 (1)HG组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.91倍和1.56倍(均P<0.05);HB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达较HG组进一步增加,分别为NG组的2.59倍和2.07倍(均P<0.05).HF组VEGF、VCAM-1 mRNA表达则明显下调,分别为HG组的68%和74%(均P<0.05);与HG组相比,HF20组VEGF、VCAM-1 mRNA表达差异无统计学意义.(2)HG组PPARa蛋白表达较NG组减少了20%,HB组PPARα蛋白水平进一步下降,为HG组的78%,与HG组相比,HF组PPARα蛋白水平上调了13%(P<0.05).(3)HG诱导PKCβ_2核转位激活,定量分析示HG组浆/核荧光强度比值较NC组降低37%(P<0.05),HB组PKCβ_2核转位与HG组相比更加明显.结论 高糖通过诱导HUVECs PKCβ_2核转位,进而调控PPARα表达,增加VEGF、VCAM-1 mRNA的表达.     

过氧化物酶体增殖物辅助激活因子1 α基因多态性对糖异生基因转录的影响

目的 研究过氧化物酶体增殖物辅助激活因子1α（PGC-1α）基因482号密码子甘氨酸-丝氨酸突变（Gly482Ser）多态性对糖异生关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）转录的影响.方法 （1）应用寡核苷酸诱导的定点突变和PCR技术构建PGC-1α 1444位点基因多态性表达质粒,并用普通PCR和酶切方法构建连接荧光素酶报告基因的人PEPCK启动子报告质粒PGL3-hPCK-luc.分别将PGC-1α基因482号密码子为甘氨酸的野生型表达质粒pcDNA3.1-PGC-1α（G）或482号密码子为丝氨酸的突变型表达质粒pcDNA3.1-PGC-1α（S）,与转录因子肝细胞核因子4α（HNF4α）表达质粒pcDNA3.0-HNF4α共转染进培养的人肝癌细胞及人正常肝细胞株.（2）转染48 h后检测细胞株内PGC-1α及PEPCK的mRNA水平及蛋白水平.进一步按不同组合联合转染PGL3-hPCK-luc及内参质粒PRL-SV40,培养48 h后用双荧光素酶检测试剂盒检测细胞荧光素酶的相对活性.多组间比较用单因素方差分析,2组组间比较用独立样本t检验.结果 成功构建PGC-1α 1444位点突变质粒及PGL3-hPCK-luc荧光素酶报告质粒.瞬时转染进HepG2细胞中,PGC-1α（G）与PGC-1α（S）质粒转染组PGC-1α mRNA及蛋白表达水平均明显增加,但2组间无明显差异（P＞0.05）;联合转染PGC-1α和HNF4α组的PEPCK的mRNA及蛋白表达水平较单转染PGC-1α明显增高（分别为10.40±0.70、4.50±0.50和0.86±0.18、0.99±0.09,均P＜0.05）;转染PGC-1α（G）＋HNF4α组较PGC-1α（S）＋HNF4α组PEPCK的mRNA及蛋白表达水平分别增高1.83倍和1.4倍（分别为10.40±0.70、5.35±0.23和4.50±0.50、3.00±0.40,均P＜0.05）.转染PGC-1α＋HNF4α组可显著促进PEPCK启动子活性（与单转染PGL3-hPCK-luc组比较）（分别为28.0±5.0和2.4±0.4,F=23.41,P＜0.05）;在HepG2中联合转染HNF4α时,PGC-1α（G）组较PGC-1α（S）可使PEPCK启动子相对活性增高2倍（分别为83±10和41±5,F=23.41,P＜0.001）;在L02细胞中联合转染HNF4α时,PGC-1α（G）组较PGC-1α（S）可使PEPCK启动子相对活性增高2.25倍（分别为28.0±5.0和12.6±1.5,F=60.75,P＜0.001）.结论PGC-1α可辅助激活HNF4α对PEPCK转录的促进作用,而PGC-1α基因Gly482 较Ser482对HNF4α的蛋白辅助激活作用更强,这可能为基因多态性引起蛋白表达后不同构型影响蛋白-蛋白相互作用有关.     

