Gli-1信号通路对TGF-β1诱导的人胃癌细胞上皮间质转化和侵袭的影响

目的:探讨核转录因子神经胶质瘤关联癌基因同源物1（glioma associated oncogene homolog 1,Gli-1）对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人胃癌SGC-7901细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用机制。方法:体外采用10 ng/ml TGF-β1对胃癌SGC-7901细胞进行处理,使用倒置显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR和Western blot检测EMT上皮表型蛋白E-cadherin和间质表型蛋白Vimentin的表达水平;Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力变化,检测TGF-β1 对SGC-7901细胞发生EMT 的影响;同时采用RT-PCR和Western blot检测Gli-1的mRNA和蛋白表达水平。随后进一步采用Gli-1基因特异性阻断剂GANT 61阻断Gli-1表达,并使用TGF-β1（10 ng/ml）对SGC-7901细胞进行处理,RT-PCR 和Western blot检测Gli-1、E-cadherin和Vimentin mRNA 及其蛋白表达水平的改变,并使用Transwell细胞侵袭实验检测阻断Gli-1对SGC-7901细胞侵袭能力的影响。结果:TGF-β1可以诱导人胃癌SGC-7901细胞发生上皮间质转化并促进细胞侵袭。TGF-β1可以在mRNA和蛋白水平下调上皮表型蛋白E-cadherin的表达、提高Gli-1和间质表型蛋白Vimentin的表达。TGF-β1可以明显提高SGC-7901细胞侵袭,而阻断Gli-1后可以抑制TGF-β1诱导的人胃癌SGC-7901细胞上皮间质转化和细胞侵袭。结论:胃癌SGC-7901细胞中Gli-1 可能参与TGF-β1 介导的EMT 的发生,Gli-1 可能作为胃癌基因治疗中的有效靶点发挥作用。     

β-catenin在膀胱癌上皮-间质转化中的作用及相关机制

目的:探讨β-catenin在膀胱癌上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中的作用以及相关分子机制。方法:利用siRNA靶向沉默膀胱癌细胞系T24细胞的β-catenin基因,并利用Real-time quantitative PCR和Western blot实验验证siRNA敲减效率。通过Transwell实验检测β-catenin敲减后T24细胞的侵袭能力,进一步使用Real-time quantitative PCR和Western blot实验检测β-catenin敲减后T24细胞的EMT相关标志物的变化。最后,通过下载TCGA数据库,并分析β-catenin与EMT相关标志物的相关性。结果:我们成功在mRNA和蛋白水平上沉默了β-catenin。通过Transwell实验发现,与对照组相比,β-catenin敲减组细胞的侵袭能力下调。与对照组相比,β-catenin敲减组的Slug蛋白、Vimentin蛋白和mRNA下调,E-cadherin蛋白和mRNA上调。通过分析TCGA数据库发现,β-catenin与Slug（r=0.183 5,P=0.000 2）和Vimentin (r=0.190 3,P=0.000 1)均呈正相关。结论:β-catenin通过调控Slug的表达从而调控膀胱癌细胞的EMT。     

尼古丁诱导肺癌细胞上皮间质转化促进其侵袭转移

背景与目的我们的前期研究发现尼古丁能诱导肺癌细胞上皮间质转化。本研究的目的是探讨尼古丁诱导的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）与肺癌侵袭之间的关系。方法应用不同浓度尼古丁处理肺腺癌A549细胞,应用Real-time PCR和Western blot方法检测EMT相关分子标志物E-钙粘蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）mRNA和蛋白表达水平,应用免疫荧光技术检测β-链蛋白（β-catenin）蛋白表达位置的变化,应用划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测尼古丁对肺癌细胞迁移侵袭能力的影响。结果尼古丁明显下调肺癌细胞株A549 E-cadherin mRNA和蛋白水平表达（P<0.01, P<0.01）,并具有浓度和时间依赖性;尼古丁明显上调肺癌细胞株A549 Vimentin mRNA和蛋白水平表达（P<0.01, P<0.01）;尼古丁诱导肺癌细胞株A549细胞β-catenin蛋白发生核转移;划痕实验和侵袭实验观察到尼古丁处理的肺癌细胞株A549细胞的迁移和侵袭能力明显增强（P<0.01, P<0.01）。结论尼古丁能够诱导肺癌细胞发生EMT,并且促进肺癌细胞株A549细胞的体外侵袭潜能。     

