胚胎脊髓提取液对神经干细胞分化发育的影响

目的 观察胚胎脊髓提取液(fetal spinal cord extracts,FE)对神经干细胞(neural stem cells,NSC)分化的影响并探讨其机制.方法 制备FE加入NSC培养体系中诱导分化,分别于分化后第3、7天进行免疫荧光细胞化学鉴定,观察分化细胞表型并计算神经元样细胞所占的比例.结果 两组均可观察到神经元,实验组所占比例较高,可达23.39%,明显多于对照组(P＜0.01).两组GFAP阳性星形胶质细胞分化已经比较成熟,也可检测出MBP阳性少突胶质细胞.结论 FE通过提供胚胎脊髓源性神经营养因子、各种细胞因子和细胞外基质,支持NSC成活并诱导其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,且神经元的分化比例达到23.39%.     

食蟹猴骨髓基质干细胞体外诱导分化的实验研究

为观察食蟹猴骨髓基质干细胞（BMSC）体外培养及诱导分化情况，分离食蟹猴的BMSC，以神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果发现，分离得到的食蟹猴BMSC能在体外培养中增殖，分化，这些具有克隆能力的BMSC能表达神经干细胞特异性抗原Nestin，并能进一步诱导分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有GFAP和NSE抗原表达。提示灵长类BMSC是多分化潜能细胞，具有较强的自我更新和多分化能力，在适当的诱导分化条件下可形成具有神经系细胞（神经元和神经胶质细胞）特征的细胞；BMSC可作为神经干细胞的种子细胞。     

控制性诱导细胞分化与组织修复和再生

组织修复与再生实际上是一个受损组织的再发育过程,其中修复细胞的有序增殖和分化是基础,而有目的可控性的诱导细胞增殖与分化则是实现完美修复和再生的重要手段之一.近年来有关采用控制性诱导细胞分化技术实现组织和器官的修复与再生已有较多的报道,已经显示出它潜在的应用前景,值得人们关注和开展相关研究.     

hiPSC多能标志物的表达水平与谱系特异性分化潜能的相关性研究

目的 研究人诱导型多能干细胞(hiPSC)不同多能标志物的相对表达水平与其心肌、神经分化潜能的相关性,为hiPSC作为种子细胞在心脏、神经再生医学研究中的应用提供实验指导.方法 以人类胚胎干细胞(hESC)系h1ESC作为对照,通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测2株hiPSC细胞系多能性基因的表达水平;随后,分别利用心肌分化培养基与神经分化培养基对其进行诱导分化.在心肌分化中,通过比较搏动区域数量与面积以及心肌标志物的表达水平,鉴定不同hiPSC的心肌分化潜能;在神经分化中,通过比较早期花结样细胞团的数量与神经标志物的表达水平,鉴定不同hiPSC的神经分化潜能.最后,通过比对hiPSC多能标志物的表达水平高低与谱系分化潜能高低的对应关系,揭示两者的潜在相关性.结果 RT-qPCR结果显示,两株hiPSC相比,hiPSC-0100细胞系中SOX2表达显著较高、NANOG显著较低,hiPSC-WTB细胞系SOX2表达显著较低、NANOG显著较高(P＜0.05).在分化潜能上,形态学与RT-qPCR检测共同显示,hiPSC-0100表现相对较低的心肌分化潜能、较高的神经分化潜能,hiPSC-WTB表现较高的心肌分化潜能、较低的神经分化潜能(P＜0.05).结论 高表达SOX2、低表达NANOG的hiPSC细胞系倾向于具有较高的神经分化潜能;高表达NANOG、低表达SOX2的hiPSC细胞系倾向于具有较高的心肌分化潜能.     