非诺贝特和吡格列酮对血管紧张素Ⅱ介导的心肌细胞肥大和凋亡的干预作用

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活型受体α和γ(PPARα和PPARγ)的配体非诺贝特、吡格列酮对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大、凋亡的干预作用,并观察其对凋亡相关基因Bcl-2/Bax表达变化的影响。方法分别以非诺贝特和/或吡格列酮预处理体外原代培养的新生大鼠心肌细胞24h后,再加用AngⅡ作用24h。采用软件分析细胞表面积,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,用Western-blot法观察凋亡相关基因Bcl-2/Bax的表达变化,逆转录聚合酶链反应检测PPARα和PPARγ的mRNA水平。结果与AngⅡ组比较,非诺贝特组、吡格列酮组及非诺贝特和吡格列酮组的心肌细胞表面积、细胞凋亡率及Bax蛋白的表达明显降低(P<0.05),而Bax蛋白的表达和Bcl-2/Bax蛋白水平比值显著增加(P<0.05),非诺贝特组、吡格列酮组及非诺贝特和吡格列酮组间的上述指标差异无显著性(P>0.05),非诺贝特组的PPARαmRNA和吡格列酮组的PPARγmRNA表达增高。结论PPARα和γ激活可逆转心肌细胞肥大,抑制心肌细胞凋亡,并能改变凋亡相关基因Bcl-2/Bax的表达,但PPARα、γ配体合用无叠加效应。     

非诺贝特和吡格列酮对血管紧张素Ⅱ介导的心肌细胞肥大和凋亡的干预作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活型受体α和γ(PPARα和PPARγ)的配体非诺贝特、吡格列酮对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心肌细胞肥大、凋亡的干预作用,并观察其对凋亡相关基因Bcl-2/Bax表达变化的影响 .方法 分别以非诺贝特和/或吡格列酮预处理体外原代培养的新生大鼠心肌细胞24 h后,再加用Ang Ⅱ作用24 h.采用软件分析细胞表面积,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,用Western-blot法观察凋亡相关基因Bcl-2/Bax的表达变化,逆转录聚合酶链反应检测PPARα和PPARγ的mRNA水平.结果 与Ang Ⅱ组比较,非诺贝特组、吡格列酮组及非诺贝特和吡格列酮组的心肌细胞表面积、细胞凋亡率及Bax蛋白的表达明显降低(P＜0.05),而 Bax蛋白的表达和Bcl-2/Bax蛋白水平比值显著增加(P＜0.05),非诺贝特组、吡格列酮组及非诺贝特和吡格列酮组间的上述指标差异无显著性(P＞0.05),非诺贝特组的PPARα mRNA和吡格列酮组的PPARγ mRNA表达增高.结论 PPARα和γ激活可逆转心肌细胞肥大,抑制心肌细胞凋亡,并能改变凋亡相关基因Bcl-2/Bax的表达,但PPARα、γ配体合用无叠加效应.     

血管紧张素受体1阻断剂替米沙坦、厄贝沙坦具有激活PPARα的作用

目的 通过观察替米沙坦、厄贝沙坦对PPARa转录活性的影响以探讨其改善糖脂代谢的机制.方法 将构建的PPARa表达质粒、PPAR反应元件(PPRE)调控的荧光素酶表达质粒与pRL表达载体以脂质体(SuperFect)瞬时共转染COS-7细胞后,分别加入不同浓度的替米沙坦及厄贝沙坦,继续培养细胞不同时间,用双荧光索酶基因报告系统检测荧光素酶活性以反映PPARa转录活性.不同浓度的厄贝沙坦及替米沙坦孵育3T3-L1脂肪细胞,分别应用RT-PCR和Western印迹测定细胞的PPARα mRNA和蛋白表达水平.结果 (1)替米沙坦和厄贝沙坦均呈剂量和时间依赖性地增加COS-7细胞的PPARα转录活性,在60 h作用均达高峰,两者在100μmol/L浓度时PPRE调控的荧光素酶活性较对照组增高3.8倍和2.6倍(均P<0.01);(2)替米沙坦及厄贝沙坦激活PPARα的作用不能被PPARγ脚特异性抑制剂GW9662抑制;(3)替米沙坦和厄贝沙坦呈剂量依赖性增加3T3-L1脂肪细胞PPARα mRNA和蛋白表达水平.结论 血管紧张素受体阻断剂替米沙坦和厄贝沙坦增加PPARα转录活性,可能通过此途径改善糖脂代谢.     