姜黄素通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制TGF-β1诱导的肺癌细胞上皮间质转化

摘 要：［目的］ 探讨姜黄素对TGF-β诱导的肺癌A549细胞上皮间质转化、侵袭转移的影响及其可能的机制。［方法］ 通过转化生长因子TGF-β1诱导肺癌细胞株A549发生上皮间质转化;利用不同浓度姜黄素干预由TGF-β1诱导的肺癌 A549细胞,倒置显微镜观察细胞形态变化,细胞划痕实验、Transwell 侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力变化,Western blot法检测上皮表型标记蛋白E-cadherin和间质表型标记蛋白N-cadherin、Vimentin的表达及PI3K/AKT/mTOR信号通路中AKT、mTOR磷酸化的情况,并利用PI3K抑制剂LY290004、mTOR抑制剂Rapamycin通过上述方法对姜黄素的作用进行印证。［结果］ 与对照组相比,姜黄素显著增加A549细胞E-cadherin的表达,抑制N-cadherin和Vimentin蛋白及TGF-β1刺激p-AKT和p-mTOR的表达,且呈明显的剂量—时间依赖关系;同时抑制TGF-β诱导的侵袭迁移。［结论］ 姜黄素可通过PI3K/AKT/mTOR通路明显抑制TGF-β1诱导的肺癌A549细胞上皮间质转化,降低其侵袭迁移能力。     

ROR1对人肺癌A549细胞上皮-间质转化的影响

目的 探讨受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor,ROR1）诱导人肺癌A549细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的作用及可能机制。方法 构建ROR1慢病毒表达载体,感染A549细胞筛选稳定过表达ROR1的A549细胞,采用划痕实验、Transwell实验检测A549细胞的侵袭和迁移能力; real-time PCR、Western blot分别检测ROR1、EMT相关标志物的表达。结果 过表达ROR1能够促进A549细胞向间质样细胞表型转化,Western blot结果显示Vimentin、N-cadherin表达上调, E-cadherin表达下调;划痕实验、Transwell结果显示细胞侵袭迁移能力显著增强（P=0.0023）;Western blot结果显示过表达ROR1能够上调EMT转录因子Snail的表达,干扰Snail能够逆转ROR1诱导的EMT,即下调Vimentin、N-cadherin表达,上调E-cadherin表达;划痕实验、Transwell结果显示干扰Snail显著降低细胞侵袭迁移能力（P=0.013）;进一步研究发现ROR1通过激活AKT信号而促进Snail的表达。结论 ROR1能够促进人肺癌A549细胞EMT转化,其机制可能与ROR1调控AKT/Snail信号有关。     

