MYCT1-TV对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响

目的探讨MYCT1-TV(Myc target 1)基因过表达对肝癌Bel7402细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法将构建的MYCT1-TV-GFP真核表达载体瞬时转染Bel7402细胞,通过RT-PCR和荧光显微镜检测转染效率,分别通过MTT、流式细胞术和Transwell实验检测转染后MYCT1-TV对Bel7402细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。结果转染MYCT1-TV-GFP后,Bel7402细胞活细胞数显著减少,凋亡细胞数显著增加,穿膜细胞数显著减少。结论 MYCT1-TV过表达能抑制Bel7402细胞生长和侵袭,促进Bel7402细胞凋亡。     

过表达HSPC238对Bel7402细胞周期的影响

目的:构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,研究过表达HSPC238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/HSPC238重组质粒中克隆得到HSPC238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染Bel7402细胞,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株。用RT-PCR和Western blot技术分别检测HSPC238基因在Bel7402中的mRNA和蛋白水平的表达。随后用饥饿法使各组细胞周期同步化,再用流式细胞仪分析HSPC238过表达对细胞周期的影响。结果:pcDNA3.1(-)/HSPC238经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因HSPC238的序列完全正确;RT-PCR和Western blot检测显示,与转染pcDNA3.1(-)组和未转染组相比较,转染pcDNA3.1(-)/HSPC238组的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,但前两者间没有差异。用饥饿法同步化后,流式细胞仪检测显示过表达HSPC238可延缓Bel7402细胞株从G1期进入S期。结论:成功构建了pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,并在Bel7402中表达。初步发现过表达HSPC238可延缓肝癌细胞的细胞周期,为更进一步研究HSPC238蛋白的功能奠定了基础。     

TCRVβ8.4 基因转染人PBMC对肝癌细胞杀伤活性的研究

目的：探讨转染hTCRVβ8.4基因后健康人PBMC的免疫学特性及其对起源于乙肝病毒的肝癌细胞株BEL-7402杀伤活性的改变。方法：将hTCRVβ8.4基因克隆至真核表达载体pcDNA3．1(-)上，并转染健康人PBMC，流式细胞术检测转染后PBMC中TCRVβ8.4蛋白表达，乳酸脱氢酶释放活性法检测重组质粒转染后PBMC对癌细胞BEL-7402的杀伤活性。结果：TCRVβ8.4在基因转染后淋巴细胞中表达显著增高；与BEL-7402共培养后，基因转染组CD3^ TCRVβ8.4T细胞增殖明显高于对照组；BEL-7402刺激后免疫细胞活化，表达CD122的细胞数量增多，表达CD19(B细胞活化的标志)的B细胞增加；重组质粒转染后，PBMC对肝癌细胞BEL-7402杀伤活性增强；透射电镜观察发现，重组质粒转染的PBMC使BEL-7402凋亡。结论：hTCRVβ8.4基因修饰可显著增强淋巴细胞在超抗原BEL-7402刺激下的增殖及免疫细胞活化，基因修饰后T淋巴细胞杀伤活性明显增强。     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