载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190T→A突变对其转录的影响

为探讨载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190bp处的碱基突变(T→A)对载脂蛋白CⅡ基因转录的影响，及其与血浆载脂蛋白CⅡ浓度降低的关系。通过定点诱变技术构建带有一190bp处T→A突变的载脂蛋白CⅡ启动子的荧光素酶表达载体pGL3应用脂质体介导的基因转染技术，将带有正常的载脂蛋白CⅡ启动子的表达质粒和构建的突变质粒分别与内参照质粒pRL-TK共转染HepG2细胞，瞬时表达；利用双荧光素酶测试系统检测荧光素酶活性。结果发现，带有启动子区-190T→A突变的载脂蛋白CⅡ启动子的荧光素酶表达活性比正常的载脂蛋白CⅡ启动子的表达活性低18．56％。结果提示，载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190bp处的碱基由T突变为A降低了载脂蛋白CⅡ启动子的转录活性。     

雌激素通过其受体α上调LRP16 mRNA表达并促进MCF-7细胞增殖

目的 探讨雌激素对人乳腺癌MCF-7细胞LRP16 mRNA表达的调控作用以及过表达LRP16对MCF一7细胞生长特性的影响。方法 (1)用Northem印迹方法检测17β-雌二醇(17β-E2)对LRP16m RNA表达水平的作用；(2)构建LRP16启动子(-2．6kb)调控的荧光素酶报告子(pG13-S0)，并与各种核受体包括雌激素受体α和β(ERα和ERβ)、糖皮质激素受体α(GRα)、雄激素受体(AR)和过氧化物酶体增殖物激活的受体γ和α(PPARγ和PPARα)表达载体共转染COS-7细胞，测定荧光素酶活性；(3)将LRP16表达载体转染MCF-7细胞，测定过表达LRP16对细胞的生长特性和细胞周期的影响，并用Western印迹方法测定周期素E、p53和p21^WAF1/CIP1蛋白的变化。结果 (1)17β-E2使MCF-7细胞的LRP16 mRNA表达水平增加5～8倍，增加幅度未显示出β-E2培养时间和剂量的依赖性；(2)pGL3-S0与ERα或AR共转染细胞的相对荧光素酶活性较单独转染pGL3-S0细胞(对照组)分别升高11和7．8倍；(3)LRP16过表达促进MCF-7细胞的生长且伴有周期素E显著升高，S期细胞的数量较对照组增加约10％。结论 (1)雌激素通过激活ERα增加MCF-7细胞LRP16 mRNA的表达；(2)过表达LRP16可能通过上调周期素E促进MCF-7细胞生长。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A调节新生多肽复合物启动子转录活性的研究

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）对新生多肽相关复合物（NACA）启动子转录活性的影响。方法以我室构建的能够表达NS5A蛋白的pcDNA3．1（-）-NS5A质粒和含有NACA基因启动子的PCAT3-NACA报告基因质粒共转染HepG2细胞系设为实验组，同时PCAT3-NACA单独转染HepG2细胞系作为对照组。用酶联免疫吸附法检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果pCAT3-NACA单独转染HepG2细胞的CAT酶表达活性与pCAT3-NACA和pcDNA3．1（-）-NS5A共转染组HepG2细胞的CAT酶表达活性比较，共转染组A值下降了79．3％。结论HCV NS5A能够抑制NACA启动子的活性，对NACA的表达具有下调作用。     