食管鳞癌EC-9706细胞中mTOR信号通路在TGF-β1介导的EMT中的作用

目的:探讨食管鳞癌EC-9706细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路活化在转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)介导的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用.方法:TGF-β1(终质量浓度为7.5 ng/mL)或TGF-β1(终质量浓度为7.5 ng/mL)+雷帕霉素(终浓度为200 nmol/L)作用食管鳞癌EC-9706细胞后,在倒置显微镜下观察细胞形态的变化,RT-PCR及蛋白质印迹法检测EC-9706细胞中mTOR和E-cadherin mRNA及其蛋白的表达,通过Boyden小室实验检测EC-9706细胞侵袭能力的变化.构建裸鼠食管鳞癌EC-9706细胞移植瘤模型,RT-PCR及蛋白质免疫印迹法检测雷帕霉素作用后,移植瘤组织中mTOR和E-cadherin mRNA及其蛋白的表达.结果:TGF-β1作用后,EC-9706细胞梭形化明显,mTOR mRNA及p-mTOR蛋白的表达水平高于未进行任何处理的EC-9706细胞对照组(P＜0.05),E-cadherin mRNA及其蛋白的表达水平低于对照组(P＜0.05),细胞侵袭能力明显高于对照组(P＜0.05); TGF-β1+雷帕霉素组EC-9706细胞mTOR mRNA及p-mTOR蛋白的表达水平低于TGF-β1单药作用组(P＜0.05),E-cadherin mRNA及其蛋白的表达水平高于TGF-β1单药作用组(P＜0.05),细胞侵袭能力较TGF-β1单药作用组明显下降(P＜0.05).雷帕霉素作用后,裸鼠食管鳞癌EC-9706细胞移植瘤组织中mTOR mRNA及p-mTOR蛋白的表达水平低于对照组(P＜0.05),E-cadherin mRNA及其蛋白的表达水平高于对照组(P＜0.05).结论:食管鳞癌EC-9706细胞中mTOR可能参与TGF-β1介导的EMT的发生,mTOR可能作为食管鳞癌基因治疗中的有效靶点发挥作用.     

顺铂间歇性干预对A549中干细胞及EMT相关基因表达的影响

目的:研究肺癌细胞A549在顺铂(DDP)间歇性干预后肿瘤干细胞(CSC)标志物(CD133)和上皮细胞间质转化(EMT)标志物(E-cadherin、β-catenin、Vimentin和Fibronectin)表达的变化,探讨肺癌耐药和CSC及EMT之间的相关性。方法:应用CCK-8法检测A549细胞对DDP的敏感性,DDP IC50间歇性处理A549细胞,采用Western blot法检测CD133蛋白表达变化,RT-q PCR法测定A549细胞处理前后E-cadherin、β-catenin、Vimentin和Fibronectin mRNA的表达。结果:肺腺癌细胞A549经DDP间歇性干预后,CSC标记物CD133蛋白表达增高,E-cadherin和β-catenin mRNA的相对表达量均显著降低,Vimentin mRNA的相对表达量显著增高。结论:A549细胞经DDP间歇性干预后有CSC标志物的表达,并表现出EMT的特性。     

去泛素化酶USP33对胃癌上皮细胞-间质转化的影响及对癌细胞迁移、侵袭的作用

摘 要：［目的］ 观察去泛素化酶USP33对胃癌上皮细胞-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）及细胞迁移侵袭能力的影响,并探究其作用机制。［方法］ qRT-PCR法检测胃癌上皮细胞MGC-803、SGC-7901和人胃黏膜上皮细胞GES-1中去泛素化酶USP33的表达。MGC-803和SGC-7901细胞转染USP33-siRNA沉默USP33基因表达,qRT-PCR检测沉默效率,使用转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）信号通路抑制剂SB431542处理沉默USP33后的MGC-803和SGC-7901细胞,MTT法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot法检测细胞E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、TGF-β、Smad2和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达水平。［结果］ qRT-PCR检测结果显示,与GES-1细胞比较,MGC-803、SGC-7901细胞中USP33表达水平显著性降低。MTT实验、划痕实验和Transwell实验检测结果显示,USP33基因敲低后,MGC-803、SGC-7901细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著性提高。Western blot检测结果显示,沉默USP33可使MGC-803和SGC-7901细胞E-cadherin表达降低,N-cadherin、Vimentin、TGF-β、Smad2和α-SMA表达升高,而TGF-β抑制剂SB431542则逆转了这一现象,上述指标差异均有统计学意义（P＜0.05）。［结论］ USP33能够抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及EMT转化,沉默USP33可增加其增殖、迁移和侵袭能力并促进EMT转化过程,其作用机制与抑制TGF-β信号通路的活化有关。     

