肝细胞生长因子促进脊髓组织块离断神经突起再生的体外观察

背景：肝细胞生长因子可促进体外培养的皮层神经细胞突起生长，在无血清条件下支持皮层神经元的存活，因此被认为是一种新发现的神经营养因子。 目的：采用半固体培养基系统培养脊髓组织块，原位观察脊髓组织块神经突起再生及肝细胞生长因子对组织块神经突起再生的作用。 设计：观察对比实验。 单位：解放军军事医学科学院放射医学研究所实验血液学研究室。 材料：实验于2004-08／2005-05在解放军军事医学科学院放射医学研究所实验血液学研究室和基础医学研究所神经生物学研究室完成。选用40只Wistar胚胎大鼠，孕期14-16d，由解放军军事医学科学院动物中心提供。鼠尾胶原取自成年250&;#177;50g雄性Wistar大鼠。 方法：①用自备的鼠尾胶原制作半固体培养基系统，无菌条件下快速分离出孕期14-16d胚鼠的脊髓，剪成0．5-1．0mm^3的小块，置于半固体培养基中作为原代培养，组织块生长5d时，将发出的神经突起在距离脊髓组织块约200mm处离断，并在离断远端将约2mm^2大小的鼠尾胶去除，用2mL鼠尾胶原重新铺缺损区，待新铺鼠尾胶原固化后加液体培养基作为二代培养，在离断后0，l，6，12和24h，通过显微镜原位连续观察神经突起再生。②将突起离断后的培养基改为含0．5％的N3条件培养基，以加入10μg/L肝细胞生长因子作为实验组，加入含0.5％N3的无血清的DMEM培养基作为对照组，用每个组织块再生突起最长的3根突起长度均值代表这个组织块神经再生情况，每组分别观察12个组织块，24h后观察计算两组神经再生突起长度，比较两组神经突起再生情况。 主要观察指标：①原位神经突起再生情况。②对照组与实验组神经突起再生状况比较。 结果：①原位神经突起再生情况：刚离断时在离断部位两侧神经突起开始崩解，持续时间约1.2h，在离断近端延伸的距离约20mm。此后近端神经突起逐渐变得增粗、肿胀，神经突起停止崩解并开始向外延伸，神经再生开始，而且再生速度在划伤12h后明显加快。再生的神经纤维较划伤前的纤维分支增多。②对照组与实验组神经突起再生情况：实验组神经再生突起长度明显大于对照组[（375&;#177;96）mm，（200&;#177;75）mm,（P〈0.05）]。 结论：①建立了一种原位观察神经组织块突起再生的方法，此方法简单、经济。②肝细胞生长因子体外能促进脊髓组织块神经突起再生。     

大鼠急性肺栓塞模型中CA3和NHE1表达的变化

目的研究大鼠急性肺栓塞模型肺组织中与酸碱平衡相关的碳酸酐酶3（CA3）和Na+/H+交换器（NHE1）的表达变化。方法建立大鼠急性肺栓塞模型,分别在急性肺栓塞后1、8、24和48 h开胸取出肺组织,然后提取肺组织的总RNA和总蛋白,以正常组为对照,采取半定量RT-PCR的方法研究CA3和NHE1在mRNA水平表达的变化;采用western-b lot方法进一步验证CA3和NHE1在蛋白水平表达的变化;同时采用免疫组织化学的方法检测大鼠肺组织中NHE1在肺栓塞前后表达的变化。结果在大鼠急性肺栓塞后的不同时间点,CA3的mRNA水平和蛋白水平均逐渐降低,而NHE1在mRNA水平和蛋白水平的表达都出现逐渐升高现象。免疫组化研究表明NHE1主要分布在支气管黏膜上皮和细支气管黏膜上皮的胞浆内,急性肺栓塞后NHE1在上皮细胞内的表达明显升高。结论大鼠急性肺栓塞后肺组织内CA3的表达降低,NHE1的表达升高,这一现象可能与机体的酸碱平衡调节相关。     