蛋白磷酸酶2A催化亚基α显性负性突变体表达载体对肝癌细胞生长的影响

目的 构建肝癌组织特异性启动子驱动的蛋白磷酸酶2A催化亚基α显性负性突变体(DN-PP2Acα)表达载体,研究其对肝癌细胞生长的影响.方法 将甲胎蛋白(AFP)基因的增强子和磷酸甘油酸激酶(pgk)基因的启动子组合形成的肝癌组织特异性AFpg启动子.采用定点突变将野生型蛋白磷酸酶2A催化亚基α(PP2Acα)突变为DN-PP2Ac α.将AFpg启动子和DN-PP2Ac α编码序列构建成AFpg启动子调控的DN-PP2Ac α表达载体pGL3-Basic-AFpg-PP2Acα.荧光素酶报告基因实验检测AFpg启动子的转录活性.质粒pcDNA3.1(+)、pGL3-Basic、pcDNA3.1 (+)-DN-PP2Acα、pGL3-Basic-AFpg、pGL3-Basic-AFpg-PP2Ac α分别转染L02、SK-Hep-1、HepG2和Hep3B细胞,Western blot检测PP2Ac蛋白表达水平,四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞生长情况.成组t检验分析不同处理组间的细胞活力差异.结果 L02、SK-Hep-1、HepG2和Hep3B细胞中,AFpg启动子相对荧光素酶活性分别为3.61±1.07、3.46±0.66、98.70±18.60、88.70±19.53,AFpg启动子在表达AFP的细胞中具有高转录活性.pGL3-BaSic-AFpg-PP2Acα可特异性地使DN-PP2Ac α表达于AFP阳性肝癌细胞HepG2和Hep3B,并抑制其生长,转染72 h后,HepG2细胞活力下降42.65％±3.99％,Hep3B细胞活力下降39.87％±3.91％,与0h时比较,差异均有统计学意义(t值分别为13.0563和12.9920,P值均＜0.01).pGL3-BaSic-AFpg-PP2Ac α对AFP阴性细胞的生长无明显影响.结论 AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体特异性地抑制AFP阳性肝癌细胞的生长,可用于肝癌组织特异性基因治疗.     

Sulfone通过转录因子Elk1调节人结肠癌细胞XAF1表达的研究

背景:Sulfone是一个高效的结肠肿瘤化学预防制剂,具有抗肿瘤功能,但其具体作用机制尚未完全明确。目的:探讨Sulfone在转录水平调节X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)相关因子1(XAF1)表达的作用机制。方法:以Sulfone干预人结肠癌细胞株HCT116,以蛋白质印迹法检测磷酸化ERK1/2(pERK1/2)、XAF1和ERK1/2表达;构建稳定转染pLuc-291质粒以及pLuc-291-18T、pLuc-291-70T、pLuc-291-IRFm质粒的HCT116细胞(分别为转录因子Elk1、c-ETS、IRF结合序列点突变),以荧光素酶报告基因检测Sulfone对XAF1启动子转录活性的调节作用;以染色质免疫沉淀法检测Elk1-XAF1的DNA结合活性;以实时定量PCR检测Elk1 siRNA对XAF1 mRNA表达的影响。结果:Sulfone可显著抑制pERK1/2表达,显著上调XAF1表达。XAF1启动子Elk1结合序列点突变能显著增加Sulfone诱导的XAF1启动子转录活性,而c-ETS和IRF结合序列点突变对Sulfone诱导的XAF1启动子转录活性无明显影响。XAF1启动子区域存在Elk1的特异性结合序列。以Elk1 siRNA抑制Elk1表达能显著增高XAF1mRNA表达。结论:Sulfone通过抑制ERK1/2信号通路下游转录因子Elk1活性,在转录水平上调人结肠癌细胞XAF1表达。     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞中细胞色素P450同工酶3A4诱导的影响