沉默LIMK1抑制人结肠癌SW480细胞上皮-间质转化

目的:研究沉默LIMK1对人结肠癌SW480细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）的影响。方法:RT-PCR、Western blot、免疫荧光与免疫组化检测沉默LIMK1对EMT相关分子表达的影响。裸鼠实验检测沉默LIMK1对移植瘤生长的影响。结果:RT-PCR检测显示，沉默LIMK1可下调Vimentin和上调E-cadherin mRNA表达(P<0.05)。Western blot显示，沉默LIMK1可明显下调SW480细胞Snail及Vimentin蛋白表达和上调E-cadherin表达(P<0.05)。免疫荧光显示，LIMK1沉默细胞Snail与Vimentin阳性信号较对照组明显减弱，而E-cadherin阳性信号显著增强。裸鼠实验结果显示，沉默组肿瘤生长速度较SW480组明显减慢(P<0.05)。沉默组移植瘤瘤重（0.16±0.079）g较SW480组（0.86±0.165）g明显减少，瘤重抑制率为97.7%(P<0.05)。LIMK1沉默组移植瘤较对照组的Ki-67、Vimentin、Snail与CD34阳性表达明显减弱，而E-cadherin表达明显增加。结论:沉默LIMK1可体外抑制人结肠癌SW480细胞EMT。     

乳腺癌MCF-7细胞通过TGF-β诱导的上皮-间质转化获得耐药北大核心CSCD

目的:通过研究高侵袭转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和低侵袭转移性细胞株MCF-7中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和耐药的相关性,以探讨乳腺癌耐药的机制。方法:采用实时荧光定量PCR法检测MDA-MB-231和MCF-7细胞中EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和纤黏蛋白(bronectin)以及转录因子Snail、Slug和锌指E-box同源结合框1(Zincnger E-box binding homeobox 1,ZEB1)mRNA的表达水平;划痕愈合实验和Transwell小室实验分别检测MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移和侵袭能力;CCK-8法检测MDA-MB-231和MCF-7细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇的敏感性,并采用实时荧光定量PCR法检测耐药基因多重耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MDR1)和MDR相关蛋白1(MDR-associated protein,MRP1)mRNA的表达水平。用转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)诱导MCF-7细胞发生EMT,或用靶向E-cadherin基因的E-cadherin-siRNA沉默EMT相关标志物E-cadherin的表达,再用CCK-8法检测MCF-7细胞对5-氟尿嘧啶敏感性的变化。结果:MDA-MB-231细胞中vimentin、fibronectin、Slug和ZEB1 mRNA的表达水平均高于MCF-7细胞(P值均<0.000 1),E-cadherin mRNA的表达水平明显低于MCF-7细胞(P=0.000 2),Snail mRNA的表达水平无明显差异。与MCF-7细胞相比,MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力明显更强(P值均<0.000 1);5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇对MDAMB-231细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值明显高于MCF-7细胞(P值均<0.05);MDA-MB-231细胞中耐药相关基因MDR1和MRP1 mRNA表达水平明显更高(P值均<0.000 1)。TGF-β诱导MCF-7细胞发生EMT后,5-氟尿嘧啶对MCF-7细胞的IC50值明显上升(P<0.05);沉默E-cadherin表达后,MCF-7细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性明显增强(P<0.05)。结论:乳腺癌中EMT和耐药存在相关性,诱导EMT发生可导致细胞耐药。     