与原代皮层细胞共培养促进PC12细胞在NGF诱导下向神经元分化

目的　建立体内细胞移植环境的体外共培养系统 ,研究原代皮层神经细胞对PC12细胞向神经元分化的影响。方法　将绿色荧光蛋白 (GFP)标记的PC12细胞植入原代神经细胞建立共培养系统 ,并以神经生长因子(NGF)诱导其中的PC12细胞向神经元分化 ,同时以单独培养的PC12细胞作为对照。激光共聚焦显微镜观察共培养体系及对照组中PC12细胞的分化和神经突起的形成情况。结果　与原代皮层细胞共培养的PC12细胞受NGF诱导后 ,分化的比例更高(由 5 7 13%提高到 6 7 77% ,P <0 0 1) ;数量多于对照组 (由 3 11提高到 4 0 7,P <0 0 0 1) ;神经突起的长度明显高于对照组 (由 14 6 34μm提高到 2 72 17μm ,P <0 0 0 1)。结论　与原代皮层细胞共培养有利于PC12细胞在NGF作用下分化为神经元样细胞及形成神经突起。     

三种亚型多巴胺受体mRNA在人神经干细胞中的体外诱导表达

目的比较不同培养条件下原代神经球细胞中三种多巴胺受体亚型表达的变化，探讨发育过程中不同亚型多巴胺受体表达调控的机制。方法流产胎儿脑组织经体外培养获得神经干细胞球，再用各种因子进行诱导分化，提取细胞总RNA并用RT-PCR方法检测mRNA转录。结果在神经球细胞中三种多巴胺受体均有表达，中脑与海马来源的神经球细胞无显差异。在无血清培养的条件下，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及白介素(Ils)诱导均使得D3受体表达下调，而有血清培养时，白介素(Ils)诱导则不能出现下调或关闭的结果。结论因子诱导产生的分化对于D3受体表达起下调或关闭作用。     

再程序化脂肪干细胞体外定向神经分化效率和机制

目的 探讨再程序化脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外定向神经分化的效率和机制. 方法 体外培养大鼠ADSCs并纯化、鉴定,将第3代ADSCs分为三组:未进行慢病毒介导基因转染ADSCs组(空白组);不含神经元生成素-2(neurogenin-2,Ngn2)基因慢病毒空载体转染ADSCs组(空病毒组);慢病毒载体介导Ngn2基因转染ADSCs组(Ngn2组);各组细胞均用含细胞生长因子的诱导培养基诱导15 d.免疫荧光检测各组细胞神经元特异性蛋白(NeuN)阳性表达以观察神经元分化效率;Western blot检测各组细胞Mash1、Hes1、Dll1蛋白表达水平的差异,探索分化机制. 结果 诱导培养基诱导15 d后,Ngn2组、空病毒组、空白组阳性表达NeuN分别为90.12％、45.34％、40.26％,各组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).Western blot 结果显示,Ngn2组Dll1蛋白表达水平明显高于空病毒组和空白组(P＜0.01),Mash1、Hes1蛋白表达水平明显低于空病毒组和空白组(P＜0.01);空病毒组和空白组Dll1、Mash1和Hes1蛋白表达差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 再程序化ADSCs诱导后神经元分化的比例较单纯ADSCs提高近99％,再程序化ADSCs定向分化神经元机制可能是通过上调Dll1蛋白水平,同时下调Mash1、Hes1蛋白水平,抑制notch信号通路,从而促进细胞的定向神经分化.     

恒河猴骨髓基质细胞体外诱导分化成神经干细胞的实验研究

为研究恒河猴骨髓基质细胞（BMSC）体外培养及诱导分化为神经干细胞的可行性，分离恒河猴BMSC，在体外应用神经干细胞培养液和细胞因子进行诱导分化，利用免疫细胞化学方法进行鉴定。结果发现，恒河猴BMSC能在体外培养中增殖，分化和表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白（Nestin)，并最终能分化为胶质细胞样细胞和神经元样细胞；免疫细胞化学检测可见有神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）抗原表达；未发现维甲酸（RA），表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)对骨髓基质干细胞的诱导分化具有明显影响作用。提示恒河猴BMSC是具有较强的自我更新能力和多分化潜能的细胞，在一定条件下，可分化为表达神经系细胞（神经元和神经胶质细胞）抗原的细胞，可作为神经细胞的种子细胞。     

法舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

 目的探讨HA-1077(fasudil,法舒地尔)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞的影响.方法采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞,免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测.设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2,采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测,观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响.结果采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs,分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞,随着时间延长,阳性率逐渐提高.7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5/8、CK10/13、CK19阳性率均远高于诱导组(P＜0.01).结论HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升,Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用.     

