硼替佐米联用obatoclax协同诱导人急性B淋巴细胞白血病细胞株Nalm-6细胞凋亡

目的 探讨硼替佐米分别与3种Bcl-2抑制剂（obatoclax、AT-101、ABT-199）联用诱导人急性B淋巴细胞株Nalm-6细胞凋亡的协同作用。方法 应用MTT法分别检测3种Bcl-2抑制剂单用或联用硼替佐米作用于Nalm-6细胞48 h后的细胞活力。通过流式细胞术和蛋白质印迹分析分别检测不同药物单独或联合作用于Nalm-6细胞后的细胞凋亡情况及Bcl-2家族蛋白、泛素、微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）、p62、免疫球蛋白结合蛋白（Bip）、磷酸化p38、磷酸化JNK、C/EBP同源蛋白（CHOP）等蛋白的表达情况。同时利用qRT-PCR检测硼替佐米和obatoclax联用后细胞的内质网应激反应关键基因Bip、CHOP、活化转录因子（ATF）4、ATF6、肌醇需求酶1α（IRE1α）、X-盒结合蛋白1（XBP1）的表达水平。最后通过MTT和流式细胞术检测内质网应激反应抑制剂牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）是否可以逆转两药联用诱导的细胞凋亡。结果 硼替佐米和3种Bcl-2抑制剂单用均可降低Nalm-6细胞的存活率。3组药物联用实验组中，仅有obatoclax＋硼替佐米表现出协同细胞毒性作用，其余两组并无此现象。Obatoclax通过增加LC3B-Ⅱ、p62蛋白的表达水平抑制Nalm-6细胞的自噬活性。与单药相比，硼替佐米和obatoclax联用后泛素化蛋白的表达显著上调。硼替佐米联用obatoclax可同时抑制自噬和泛素蛋白酶体活性，造成大量蛋白蓄积，进而激活内质网应激反应，最终诱导Nalm-6细胞凋亡。内质网应激抑制剂TUDCA可削弱硼替佐米和obatoclax联用诱导的细胞凋亡。结论 硼替佐米联用obatoclax可同时抑制自噬和蛋白酶体活性，并激活内质网应激反应协同诱导人急性B淋巴细胞白血病细胞凋亡。     

维生素C联合硼替佐米对人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞凋亡的应用

目的 研究维生素C联合硼替佐米对人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)与Bcl2相关X蛋白(Bax)表达调节的影响.方法 采用30 nmol/L的硼替佐米组,100 μg/mL的维生素C组及联合组分别作用于Jurkat细胞24、48、72 h,设立未加药物的对照组,应用倒置显微镜观察细胞的生长方式,免疫组织化学检测Bax及Bcl-2的表达,CCK-8及流式细胞技术检测Jurkat细胞凋亡率和细胞周期.结果 维生素C使Jurkat细胞的生长方式从对照组的局部聚集向近乎均匀分散变化;维C组及联合组在24 h至48 h期间,Bcl-2的表达降低较硼替佐米组快,Bax表达升高的亦快,且维C组24～48 h对Bax的表达增量远超过硼替佐米组.CCK-8检测发现,在72h时维C组、联合组、硼替佐米组Jurkat细胞的抑制率分别为25.72％、75.23％、56.81％;流式检测凋亡率在72 h分别为81.73％、67.06％与81.50％;维生素C组的早期凋亡率大于晚期凋亡率,而硼替佐米组与联合组均为早期凋亡率低,但维生素C的添加,联合用药组细胞的早期凋亡率得到了大约15.26％的提高.结论 维生素C抑制T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞的增殖,尤其是促进Jurkat细胞早期凋亡,且细胞凋亡调控蛋白Bax与Bcl-2参与了维生素C诱导Jurkat细胞凋亡机制.     