解整合素金属蛋白酶10通过介导Wnt/β-catenin信号通路促进子宫内膜癌细胞上皮-间质转化

目的:探讨解整合素金属蛋白酶10（ADAM10）对子宫内膜癌（EC）细胞上皮-间质转化（EMT）的影响及其作用机制。方法:收集84例EC患者的新鲜癌组织及癌旁组织标本,采用qRT-PCR检测癌组织及其癌旁组织中ADAM10 mRNA表达水平。以人EC细胞株HEC-1B作为研究对象,采用ADAM10过表达慢病毒感染HEC-1B细胞,并联合Wnt/β-catenin信号通路特异性抑制剂XAV939进行干预,再将细胞分为空白对照组（blank）、慢病毒阴性对照组（Lv-NC）、ADAM10过表达慢病毒组（Lv-ADAM10）和Lv-ADAM10+XAV939组。采用qRT-PCR检测感染后各组细胞中ADAM10 mRNA表达水平;划痕和Transwell实验检测各组细胞的迁移和侵袭能力;Western blot法分析各组细胞中ADAM10及EMT相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平。结果:EC患者癌组织中ADAM10 mRNA表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.05）。与blank组或Lv-NC组比较,Lv-ADAM10组细胞中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平以及N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Snail、MMP2和MMP9等蛋白表达水平均显著升高（均P＜0.05）,而E-cadherin蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,同时细胞迁移和侵袭能力显著增强（均P＜0.05）。与Lv-ADAM10组比较,Lv-ADAM10+XAV939组细胞中N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Snail、MMP2和MMP9等蛋白表达水平显著降低（均P＜0.05）,E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,且细胞迁移和侵袭能力明显降低（均P＜0.05）。结论:ADAM10在EC组织中高表达,其过表达可促进HEC-1B细胞的EMT进程,其作用机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

C-藻蓝蛋白抑制TGF-β1诱导的宫颈癌Caski细胞上皮-间充质转化

目的：探究C-藻蓝蛋白（C-phycocyanin，C-PC）对转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）诱导的 宫颈癌Caski细胞上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的影响。方法：根据处理方法不同将Caski细胞分为 3组即10 ng/ml TGF-β1处理组、 10 ng/ml TGF-β1+300 μg/ml C-PC共处理组和对照组（未加药处理），处理24 h后观察细胞的形态 变化；采用划痕实验及Transwell实验分别检测TGF-β1和C-PC对Caski细胞迁移和侵袭的影响；Western blotting方法检测C-PC 对TGF-β1诱导的Caski细胞上皮表型标志蛋白E-cadherin、间质表型标志蛋白N-cadherin表达水平的影响；qPCR 法检测间质表 型相关锌指转录因子Snail、Zeb1、Twist mRNA的表达。结果：TGF-β1处理组Caski细胞失去原有的上皮表型的特征， 而TGF-β 1+C-PC共处理组细胞保持正常的上皮表型的特征；TGF-β1处理组Caski细胞的迁移率[（60.0±1.4） % vs（33.5±2.2） %、（40.0± 2.8） %， 均P<0.05]和侵袭穿膜细胞数[（108.2±6.2）vs（25.2±3.1）、（39.8±5.4）个， 均P<0.01]较共处理组和对照组显著升高；与对照 组相比，TGF-β1处理组Caski细胞中E-cadherin表达显著降低（P<0.05），Twist、Snail、Zeb1的mRNA表达水平显著升高（P<0.01）， 而加入C-PC共处理可逆转上述改变（P<0.05或P<0.01），同时显著降低N-cadherin的蛋白表达水平（均P<0.05）。结论：C-PC处 理能够抑制TGF-β1诱导的Caski细胞侵袭转移能力进而影响EMT过程，其机制可能与C-PC处理降低Twist、Snail、Zeb1的 mRNA表达有关。     