目的 观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对1α,25-(OH)2D3诱导的HepG2细胞色素P450(CYP)3A4的影响.方法 将重组HBx真核表达质粒pcDNA3-X与pEGFP-N1质粒(转染对照)瞬时共转染HepG2细胞,分为空白细胞对照组(对照组)、转染pEGFP-N1组、转染pEGFP-N1+1α,25-(OH)2D3组、共转染pEGFP-N1+pcDNA3-X+1α,25-(OH)2D3组.同时以0.35 μmol/L1α,25-(OH)2D3诱导HepG2细胞CYP3A4表达72 h,分别以RT-PCR法和Western印迹法,在mRNA水平和蛋白水平检测CYP3A4的表达.组间比较行F检验.结果共转染pEGFP-N1+pcDNA3-X+1α>,25-(OH)2D3组CYP3A4 mRNA表达量是空白对照组的1.52倍,而转染pEGFP-N1+1α,25-(OH)2D3组为3.97倍(F=4.72,P<0.05);共转染pEGFP-N1+pcDNA3-X+1α,,25-(OH)2D3组CYP3A4蛋白诱导倍数是2.1,而转染pEGFP-N1+1α,25-(OH)2D3组是5.9(F=4.68,P<0.05).结论 HBx干扰1α,25-(OH)2D3对HepG2细胞CYP3A4的诱导,提示HBx对CYP3A4的表达调控有抑制作用.     

非诺贝特对脂肪组织凝血和纤溶因子表达的影响

目的:探讨动脉粥样硬化兔脂肪组织组织因子(TF)和Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达及非诺贝特对其的影响。方法:15只兔随机等分为3组,正常组予普通饲料喂养12周,动脉粥样硬化组给予高胆固醇饮食12周,非诺贝特组在高胆固醇饮食8周后加非诺贝特30mg·kg-1·d-1干预4周。实验第12周末取兔皮下脂肪组织,RT-PCR测定脂肪组织TF和PAI-1mRNA表达;同时采血10ml,分离血浆,用ELISA方法测定血浆TF活性,发色底物法测定血浆PAI-1活性。结果:高胆固醇饮食可显著升高血清总胆固醇(TC)(P<0·05),血清三酰甘油(TG)无明显升高;加用非诺贝特治疗4周,TC和TG均无明显改变。动脉粥样硬化组脂肪组织TF和PAI-1mRNA表达(分别为1.15±0.01和1.20±0.01)明显高于正常组(分别为1.03±0.01和1.10±0.01),均P<0·01;血浆TF和PAI-1活性[分别为(74.4±28.8)ng/L和(15.6±1.9)×103AU/L]较正常组[分别为(33.1±10.7)ng/L和(6.9±0.9)×103AU/L]增高(P<0·05)。非诺贝特组TF和PAI-1mRNA表达(分别为1.02±0.01和1.06±0.01)、血浆TF和PAI-1活性[分别为(40.3±12.2)ng/L和(7.5±1.5)×103AU/L]均有显著降低(P<0.01或P<0·05)。结论:动脉粥样硬化兔脂肪组织表达TF和PAI-1增加,活性增强,非诺贝特能抑制动脉粥样硬化兔脂肪组织TF和PAI-1的表达及活性,提示非诺贝特可能具有独立于降脂作用之外的抗血栓作用。     

TLR9受体介导枯否细胞对转染HepG2细胞HBx信号转导的抑制作用

目的探讨胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸激活类铎受体9信号通路抑制肝脏肿瘤细胞增殖的免疫机制。方法首先将乙型肝炎病毒X基因真核表达质粒转染入HepG2细胞,以空质粒转染HepG2细胞为对照组,24h后以β-actin为内参照对HBx蛋白表达进行Westernblotting鉴定;然后分别将CpG或CpG对照和枯否细胞加入转染HepG2细胞培养体系中进行共培养,12h后收集上清液,采用ELISA法检测干扰素(IFN)-α和IFN-γ,同时收集贴壁的HepG2细胞进行双荧光素酶活性检测。结果Westernblotting鉴定显示转染的HepG2细胞表达特异性HBx蛋白;双荧光素酶活性检测显示KC细胞与CpG加入转染HepG2细胞培养体系后HBx信号转导活性下降35%;CpG激活的KC细胞产生大量的IFN-α和IFN-γ,与对照组相比分别上升了8.7倍和6.5倍。结论CpG激活KC细胞产生多种干扰素,抑制HBx信号转导,这为通过阻断HBx信号转导治疗肝癌提供了理论依据。