肝癌Bel7402细胞HLA-E基因上调对NK细胞体外杀伤作用的影响

目的: 探讨肝癌Bel7402细胞人类白细胞抗原-E(HLA-E)基因上调对NK细胞体外杀伤作用的影响。方法: 体外构建Lentivirus/CMV/GFP-HLA-E慢病毒表达载体并转导肝癌Bel7402细胞,采用RT-PCR和Western blotting方法检测肝癌Bel7402细胞HLA-E基因mRNA水平和蛋白水平的表达,分析肝癌Bel7402细胞HLA-E基因上调及HLA-ABC抗体封闭靶细胞相应位点对NK细胞体外杀伤作用的影响。结果: Lentivirus/CMV/GFP-HLA-E重组慢病毒载体感染Bel7402细胞后不同时段(24 h、48 h、72 h、96 h)的HLA-E mRNA的表达明显上调,除在感染后24 h(P＜0.05)外,慢病毒过表达组在感染后48 h、72 h、96 h与Bel7402组比较,显著差异 (P＜0.01)。蛋白水平的表达亦明显上调:24 h、48 h、72 h、96 h外源性/内源性HLA-E吸光度比值与12 h比较显著差异 (P＜0.01)。未封闭的Bel7402组和Bel7402 Lenti HLA-E组比较,NK细胞的杀瘤活性差异显著(P＜0.05或P<0.01);封闭组和未封闭组比较,NK细胞的杀瘤活性差异显著(P＜0.05);Bel7402(封闭组) 和Bel7402 Lenti HLA-E(封闭组)比较,NK细胞的杀瘤活性有显著差异(P＜0.01)。结论: Lentivirus/CMV/GFP-HLA-E慢病毒表达载体能有效增加HLA-E的表达。NK细胞对HLA-E基因表达上调的Bel7402细胞的靶杀伤作用降低;抗HLA-ABC单抗封闭靶细胞相应位点后,NK细胞对靶细胞的杀伤能力普遍有所提高。     

转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因转染至肝癌细胞．方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因，将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN—SEA重组质粒，再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞，用RT—PCR和ELISA法鉴定．结果从产SEA标准菌株ATCCl3565中提取并扩增出SEA基因全长片段；SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN，经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致；将pLXSN—SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402，经筛选获得稳定表达的抗性单克隆．RT—PCR扩增出约800bD的基因片段，经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平．结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体，将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL－7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白．     

肝癌中ZBTB7A的表达及其与肿瘤耐药性产生的相关性

目的探讨ZBTB7A在肝癌组织中的表达,并分析其与肝癌耐药性产生的关系。方法运用UALCAN法检测371例TCGA肝癌标本中ZBTB7A的表达,应用Western blot法检测肝癌组织与癌旁组织中ZBTB7A的蛋白表达水平。荧光定量PCR和Western blot分别检测阿霉素耐药细胞中ZBTB7A的表达。采用TIMER数据库以及荧光定量PCR分析ZBTB7A的表达与耐药相关基因的关系。结果 ZBTB7A基因在肝癌组织中高表达,且与肿瘤分期存在密切关系;在阿霉素耐药的Bel7402细胞中,ZBTB7A的表达上调,并且ZBTB7A的表达与BCL-2相关抗凋亡基因及ABCC1的表达呈正相关;干扰ZBTB7A表达能够下调BCL-2相关抗凋亡基因及ABCC1的表达。结论 ZBTB7A在耐药细胞中的表达上调,干扰ZBTB7A的表达能够抑制BCL-2相关抗凋亡基因及ABCC1的表达,肝癌中ZBTB7A的表达与耐药性的产生存在密切联系。     

HIV-1 Nef基因在THP-1细胞的表达和活性检测

目的将HIV-1 Nef基因转染THP-1细胞,获得稳定表达Nef蛋白的细胞克隆,为研究Nef对巨噬细胞生物学活性的影响奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(+)-Nef和pcDNA3.1(+()阴性对照)转染THP-1细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、细胞免疫荧光等方法检测目的蛋白在真核细胞内的表达及定位,采用共转染法将荧光报告基因转染THP-1Nef和THP-13.1细胞,通过测定荧光(RLU)值来评价Nef蛋白的生物学活性。结果转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的THP-1细胞株,RT-PCR及Western blot结果表明Nef在真核细胞中成功表达,细胞免疫荧光结果显示,THP-1-Nef细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。荧光酶标仪检测转染了HIV-1LTR-Luc和NFκB-Luc荧光报告基因的THP-1-Nef和THP-1-3.1细胞的RLU值。结论成功建立了THP-1-Nef细胞稳定表达细胞株,检测了其生物学活性,为进一步研究其作用机制实验奠定基础。     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