MicroRNA-29a靶向抑制PTEN基因诱导非小细胞肺癌细胞上皮间质转化的机制研究

目的:探讨microRNA-29a（miR-29a）及其靶蛋白PTEN在TGF-β1诱导非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）中的作用机制。方法:选择A549细胞经终浓度为10 ng/ml TGF-β1诱导48 h后,分为Blank组（不转染任何序列）、阴性对照（negative control,NC）组（转染阴性对照序列）、IN组（转染miR-29a inhibitors）、siRNA组（转染PTEN-siRNA）和IN+siRNA组（共转染miR-29a inhibitors和PTEN-siRNA）。普通显微镜观察各组细胞形态学变化;免疫荧光检测各组细胞中E-cadherin表达水平;qRT-PCR法检测EMT相关因子及PTEN mRNA表达水平;Western blotting法检测转染后EMT相关因子、PTEN、Akt和p-Akt蛋白的表达;划痕实验检测各组细胞迁移能力。构建裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤生长,免疫组化检测裸鼠肿瘤组织中PTEN及EMT相关因子蛋白表达水平。结果:A549细胞转染miR-29a inhibitors后TGF-β1诱导细胞的上皮间质转化显著受到抑制,N-cadherin、Vimentin及Slug的mRNA和蛋白表达水平在IN组中显著低于Blank组和NC组,但在siRNA组和IN+siRNA组中显著上调（均P<0.05）。与Blank组和NC组相比,IN组PTEN mRNA和蛋白表达水平明显升高,且p-Akt的表达显著降低,细胞迁移率显著下降,而siRNA组和IN+siRNA组PTEN mRNA和蛋白表达明显降低,p-Akt的表达显著上升,细胞迁移率显著升高（均P<0.05）。裸鼠移植瘤实验结果显示与Blank组和NC组相比,IN组肿瘤生长较慢,重量降低,E-cadherin和PTEN蛋白表达显著升高,N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Slug蛋白表达显著降低（均P<0.05）。结论:TGF-β1能诱导NSCLC细胞发生EMT,且能上调miR-29a并抑制PTEN的表达水平;抑制miR-29a的表达水平可能通过上调靶基因PTEN,促进Akt磷酸化,抑制EMT的发生。     

IFN-γ通过诱导上皮间质转化增强人乳头状甲状腺癌细胞株的侵袭转移能力

目的:观察IFN-γ对人乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1侵袭和转移能力的影响,并探讨上皮间质转化过程（EMT）在其中的作用。方法:采用划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测IFN-γ对TPC-1侵袭转移能力的影响;实时定量PCR和Western检测EMT标志物E-cadherin,N-cadherin,Vimentin的mRNA水平及蛋白水平变化;免疫荧光检测上述标志物的定位表达。结果:划痕愈合实验和Transwell侵袭实验结果显示:IFN-γ增强了TPC-1的侵袭转移能力（P＜0.05）,实时定量PCR结果显示EMT的上皮标志物E-cadherin的mRNA表达水平明显下降,间质标志物Vimentin的mRNA表达上调,而N-cadherin的mRNA未见明显变化。Western结果显示E-cadherin在IFN-γ作用下表达下调;N-cadherin与Vimenin表达上升;免疫荧光结果与Western结果一致。结论:INF-γ可以通过诱导EMT,促进TPC-1侵袭转移,提示炎性介质IFN-γ可能参与人乳头状甲状腺癌的侵袭转移。     

柠檬酸合成酶对卵巢癌SKOV3细胞上皮间质转化的影响

目的:探讨柠檬酸合成酶（citrate synthase,CS）对上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）细胞SKOV3上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）及生物学行为的影响。方法:利用Lipofectamine 2000体外瞬时转染化学法合成的CS siRNA,通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Western blot检测转染效率;Transwell实验检测转染前后SKOV3细胞侵袭和迁移能力的变化;Western blot检测转染前后上皮标记分子E-cadherin、间质标记分子Vimentin蛋白水平和Wnt通路关键分子β-catenin蛋白水平,实时荧光定量PCR检测转染前后EMT相关转录因子Slug、Snail和Twist的mRNA水平。结果:siRNA干扰序列显著降低SKOV3细胞中CS表达;CS低表达显著抑制SKOV3细胞的侵袭和迁移能力,促进上皮标记分子E-cadherin表达,抑制间质标记分子Vimentin表达,降低Wnt通路关键分子β-catenin表达;EMT相关转录因子Snail和Twist表达显著降低(P＜0.001,P＜0.01),Slug表达下降不显著(P＞0.05)。结论:CS低表达显著抑制卵巢癌SKOV3细胞EMT,其机制可能是通过降低Snail和Twist转录因子实现的,为卵巢癌的转移治疗提供初步的实验及理论基础。     