青蒿琥酯联合硼替佐米对T细胞淋巴瘤细胞的抑制作用观察

[目的]观察青蒿琥酯联合硼替佐米对T细胞淋巴瘤细胞的增殖抑制作用.[方法]MTT法观察青蒿琥酯、硼替佐米对Jurkat细胞的增殖抑制效应及协同效应,瑞氏染色油镜下观察细胞形态变化.[结果]青蒿琥酯、硼替佐米都能够明显抑制Jurkat细胞增殖,表现出凋亡形态学改变.以远低于IC50剂量的青蒿琥酯(4μg·mL-1)联合10～320 ng·mL-1硼替佐米作用Jurkat细胞24h,硼替佐米的JC50从(137.64±6.82 )ng· mL-1降为( 17.72±2.75 )ng·mL-1,联合组生长抑制率均显著高于硼替佐米单药组(P＜0.01),药物联合作用均呈协同方式.[结论]青蒿琥酯能协同硼替佐米抑制Jurkat细胞,有望成为有前途的治疗T细胞淋巴瘤方案.     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗血液恶性肿瘤的研究

泛素-蛋白酶体通路是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一,它参与了细胞内许多重要的生理生化过程。蛋白酶体抑制剂可阻断大量调节蛋白的降解,引起细胞内信号系统的紊乱和超负荷,导致细胞生长的抑制,最终使肿瘤进展过程延缓甚至停滞。硼替佐米作为一种蛋白酶体抑制剂,能抑制多发性骨髓瘤细胞的生长及诱导肿瘤细胞的凋亡,同时对血液系统其他恶性肿瘤具有显著作用。本文就蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗血液恶性肿瘤的研究作一综述。     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米诱导髓系白血病细胞株HL60凋亡的机制研究

目的 探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米诱导髓系白血病细胞HL60凋亡的机制。方法 四甲基偶氮唑盐（MTT）法、Hoechst33342染色形态学观察及流式细胞仪证实细胞凋亡,Western印迹检测B细胞淋巴瘤／白血病-2（Bcl-2）、Caspase-9、Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）蛋白表达。结果 硼替佐米对HL60细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖关系,30nmol/L的硼替佐米作用24h能明显抑制HL60细胞增殖,抑制率为76％,形态学观察可见明显的胞核凝聚、固缩及碎裂;流式细胞仪检测可见明显的凋亡峰凋亡率为62．6％;Western印迹检测显示Bcl-2表达下降,Caspase-9、Caspase-3、PARP蛋白均裂解激活。结论 硼替佐米能诱导髓系白血病细胞HL60凋亡,其机制与Bcl-2蛋白的抑制及Caspase凋亡信号途径的激活有关。     

Obatoclax与MG-132对食管癌细胞CaES-17的协同抗肿瘤作用

目的探讨obatoclax联用MG-132对人食管癌细胞是否具有协同的抗肿瘤作用。方法MTT法检测obatoclax与MG-132 对人食管癌细胞CaES-17的细胞毒作用,根据IC50确定两药联用的浓度比（1∶2.4）,将两个药物从4 IC50的作用浓度起倍比稀释, 用CompuSyn软件计算两药的联用指数（CI）。采用Western blot方法研究药物对ubiquitin表达、PARP蛋白剪切、caspase-9蛋白 剪切、phospho-Histone H3蛋白及phospho-Aurora A/B/C蛋白表达的影响。采用流式细胞术检测细胞早期凋亡（Annexin-V阳 性率）及细胞周期的影响。结果Obatoclax与MG-132联合处理人食管癌细胞CaES-17,对细胞抑制率为50%及95%时相对应 的CI 值分别为0.296 及0.104,具有明显的协同抗肿瘤作用。单用obatoclax 或MG-132 均能诱导ubiquitin 表达增加、PARP及 caspase-9发生剪切,且联用组与单用组相比有统计学差异（P<0.05）;联用组phospho-Histone H3蛋白增加与单用组相比有统计 学差异（P<0.05）;phospho-Aurora A/B/C蛋白表达的增加也与单用obatoclax相比有统计学差异（P<0.05）,与单用MG-132相比 无明显改变（P>0.05）。同时,联用组Annexin-V阳性率及sub-G1期及G2/M期细胞百分比与单用组相比都显著增加,且差异均有 统计学意义（P<0.05）。结论Obatoclax联用MG-132对人食管癌细胞CaES-17具有协同抗肿瘤作用,且与诱导肿瘤细胞发生凋 亡及G2/M期阻滞有关。     