人IL-1β重组表达载体在肝癌细胞的表达及对其NK细胞杀伤敏感性的影响

目的：构建全长人IL-1β真核表达载体,转染H7402肝癌细胞,分析对其NK细胞杀伤敏感性的影响。方法：RT-PCR法扩增人IL-1β基因全长编码序列,经T-A克隆,构建pIRES2-EGFP-IL-1β重组表达载体,采用阳离子聚合物jetPEI的方法转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,RT-PCR分析IL-1β的表达水平,MTT方法分析转染前后NK细胞对肝癌细胞杀伤活性的变化。结果：从LPS处理的人外周PBMCs总RNA中扩增出IL-1β（大小约829 bp）,先构建pMD18-IL-1β克隆载体,DNA序列鉴定正确后,利用Pfu DNA聚合酶将IL-1β基因亚克隆到pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-IL-1β,经PCR、限制性酶谱分析（BamHⅠ和EcoRⅠ）和DNA序列测定正确后,将其转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达IL-1β的细胞,与转染空载体的细胞相比,该细胞对NK-92细胞杀伤的敏感性显著降低,效靶比10∶1时下降了约30%。结论：促炎性细胞因子IL-1β能够显著增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是导致肝癌细胞发生天然免疫逃逸的重要机制。     

pcDNA3.1-MORC2重组质粒的构建及其在胃癌细胞SGC-7901中的表达和定位

目的 构建真核表达载体pcDNA3.1-MORC2并瞬时转染人胃癌细胞SGC-7901,观察融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以人MORC2 cDNA为模板,PCR扩增MORC2全长编码基因,亚克隆至pcDNA3.1-hisA表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,提取细胞蛋白进行Wester...     

植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的构建小鼠植烷酸氧化酶（Phyh）真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-Phyh在NIH3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

抗CD28＋B7.1单抗共刺激PBLs诱导肝癌细胞凋亡的蛋白激酶信号转导

目的 研究Ｔ淋巴细胞活化、增殖、介导肝癌细胞凋亡过程中其蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）和酪氨酸蛋白激酶（ＴＰＫ）的活性变化。方法 用抗ＣＤ２８＋Ｂ７．１（ＣＤ８０）单克隆抗体共刺激正常人外周血淋巴细胞（ＰＢＬｓ）后作用于肝癌细胞（ＢＥＬ－７４０２）。结果 激活的Ｔ细胞中ＰＫＣ、ＴＰＫ活性明显增强,并与肝癌细胞凋亡程度呈正相关。结论 ＰＫＣ、ＴＰＫ在Ｔ细胞活化、增殖及诱导肝癌细胞凋亡的信号转导中起重要作用。     

骨肉瘤细胞中ArgBP2的表达和定位

目的:构建真核表达载体GFP-hArgBP2并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法:以pcDNA3.1-hArgBP2为模板,利用PCR扩增hArgBP2基因cDNA全长,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察GFP-hArgBP2在MG-63细胞中的定位,免疫沉淀的方法纯化hArgBP2蛋白。结果:hArgBP2基因cDNA全长成功构建到真核表达载体pEGFP-C1中,Western blot检测到了GFP-hArgBP2融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为97 000。GFP-hArgBP2在骨肉瘤细胞MG-63中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化hArgBP2蛋白。结论:成功地构建了GFP-hArgBP2真核表达质粒,同时鉴定了GFP-hArgBP2融合蛋白的表达,并纯化hArgBP2蛋白。GFP-hArgBP2蛋白主要定位在细胞质和核周。     

小鼠趋化因子CCL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列,经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3.1-mCCL19Ig,酶切和测序鉴定插入序列;将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达,利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgG1 Fc段序列,其序列分别与GenBank中公布序列比对一致,IgG1 Fc段读码框未发生改变;Western blot结果证实转染了pcDNA3.1-mCCL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38 000的融合蛋白mCCL19Ig表达;体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性,且呈剂量依耐关系。     

Activation of mitogen-activated protein kinase/ERK-2 in phytohaemagglutin in blasts by recombinant interleukin-2: contrasting features with CD3 activation.