胸腺瘤相关重症肌无力发病的免疫学机制研究进展

重症肌无力(MG)是一种细胞免疫依赖、体液免疫介导、补体参与的获得性自身免疫疾病,但其引起免疫应答的始动环节仍不十分清楚.由于绝大多数MG患者伴随胸腺异常,故推测导致MG发生的免疫反应起始部位可能在胸腺.胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所,后者在此经历阳性选择和阴性选择,从而获得识别外来抗原的能力,但同时也去除了对自身抗原的反应性,因此胸腺的重要作用之一在于诱导自身免疫耐受,从而避免自身免疫性疾病的发生.在伴胸腺增生的MG患者中,胸腺肌样细胞表达的抗原表位与神经肌肉接头的乙酰胆碱受体(AchR)类似,是交叉免疫发生的基础.胸腺瘤来源于胸腺上皮细胞,是可诱导T细胞分化、发育的功能性肿瘤,约15％的MG患者伴有胸腺瘤.由于胸腺瘤相关MG与胸腺增生相关MG的病因并不相同,所以本文通过综述近年来针对胸腺、胸腺瘤与MG发病机制的相关研究,对胸腺瘤在MG发病中的免疫作用机制进行探讨和阐释.     

CyclinD1、P27、CK19、ALDH1A1在乳腺病变中表达及意义

目的探讨细胞周期D1(Cyclin D1)、P27、细胞角蛋白19(CK19)、ALDH1A1在乳腺病变中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化法检测79例乳腺组织标本(包括正常乳腺、乳腺增生、乳腺导管原位癌、乳腺浸润性导管癌)中Cyclin D1、P27、CK19、ALDH1A1的表达情况,分析其与乳腺癌干细胞增殖及乳腺病变组织分化程度之间的关系。结果正常乳腺、乳腺增生、乳腺导管原位癌、乳腺浸润性导管癌中Cyclin D1、ALDH1A1的表达逐渐上升,P27、CK19的表达逐渐下降;乳腺正常及良性增生组织中Cyclin D1、CK19、ALDH1A1的表达明显低于乳腺导管原位癌及浸润性导管癌(P<0.05);乳腺正常及良性增生组织中P27的表达明显高于导管原位癌及浸润性导管癌(P<0.05)。结论 Cyclin D1、P27相互作用调节乳腺癌干细胞的发生及发展过程,CK19、ALDH1A1可作为乳腺癌诊断及恶性程度评估的参考指标。     

p38 MAPK对PDGF诱导的细胞迁移的调控作用

目的 研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的细胞迁移中的作用.方法 PDGF刺激小鼠NIH 3T3细胞后,利用免疫印迹法检测p38磷酸化程度的改变情况.利用Transwell细胞迁移系统来观察PDGF对NIH 3T3细胞迁移的诱导作用,以及p38基因敲除对PDGF诱导的细胞迁移的影响.结果 PDGF能显著诱导NIH 3T3细胞迁移(P＜0.001),且在此过程中p38能被磷酸化激活,p38基因敲除能阻断PDGF诱导的细胞迁移(P＜0.001).结论 p38 MAPK参与了PDGF诱导的细胞迁移的调控.     