埃博拉病毒NP抗原表位区段的克隆和表达

目的分析埃博拉病毒核蛋白（ NP）抗原表位,克隆表达埃博拉病毒NP抗原,为免疫学诊断试剂的研究奠定基础。方法采用BioSun生物学软件预测分析埃博拉病毒NP抗原的氨基酸表位区间,采用大肠杆菌优势密码子反向翻译成基因序列,采用PCR退火合成法合成NP优势密码子抗原基因,并利用载体pBVIL1进行克隆表达。采用间接ELISA技术评价获得NP抗原的特异性。结果确定埃博拉病毒NP抗原的氨基酸表位位于360～739 aa,共设计36条引物,扩增合成1140 bp的NP抗原基因,克隆表达后,融合蛋白相对分子质量为58×103,测序结果显示插入的NP基因正确。初步结果显示,NP抗原的特异性为99．24％（130／131）。结论获得埃博拉病毒NP抗原,为进一步研制特异的埃博拉病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。     

加味生脉散对大鼠缺血再灌注肾脏损伤的保护作用

目的：观察加味生脉散对大鼠缺血再灌注肾脏损伤的保护作用。方法：双侧肾动脉夹闭45min，再灌注24h，造成大鼠缺血再灌注肾脏损伤模型。分别测定加味生脉散治疗组、病理模型组、假手术组大鼠血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）、组织中髓过氧物酶（MPO）和丙二醛（MDA）浓度，并进行组织病理学检查。结果：与病理模型组相比，加味生脉散治疗组的缺血再灌注大鼠血尿素氮下降42．8％（P=0．024），血清肌酐下降55．9％（P=0．011）；肾脏组织MPO及MDA含量明显降低（P＜0．01）；组织病理学改变明显减轻（P＜0．05）。结论：加味生脉散可减轻缺血再灌注引起的肾脏损伤，其机制与降低缺血再灌注有关的自由基损伤和炎性损伤有关。     

FM1-43造影观察PC12神经元与原代皮层神经元间的突触形成

目的 观察种植到原代皮层神经元中的PCI2细胞，在神经生长因子(nerve growth factor NGF)作用下分化成的神经元样细胞与原代皮层神经元之间功能性突触的形成，研究细胞移植环境中宿主细胞和移植细胞形成神经连接的可能及过程。方法 将绿色荧光蛋白(enhenced green flourescent protein EGFP)标记的PC12细胞种植到原代神经元中，建立共培养系统。NGF诱导其中的PC12细胞分化为神经元样细胞，可能与共培养的原代神经元形成突触连接。高钾离子的去极化刺激使突触末端囊泡被FM143染色，激光共聚焦扫描显微镜下观察，电子图像显示出活性的突触末端。结果 和对照组相比共培养系统中PC12神经元更成熟，FM1—43造影显示这些新的神经元与原代神经元之间产生了功能性突触囊泡活动。结论 与原代的神经细胞共培养有利于PCI2细胞在NGF作用下分化为神经元样细胞及形成神经突起，新形成的神经元可以和宿主神经元形成突触连接。     

神经元损伤修复机制研究的离体模型--体外培养原代神经元损伤模型的建立及损伤后c-Fos蛋白表达

目的：建立一个模拟脊髓全横断损伤后脊髓组分——原代培养的脊髓神经元损伤的模型。方法：取Wistar大鼠(孕14d)脊髓，培养10～12d后，采用所设计的标准模板，直视下进行损伤。观察损伤前后不同时间神经元的形态及即刻早期基因c-fos的表达变化。结果：在损伤8～12h后，损伤两侧存活的神经元突起便开始朝着损伤部位生长，随着时间的延长，神经元突起甚至可跨越损伤处而延伸至对侧。c-fos基因在损伤后10min即有表达，2h达到最高峰，随后逐渐下降。结论：此模型可用于模拟体外培养的脊髓神经元受到机械损伤以及观察神经元损伤后进行修复的一些分子事件，简便而可靠，实用性较强。     