硼替佐米靶向NF-κB信号通路抑制结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的研究

  目的  研究硼替佐米对结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL）的抗肿瘤作用。  方法  单独使用不同质量浓度（0、1、2、4、5、6 ng/mL）硼替佐米处理SNK-6细胞24、48、72 h,及不同浓度核因子-κB （NF-κB）信号通路抑制剂BAY11-7082（0、1、2.5、5、10、20 μmol/L）处理SNK-6细胞24 h后,采用CCK8法检测细胞存活率并计算其半数抑制浓度（IC₅₀）。联合使用30 μmol/L Z-VAD-FMK（Pan-caspase抑制剂）+3 ng/mL硼替佐米,以及5、10 μmol/L BAY11-7082+3 ng/mL硼替佐米处理SNK-6细胞24 h,CCK8法检测细胞存活率。不同质量浓度硼替佐米处理SNK-6细胞24 h后,采用Annexin Ⅴ/PI流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP核糖聚合酶（PARP）和Bcl-2的表达,检测NF-κB信号通路相关蛋白P65和P100/52的表达。  结果  硼替佐米可呈剂量依赖性的抑制SNK-6细胞增殖（P<0.05）,24 h IC₅₀﹝（2.87±0.06） ng/mL﹞低于48 h和72 h（P<0.05）。BAY11-7082亦可抑制SNK-6细胞增殖,24 h IC₅₀= （9.73±0.36） μmol/L。联合用药结果表明,Z-VAD-FMK能减弱硼替佐米对SNK-6细胞增殖的抑制作用（P<0.05）,BAY11-7082能增强硼替佐米对SNK-6细胞增殖的抑制作用（P<0.05）。硼替佐米处理SNK-6细胞24 h后,凋亡相关蛋白Caspase-3裂解、PARP激活,以及Bcl-2裂解;NF-κB信号通路相关蛋白P65磷酸化水平降低,P52减少。  结论  硼替佐米通过阻断NF-κB信号通路抑制ENKTL细胞增殖,并且经线粒体介导的Caspase途径诱导ENKTL细胞凋亡。     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562的凋亡作用及机制

目的 探讨硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562(K562R)的诱导凋亡作用及机制.方法 采用浓度梯增法建立耐伊马替尼K562细胞系.应用CCK-8法检测不同浓度硼替佐米分别作用K562和K562R细胞24 h、48 h后,对细胞的增殖抑制的效果.使用流式细胞术方法分别检测硼替佐米单独或联合伊马替尼作用于K562R细胞48 h后的细胞凋亡.应用Western blotting检测不同浓度硼替佐米作用K562R细胞48 h后,Mcl-1、Bcl-2、Bcr/Abl蛋白表达的异同.结果 成功将对伊马替尼敏感的K562细胞诱导为K562R,耐药倍数为31.8;硼替佐米对K562及K562R细胞的增殖抑制呈浓度、时间依赖(P均<0.05);随着硼替佐米浓度增加,对K562R细胞的诱导凋亡作用增强,且硼替佐米与伊马替尼联合具有协同作用(P<0.05);硼替佐米可抑制K562R细胞Mcl-1,Bcr/Abl蛋白的表达,Bcl-2无变化.结论 硼替佐米具有对K562R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与下调K562R细胞Bcr/Abl和MCL-1的表达以及促进MCL-1发生切割有关.     