HIPK2对肝癌细胞HepG2生物学表型的调控机制研究

目的:研究外源同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)基因表达对人肝癌细胞系HepG2裸鼠成瘤性的影响及机制.方法:将人HIPK2基因的全长cDNA序列克隆至腺病毒载体(pAdeno-HIPK2),制备Adeno-HIPK2重组腺病毒.以50 pfu/细胞的Adeno-HIPK2感染HepG2细胞作为实验组,Adeno-lacZ感染作为阴性对照,未感染细胞作为空白对照,观察各组细胞的裸鼠成瘤性和细胞凋亡情况,并绘制细胞生长曲线.第6周取材,检测各组样品中HIPK2、JNK1、JNK2、P53、mdm2的水平和JNK激酶活性.结果:实验组细胞的裸鼠成瘤性明显降低,细胞凋亡率有所上升.实验组的P53和mdm2的蛋白表达分别是对照组的3倍和15%,JNK1和JNK2基本不变,但JNK激酶活性则升至对照组的5倍. 结论:HIPK2高表达可以激活JNK激酶途径,并有效提高细胞内P53水平,使HepG2细胞的裸鼠成瘤性下降,是肝癌生物治疗中重要目的基因.     

六亚早基二乙酰胺体外诱导人粘液表皮样癌细胞分化的实验研究

用六亚甲基二乙酞胺（ＨＭＢＡ）作为分化诱导剂，对人涎腺粘液表皮样癌细胞系ＭＥＣ－１细胞进行体外诱导（诱导浓度１ｍｍｏｌ／Ｌ），探讨ＨＭＢＡ对粘液表皮样癌细胞的诱导分化作用。实验经细胞生长动力学、细胞ＤＮＡ含量、核仁区嗜银蛋白染色指标观察，显示在ＨＭＢＡ作用下ＭＥＣ－１细胞有向成熟细胞分化的趋势，而且诱导所需浓度低，分化作用明显，有进一步研究价值。     

鼻咽癌细胞辐射抗拒的比较蛋白质组学分析

目的 通过分离并鉴定具有不同辐射抗拒的人鼻咽癌细胞株CNE-2R与CNE-2的差异表达蛋白,探讨与鼻咽癌细胞辐射抗拒相关的分子机制.方法 分别提取鼻咽癌辐射抗拒细胞株CNE-2R及其亲本细胞株CNE-2的总蛋白,采用双向凝胶电泳分离,经软件分析识别差异表达蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.结果 两种不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞株CNE-2R和CNE-2中,共筛选出差异表达明显的蛋白质点有32个,其中11个蛋白质被鉴定成功,在CNE-2R中上调的蛋白有3个,下调的蛋白有8个.结论 不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞的差异表达蛋白,主要涉及调节凋亡、DNA损伤与修复、细胞周期调控、RNA转录、细胞信号转导、细胞骨架组成及辐射应激反应等多个方面.     

小鼠胚胎干细胞自我更新的机制

小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）来源于早期胚胎囊胚期的内细胞团（inner cell mass，ICM），它具有向小鼠胚胎3个胚层细胞分化的能力，它的另一个特点就是维持未分化的状态即自我更新的能力。小鼠ES细胞自我更新依赖于白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、血清或骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）等等。除了外源性的信号通路外，内源性的转录因子对于维持小鼠ES细胞自我更新也十分重要。     

乳腺髓样癌的X线表现--与病理对照并与纤维腺瘤鉴别

目的　评价乳腺X线片鉴别髓样癌与纤维腺瘤以及鉴别典型髓样癌与不典型髓样癌的可能性。资料与方法　回顾性分析乳腺髓样癌 2 7例 ,纤维腺瘤 34例 ,观察X线片表现 ,并与病理进行对照。结果　乳腺髓样癌与纤维腺瘤均以无钙化的肿块常见 ,各占 78%和 74 %。髓样癌为高密度肿块 (19/2 5 ) ,纤维腺瘤多为等密度肿块 (19/2 8) ,两者有显著性差异 (P =0 .0 0 1) ;髓样癌边缘多呈浸润性或小分叶状改变 (2 3/2 5 ) ,而纤维腺瘤表现或为边缘清晰 ,或呈某一投照位置边缘清晰、而另一位置不能见肿块的特殊改变 (2 5 /2 8) ,两者有显著性差异 (P <0 .0 0 1)。 2 7例髓样癌中 ,9例为不典型髓样癌 ,典型髓样癌与不典型髓样癌在肿块形状 (P =0 .6 70 )、边缘 (P =0 .394 )及密度(P =0 .6 37)改变上无明显差异。结论　乳腺髓样癌的X线表现有一定的特征 ,与其病理基础密切相关 ,可与纤维腺瘤作出鉴别。髓样癌病理上又可分为典型髓样癌与不典型髓样癌 ,两者在X线片上无法鉴别     