大鼠急性肺血栓栓塞后血中DBP、RBP和TTR表达降低

目的探讨急性肺血栓栓塞时维生素D结合蛋白(DBP)、维生素A结合蛋白(RBP)和甲状腺素转运蛋白(TTR)的表达变化及对代谢的影响。方法用颈静脉插管注入血栓的方法制备大鼠急性肺栓塞模型。用Western blot检测DBP、RBP和TTR蛋白水平,RT-PCR法检测肝组织中DBP、RBP和TTR的mRNA水平,放射免疫法测定FT4和25(OH)D3的血清浓度,微量荧光法测定维生素A的血清浓度。结果急性肺栓塞后血清中DBP、RBP和TTR的蛋白水平,肝组织中DBP、RBP和TTR的mRNA水平均逐渐降低;而血清中这3个结合蛋白的配体FT4、25(OH)D3和维生素A的水平明显升高。结论急性肺栓塞后血清中DBP、RBP和TTR的蛋白水平降低是由于肝细胞合成减少所致,从而释放出更多的配体。升高的25(OH)D3、维生素A和FT4分子在急性肺栓塞后的一系列病理生理变化中将发挥重要作用。     

急性肺栓塞后osteoglycin的表达及对胶原代谢的影响

目的 研究大鼠急性肺栓塞模型肺组织中osteoglycin(OGN)的表达变化及其对胶原代谢的影响.方法 建立大鼠急性肺栓塞模型,分别在急性肺栓塞后1、8、24和48h开胸取出肺组织,提取总RNA和总蛋白.以正常大鼠为对照组,采用半定量RT-PCR研究OGN mRNA的表达变化,采用Western blot进一步验证OGN蛋白表达的变化,采用免疫组织化学方法检测肺栓塞前后大鼠肺组织中OGN的表达变化及组织分布情况,采用Masson染色观察急性肺栓塞4周后肺组织内的胶原沉积状况.结果 在大鼠急性肺栓塞后,OGN在mRNA及蛋白水平均逐渐降低.免疫组化染色显示OGN主要分布在支气管黏膜上皮细胞下层、软骨组织和肺泡周围,且在肺动脉内皮细胞下层、外膜和肺静脉的内膜、中膜以及外膜均有分布.急性肺栓塞后OGN在上述组织内的表达均明显降低.急性肺栓塞4周后肺组织内的胶原沉积明显增加.结论 大鼠急性肺栓塞后肺组织内OGN表达降低,促进了胶原在肺部的沉积.     

两种不同溶液体系提取大鼠脊髓蛋白双向电泳图谱比较

目的：比较尿素／CHAPS和尿素／硫脲／CHAPS／SB3－10两种不同溶液体系提取大鼠脊髓蛋白双电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE)图谱的差异。方法：大鼠脊髓经三氯醋酸／丙酮沉淀粉蛋白后,分别用尿素／CHAPS和尿素／硫脲／CHAPS／SB3－10两种不同的溶液体系提取蛋白。以固相PH梯度（IPG）等电聚焦为第一向,SDS－PAGE水平电泳为第二向进行蛋白质2－DE。图像分析软件ImageMaster 2D Elite3.01分析蛋白质2－DE图谱。结果：两种蛋白提取溶液分别获得1059和1023个蛋白（亚基）斑点,其中790个蛋白在两张图谱中重叠,其余269和233个蛋白点为两种体系各自所特有。两种提取方法共获得1292个蛋白斑点。结论：综合使用不同蛋白提取方法有助于提高组织蛋白2－DE图谱的完整性。     

体外切割损伤脊髓神经元对其Fos、ChAT及GAD表达的影响

目的:研究切割损伤对体外培养脊髓神经元Fos、胆碱乙酰转移酶(ChAT)及谷氨酸脱羧酶(GAD)表达的影响。方法:脊髓神经元纯化培养后分别计数碘化丙啶(PI)阳性细胞数和微管相关蛋白2(MAP2)阳性细胞数,决定脊髓神经元纯度。根据本实验室已建立的损伤模型,对原代纯化培养脊髓神经元进行切割损伤。通过免疫组化及WesternBlot方法比较神经元损伤前后Fos、ChAT和GAD表达的变化情况。结果:脊髓神经元纯化培养后纯度达到92%。免疫组化及WesternBlot显示,切割损伤组与正常组相比,Fos、GAD表达上调,而ChAT表达降低。结论:Fos、GAD和ChAT可能参与脊髓神经元急性损伤及随后的修复过程,其生物学意义有待进一步探讨。