肿瘤规范化、标准化诊治第14讲中青年多发性骨髓瘤的药物治疗策略及新进展(下)

3 蛋白酶体抑制剂:硼替佐米 在肿瘤的治疗中,泛素-蛋白酶体途径是一个比较引人注目的治疗靶点.蛋白酶体构成了蛋白水解酶复合物,蛋白水解酶主要作用是降解细胞内的泛素蛋白,泛素蛋白则包括一些可以控制细胞周期、细胞生长及分化的功能蛋白.硼替佐米(先前称PS-341)是一种新的二肽硼酸,可对26S蛋白酶体进行可逆性的抑制.     

硼替佐米和来那度胺对NK/T淋巴瘤细胞作用的实验研究

目的 通过体外细胞培养观察硼替佐米和来那度胺对NK/T细胞淋巴瘤(NK/TCL)细胞株凋亡的作用,寻找治疗NK/T淋巴瘤的潜在药物。 方法 利用台盼蓝拒染法检测细胞活力及计数细胞,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布,Annexin V/PI法检测细胞凋亡。 结果 硼替佐米对SNK-1、SNK-6、SNT-8有明显的细胞毒作用,在临床治疗浓度下显著诱导凋亡而减少细胞的存活。硼替佐米(30 nmol/L)作用24 h,SNK-1、SNK-6、SNT-8细胞存活比例分别为(47.2±3.5)%、(33.5±3.9)%、(52.1±4.3)%,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.01)。硼替佐米对3种细胞株活性抑制IC50的浓度分别为19.5、12.7、20.7 nmol/L。流式细胞术对细胞凋亡检测发现硼替佐米对SNK-1(30 nmol/L)、SNK-6(10 nmol/L)、SNT-8(30 nmol/L)细胞株均有显著的诱导凋亡作用,作用24 h后凋亡率为(47.0±4.2)%、(43.0±3.8)%、(53.0±4.1)%。来那度胺对3种细胞株的存活和增殖无显著作用,对细胞周期的分布也无明显影响。来那度胺联合硼替佐米无协同促进细胞凋亡作用。 结论 硼替佐米是选择性的蛋白酶体抑制剂,具有诱导NK/TCL细胞株凋亡的作用,可能有成为NK/TCL治疗药物的潜在价值。来那度胺在体外实验中对NK/TCL细胞株无显著作用,与硼替佐米亦无协同作用,体内是否具有抗肿瘤活性尚需进一步的研究。      

选择性Bcl-2抑制剂ABT-199对乳腺癌细胞MDA-MB-231的放疗增敏作用

目的 研究ABT-199 对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的放疗增敏作用,并探讨其作用机制. 方法 取对数期生长的MDA-MB-231细胞分成对照组、药物组、照射组及联合组(照射+ABT-199). 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同剂量单纯照射和ABT-199 分别作用不同时间对MDA-MB-231细胞增殖的影响并计算20%抑制浓度( IC20 );流式细胞术检测 ABT-199 对 MDA-MB-231 细胞周期和凋亡的影响;Caspase活性试剂盒检测细胞 Caspase-3 活性变化;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bcl-xl的表达. 结果ABT-199对MDA-MB-231细胞有增殖抑制作用且有时间和浓度依赖性,随着ABT-199 浓度的升高, MDA-MB-231 细胞发生不同程度的G0/G1 期阻滞. 联合组较照射组细胞凋亡率明显增高(16. 9% vs 84. 5%),Bcl-2表达水平明显下调(P<0. 05),Bcl-xl变化不明显,同时Bax水平和胞内Caspase-3活性增高(P<0. 05). 结论 选择性Bcl-2抑制剂ABT-199可有效抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖,诱导细胞发生G0/G1 期阻滞及凋亡. IC20浓度的ABT-199 可明显提高MDA-MB-231细胞对放疗的敏感性.     