旋转细胞培养系统模拟微重力环境对小鼠成纤维细胞lncRNA表达的影响

目的 研究旋转细胞培养系统(RCCS)模拟微重力环境对小鼠成纤维细胞株L929 lncRNA表达的影响.方法 体外培养L929细胞,随机分为模拟微重力组(SMG组)和正常重力组(NG组),每组3个样本.SMG组回转器轴心与地面平行旋转,NG组回转器轴心与地面垂直旋转,两组转速一致.RCCS培养7d,收集样本,提取样本总RNA,进行荧光标记和芯片杂交.利用Agilent Mouse lncRNA芯片分别检测SMG组和NG组L929细胞的lncRNA和mRNA表达,筛选差异表达显著的lncRNA,RT-qPCR验证芯片结果;利用GO和Pathway分析差异表达lncRNA的功能分布,结合mRNA差异表达谱,进行lncRNA-mRNA联合分析.结果 lncRNA芯片检测分析发现,RCCS模拟微重力环境下小鼠成纤维细胞L929共有238条差异表达的lncRNA,其中134条表达上调,104条表达下调;差异表达的mRNA共有237条,其中53条表达上调,184条表达下调.获取差异表达lncRNA的聚类分析图,对差异表达显著的4条lncRNA芯片结果进行RT-qPCR验证,结果相吻合.GO分析结果显示差异表达的lncRNA与巨噬细胞分化、伤口愈合的负性调节等生物学过程相关,Pathway分析结果显示差异表达的lncRNA与系统性红斑狼疮、TGF-β等信号通路相关.同时成功构建了lncRNA-mR-NA-TF可视化网络图.结论 RCCS模拟微重力环境显著影响L929细胞的lncRNA及mRNA表达谱,基于芯片技术的ln-cRNA靶基因预测和功能富集分析可为失重应激损伤机制探讨和修复措施建立提供理论依据.     

In vivo bioluminescence reporter gene imaging for the activation of neuronal differentiation induced by the neuronal activator neurogenin 1 (Ngn1) in neuronal precursor cells

Purpose

Facilitation of the ability of neuronal lineages derived from transplanted stem cells to differentiate is essential to improve the low efficacy of neuronal differentiation in stem cell therapy in vivo. Neurogenin 1 (Ngn1), a basic helix-loop-helix factor, has been used as an activator of neuronal differentiation. In this study, we monitored the in vivo activation of neuronal differentiation by Ngn1 in neuronal precursor cells using neuron-specific promoter-based optical reporters.

Methods

The NeuroD promoter coupled with the firefly luciferase reporter system (pNeuroD-Fluc) was used to monitor differentiation in F11 neuronal precursor cells. In vitro luciferase activity was measured and normalized by protein content. The in vivo-jetPEI^TM system was used for in vivo transgene delivery. The IVIS 100 imaging system was used to monitor in vivo luciferase activity.

Results

The Ngn1-induced neuronal differentiation of F11 cells generated neurite outgrowth within 2 days of Ngn1 induction. Immunofluorescence staining demonstrated that early and late neuronal marker expression (βIII-tubulin, NeuroD, MAP2, NF-M, and NeuN) was significantly increased at 3 days after treatment with Ngn1. When Ngn1 and the pNeuroD-Fluc vector were cotransfected into F11 cells, we observed an approximately 11-fold increase in the luciferase signal. An in vivo study showed that bioluminescence signals were gradually increased in Ngn1-treated F11 cells for up to 3 days.

Conclusion

In this study, we examined the in vivo tracking of neuronal differentiation induced by Ngn1 using an optical reporter system. This reporter system could be used effectively to monitor the activation efficiency of neuronal differentiation in grafted stem cells treated with Ngn1 for stem cell therapy.