We investigated activation of mitogen-activated protein (MAP) kinase, also known as microtubule associated protein-2 kinase (MAP-2K), by recombinant interleukin-2 (rIL-2) in phytohaemagglutinin (PHA)-induced peripheral blood lymphoblasts (PBL). MAP-kinase activation has been implicated in growth of lymphocytes and other cell types. Enzyme activity was purified from cell lysates by ion-exchange chromatography and activity measured by the ability to phosphorylate the substrates MAP-2 and myelin basic protein peptide (APRTPGGRR) in vitro. Recombinant IL-2 stimulated a variable (two-to 10-fold) and evanescent MAP-2K response which was dose dependent over the range 0-50 U/ml. In contrast to MAP-kinase activation by the CD3 receptor, activation by the IL-2 receptor (IL-2R) proceeded independently from protein kinase C (PKC) and extracellular-free Ca2+. MAP-kinase activation by CD3 involves an activation cascade which depends on Ca2+ influx and PKC activation. These events culminate in tyrosine phosphorylation and activation of MAP kinase. Recombinant IL-2 induced tyrosine phosphorylation of several intracellular proteins, including a 40,000 MW substrate which co-electrophoresed with ERK-2 on SDS-PAGE. The ERK-2 gene encodes a 41,000 MW MAP-2K and is subject to regulation by a variety of mitogens and growth factors in lymphocytes and non-lymphoid cells. MAP-kinase activation by rIL-2 was abrogated when PHA blasts were pretreated with the tyrosine protein kinase (TPK) inhibitor, methyl-2,5-dihydroxy-cinnamate. Although the TPK, p56lck, has been implicated in the activation of MAP kinase and the function of IL-2R, we found no mobility shift from a 56,000 to a 60,000 MW position as seen during PKC activation. Together these data suggest that tyrosine phosphorylation is critical to IL-2-mediated signal transduction and that MAP kinase is one of the cellular intermediates involved in this pathway.     

PAK2真核表达载体的构建及在胃癌细胞内的表达与定位

目的 构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位.方法 提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光检测PAK2在胃癌细胞内的定位.结果...     

EGFP-线粒体蛋白导入载体的构建及功能验证

目的 构建能够将外源蛋白导入真核细胞线粒体的真核表达载体,并且通过增强型绿色荧光蛋白的表达进行示踪.方法 利用多重PCR扩增法将线粒体导肽序列与EGFP序列融合在一起,并插入真核表达载体pcDNA3.1,构建成真核表达载体pcDNA5.1-EGFP.将P53基因分别插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1构建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53载体.经酶切和测序验证后在脂质体介导下分别将上述载体转染293T细胞,一方面在荧光显微镜下比较绿色荧光蛋白与细胞色素C在细胞内的分布情况,另一方面通过免疫荧光法比较P53蛋白在细胞内的定位.结果 绿色荧光的表达分布与细胞色素C具有一致性,且转染pcDNA5.1-P53载体的细胞内P53蛋白集中在胞质线粒体中,而转染pcDNA3.1-P53载体的细胞内P53蛋白主要分布在细胞核内.结论 成功构建能够将外源蛋白导入线粒体的真核表达载体.     

小鼠H2B-GFP真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠H2B-绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体，为动态观察小鼠细胞中染色体的形态变化，进一步研究小鼠耐药细胞中双微体（DMs）的形成机制提供有效的分子工具。方法 利用RT-PCR的方法获得小鼠H2B cDNA，以羧基端插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体上，构建H2B-GFP真核表达载体，经菌液PCR、酶切及DNA测序鉴定插入片段大小、方向及序列的正确性，提取质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3进行鉴定。结果 经菌液PCR、酶切和测序，证明小鼠H2B-GFP真核表达载体含有大小、方向及序列正确的H2B cDNA片段，转染NIH3T3后在细胞核中表达。结论 作者成功构建了同时携带有G418筛选位点及多酶切位点的小鼠H2B-GFP真核表达载体，为其在小鼠体外培养细胞中的表达奠定了基础。     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡。 目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H₂O₂)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。 方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF 基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+ H₂O₂)和bFGF转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H₂O₂),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。 结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加(P < 0.01),而bFGF 转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P < 0.01)。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。