硼替佐米联合表阿霉素对乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响

目的研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米单药及与表阿霉素联合应用对乳腺癌细胞生物学活性的影响。方法采用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养MCF-7乳腺癌细胞,分别加入终浓度为0.01、0.10、1.00、5.00、10.00μg/mL的硼替佐米,终浓度为0.05、0.25、0.50、1.00、5.00μg/mL的表阿霉素,MTT法测细胞生长抑制率;选择药物浓度为0.10μg/mL硼替佐米+0.50μg/mL表阿霉素联合作用于MCF-7细胞,碘化丙啶(PI)染色法测细胞周期变化。结果单独应用硼替佐米可一定程度的抑制MCF-7细胞的生长,其抑制作用未呈现出明显的量效关系和时间效应关系,可使细胞大量停滞在G2-M期;表阿霉素单药对MCF-7细胞具有明显的抑制作用,并呈现出较明显的量效关系和时间效应关系,可使细胞大量停滞在S期;硼替佐米与表阿霉素联合应用时可以明显提高对MCF-7细胞的抑制作用,且在较低剂量和较短时间产生明显的抑制效果。结论硼替佐米与表阿霉素联合应用可增强表阿霉素的化疗敏感性,降低表阿霉素的使用剂量,为临床增强化疗效果、降低化疗不良反应提供了一定的依据。     

硼替佐米或联合三氧化二砷诱导HL-60细胞凋亡实验研究

目的 探讨硼替佐米单独或联合三氧化二砷对HL-60细胞凋亡的影响.方法 不同浓度硼替佐米、三氧化二砷处理细胞12～48 h,采用MTT比色法检测细胞增殖活性;DNA凝胶电泳、细胞形态学观察、流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 10～50 nmol/L硼替佐米可有效抑制HL-60细胞增殖,并诱导其发生凋亡.其中10nmol/L剂量处理12 h,即有细胞凋亡发生,延长作用时间或增加药物剂量,细胞凋亡率明显增加.选择15 μmol/L三氧化二砷与10nmol/L硼替佐米联合应用,可见HL-60细胞凋亡率比两种药物单独使用时显著增加.结论 硼替佐米对HL-60细胞存在时间和剂量依赖性的细胞凋亡效应,与三氧化二砷联合具有明显的协同作用.     

青蒿琥酯对人淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞抑制作用及机理的研究

目的 观察青蒿琥酯(ART)对白血病/淋巴瘤细胞株Raji、Jurkat和急性淋巴细胞白血病(ALL)原代细胞的增殖抑制作用,以及ART与长春新碱(VCR)、阿糖胞苷(Ara-C)的细胞毒协同效应,并探讨其作用机制.方法 MTT法观察ART对Raji、Jurkat、ALL原代细胞的增殖抑制效应及ART与VCR、Ara-C的协同效应.Wright-Giemsa染色光镜下及透射电镜观察细胞凋亡的形态变化,Rhodamine-123检测线粒体跨膜电位(MMP)变化,比色法检测细胞内caspase-3浓度变化.结果 ART在体外能显著抑制Raji、Jurket细胞的增殖,对ALL原代细胞亦具有增殖抑制作用.低浓度ART与VCR、Ara-C联合,能增加VCR、Ara-C的细胞毒作用.ART作用后B/T淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞光镜及电镜均表现出凋亡形态学改变,线粒体跨膜电位下降,细胞内caspase-3的表达增加,呈浓度依赖性.与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 ART对淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞具有抑制作用,且与VCR、Ara-C联用具有协同效应,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关.ART有望开发成治疗ALL/淋巴瘤的新药.     

硼替佐米或联合三氧化二砷治疗HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠的实验研究

目的 探讨硼替佐米(Bor)单独和联合三氧化二砷(As2O3)对HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠的抗瘤作用、作用机制及药物毒性.方法 建立皮下移植瘤裸鼠模型,随机分为4组,即生理盐水(NS)组、Bor单药组、As2O3单药组、Bor联合As2O3组,比较各组的抑瘤作用和裸鼠一般状态的变化,并对移植瘤进行细胞凋亡和免疫组化检测.结果 Bor单独或联合As2O3均能抑制移植瘤生长和延长裸鼠生存时间,并诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其增殖,其中以联合用药组效果最好,且未引起重要脏器损害.结论 Bor联合As2O3对HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠具有显著的抗瘤作用,此作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其增殖有关,且无明显毒副作用.