HDAC6对人肝癌HepG2细胞迁移和侵袭的影响及其机制

目的:明确HDAC6对人肝癌HepG2细胞迁移和侵袭的影响及其机制。方法:应用Western blot技术检测正常肝细胞系LO2和肝癌细胞系HepG2细胞中 HDAC6的表达。应用HDAC6抑制剂Tubastatin A抑制HepG2细胞中HDAC6的表达,运用Western blot及荧光定量PCR技术检测HepG2细胞中转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）相关分子标志物（N-cadherin,β-catenin,Vimentin）的表达;用TGF-β1抑制剂SB431542刺激HepG2细胞后,检测HepG2细胞中 EMT标志蛋白的表达,应用TGF-β1刺激HepG2细胞后观察HepG2细胞的形态变化。应用过表达HDAC6的质粒P3-HDAC6、P3-HDAC6+TGF-β1分别作用于HepG2细胞,通过Western blot检测HepG2细胞中EMT相关分子标志物的表达,应用划痕及Transwell技术检测HepG2细胞处理前后的迁移和侵袭能力变化。结果:肝癌细胞系HepG2细胞内HDAC6的蛋白表达量明显低于正常肝细胞系LO2（P＜0.05）。 HepG2细胞Tubastatin A组中N-cadherin、β-catenin、Vimentin、TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平相较于空白对照组明显增高（P均<0.05）。SB431542组中EMT标志蛋白表达水平相较于空白对照组明显降低（P均<0.01）。 TGF-β1刺激HepG2细胞后细胞变得分散且狭长。同时发现P3-HDAC6+TGF-β1组的细胞迁移和侵袭能力在48 h后明显强于P3-HDAC6组且弱于空白对照组（P均<0.05）。结论:HDAC6可通过下调TGF-β1的表达从而抑制HepG2细胞的EMT进而抑制HepG2细胞的迁移和侵袭。     

缺氧诱导宫颈癌Siha细胞发生上皮-间叶转化的研究

目的 探讨宫颈癌Siha细胞在二氯化钴(CoCl₂)诱导的化学缺氧环境中能否发生上皮-间叶转化(EMT),从而获得侵袭性表型,并初步分析其分子机制。方法 划痕实验及Transwell体外侵袭实验检测化学缺氧对细胞迁移、侵袭及转移能力的影响;Western blot印迹法、细胞免疫化学及免疫荧光检测缺氧对Siha细胞缺氧诱导因子1α（HIF-lα）、上皮细胞标记分子E-cadherin、间叶细胞标记分子vimentin表达的影响;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测缺氧对EMT诱导因子snail、zeb、twist mRNA表达的影响。结果 缺氧可促进人宫颈SCC Siha细胞的迁移、侵袭和转移能力;宫颈癌Siha细胞在常氧、缺氧12 h、缺氧24 h、缺氧48 h条件下E-cadherin蛋白的相对表达逐渐减少,vimentin蛋白的相对表达逐渐增加,缺氧组与常氧组比较差异有统计学意义(P<0.05);缺氧状态下HIF-1α在Siha细胞中聚集,发现Siha细胞形态发生明显变化、且伴有上皮性标记蛋白E-cadherin的表达减弱;Siha细胞twist及snail mRNA的表达与HIF-lα mRNA表达成正相关,且在缺氧12h后差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 缺氧微环境可能通过活化HIF-lα,调节twist、snail等转录因子的表达,促进宫颈癌细胞发生上皮-间叶转化,产生侵袭性表型。     

和厚朴酚通过SMAD2/3通路抑制胰腺癌KPC小鼠肿瘤生长及其原代细胞的侵袭和迁移北大核心

目的:探究和厚朴酚(honokiol,HNK)在胰腺癌KPC小鼠(LSL-Kras^(G12D/+);Trp53^(fl/+);Pdx1-Cre)肿瘤生长及其原代肿瘤细胞侵袭、迁移及上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)中的作用和机制。方法:自发性胰腺癌转基因小鼠KPC成瘤后灌胃给药,1个月后剖杀观察肿瘤大小和周围浸润情况,免疫组化染色检测EMT相关指标;提取KPC小鼠原代肿瘤细胞培养,以不同浓度和厚朴酚干预,Transwell小室检测其侵袭、迁移能力,Westren blot检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-SMAD2/3、t-SMAD2/3蛋白的表达;利用分子对接模型,预测和厚朴酚和SMAD2的最小距离氢键结合位置;使用外源性TGF-β1作为SMAD2/3的激动剂,联合和厚朴酚,干预肿瘤细胞,Transwell小室和Western blot检测细胞侵袭、迁移和EMT相关蛋白表达情况。结果:和厚朴酚能抑制KPC小鼠自发胰腺肿瘤的大小和EMT,细胞实验也证实和厚朴酚能抑制KPC小鼠原代肿瘤细胞的侵袭、迁移,抑制N-cadherin、Vimentin蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达,同时抑制SMAD2/3的磷酸化。软件预测SMAD2的459号脯氨酸残基与和厚朴酚羟基形成0.24 nm的氢键。回复实验证实和厚朴酚能够抑制TGF-β1激活SMAD2/3促进的胰腺癌细胞的侵袭、迁移和EMT。结论:动物和细胞实验都证实和厚朴酚可能封闭SMAD2蛋白质口袋,抑制SMAD2/3的磷酸化,进而抑制KPC小鼠肿瘤的侵袭、迁移和EMT。     

TGF-β1上调MTA1促进人舌癌Tca8113细胞侵袭转移

目的:研究TGF-β1上调MTA1能否促进人舌癌Tca8113细胞侵袭转移。方法:蛋白印迹和实时定量PCR检测TGF-β1刺激或者不刺激的Tca8113细胞中MTA1和E-cadherin的表达。β-actin作为实验的内参对照。光学显微镜拍摄TGF-β1刺激的Tca8113细胞形态。侵袭实验检测TGF-β1刺激的Tca8113细胞。结果:TGF-β1上调MTA1蛋白和mRNA表达,下调E-cadherin表达水平。Tca8113细胞是呈多边形的口腔鳞状上皮细胞癌,经TGF-β1刺激的Tca8113细胞形态变成长梭形。同时,TGF-β1刺激的Tca8113细胞与对照相比较具有更强的侵袭能力。结论:TGF-β1信号能通过MTA1下调E-cadherin表达,这可能是促进舌癌侵袭和转移的机制之一。     

TGF-beta1诱导人肺腺癌PC9细胞上皮-间质转化的研究

背景与目的研究表明上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)不仅参与胚胎形成与发育,而且参与肿瘤侵袭转移。此外,人转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)已被证实为肿瘤EMT的主要诱导剂。本研究旨在探讨TGF-β1诱导人肺腺癌PC9细胞发生EMT及其对PI3K/AKT信号通道的影响。方法将体外培养的PC9细胞用不同浓度TGF-β1处理48h,相差倒置显微镜下观察细胞形态学变化;Western blot和细胞免疫荧光验证EMT相关标记蛋白表达变化。同时,采用Western blot方法检测AKT和P-AKT的表达水平。结果TGF-β1可诱导PC9细胞向间质型细胞形态转化,并上调间质标记蛋白Fibronectin的表达及下调P-AKT的表达。结论TGF-β1可诱导PC9细胞发生EMT,并影响PI3K/AKT信号通道。