黄连WRKY基因家族鉴定及表达分析＊

目的 本研究使用生物信息学方法鉴定黄连WRKY基因家族成员并对其表达模式进行分析，为进一步研究黄连WRKY基因家族的功能及其对黄连生物碱合成途径的调控机制提供参考。方法 利用HMMER、BLAST、TBtools、IQ-Tree等软件，ExPASy、WOLF PSORT、MEME在线网站等对黄连基因组中的WRKY基因家族进行鉴定、可视化分析和表达模式分析。结果 从黄连基因组中鉴定出了41个WRKY基因，其ORF长度为252-2796 bp，编码蛋白的氨基酸数量为84-931 aa，分子质量为9649.32-103620.60 Da，等电点为4.96-10.17，95%以上蛋白预测亚细胞定位于细胞核；41个CcWRKY（黄连WRKY）基因不均一地分布在9条染色体上；系统发育分析将41个CcWRKY蛋白分为3大类，第Ⅰ类有6个，第Ⅱ类有31个，第Ⅲ类有4个；同一类CcWRKY蛋白结构域高度保守，大多CcWRKY基因外显子数量为3-7，内含子数量为2-6。表达分析结果为，除了保守结构域高度缺失的CcWRKY38、CcWRKY40外，所有的CcWRKY都至少在一个组织中有表达，且多数是特异性表达。结论 全面分析了黄连基因组中的WRKY基因家族，有助于进一步解析WRKY基因家族在黄连生物碱生物合成途径的调控机制。     

铁皮石斛转录因子基因DoWRKY1的克隆与表达分析

WRKY转录因子是植物中发现的新型转录调控因子,在调控植物生长发育和代谢等生理过程中发挥重要作用。该研究采用RT-PCR和RACE技术从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到一个新的WRKY转录因子基因cDNA全长,命名为DoWRKY1,提交GenBank获得登录号KF716131。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA为1 704 bp,其中开放阅读框 (ORF) 1 629 bp,编码1条由542个氨基酸组成的多肽,具有2个WRKY保守结构域,属于WRKY家族第Ⅰ类转录因子。酵母单杂交表明,DoWRKY1可以激活下游报告基因 (His3,Ade2) 的表达,具有转录激活功能,属于转录激活子。半定量RT-PCR显示,DoWRKY1在根、茎、叶和类原球茎中均有表达。qRT-PCR分析表明,DoWRKY1响应茉莉酸甲酯 (MeJA) 和壳聚糖 (chitosan) 诱导,分别在2 h和1 h,表达量达到最高峰。研究结果为进一步研究其在铁皮石斛次生代谢过程的调控功能奠定基础。     

人参NAC基因家族成员的鉴定与表达分析＊

NAC基因是一类植物中特有的转录因子家族，广泛参与植物生长发育、信号转导及逆境胁迫下的调节过程。本研究鉴定出人参NAC基因家族共有197个成员。将拟南芥NAC基因与鉴定出的人参NAC基因共同构建系统发育树，可将其分为15个亚族。根据转录组分析结果，PgNAC020、PgNAC021、PgNAC022、PgNAC023在花中呈现高表达现象，可能参与花的生长发育；PgNAC075、PgNAC076在果实中高表达，可能参与人参果实成熟过程；PgNAC092、PgNAC093、PgNAC094、PgNAC095可能参与人参花的形态建成，也可能参与植物的抗寒过程。本研究为人参NAC家族基因功能研究，以及NAC调控人参的生长发育提供理论参考。     

黄花蒿Dof基因家族鉴定及在GA-UV处理下对青蒿素生物合成的影响＊

目的 Dof（DNA binding with one finger）家族是高等植物中特有的一类转录因子家族，参与植物中光、激素、非生物胁迫等多种胁迫响应调控。本研究基于全基因组数据对黄花蒿Dof（AaDof）转录因子家族进行鉴定及表达模式分析，探究Dof家族基因在青蒿素合成调控中的作用。方法 经PFAM数据库鉴定获得AaDof序列，通过生物信息学软件分析其理化性质、亚细胞定位、基因结构、蛋白保守结构以及启动子序列结合元件等，并基于赤霉素（Gibberellic acid， GA）、紫外线B（UV-B）及二者协同胁迫下黄花蒿转录组数据对其表达模式进行分析。结果 本研究从全基因组水平共鉴定出51个AaDof基因，均含有保守的C₂-C₂单锌指结构，依据系统发育分析分为8个亚族，同一亚族内基因结构与蛋白保守结构域相对保守。亚细胞定位预测显示12个AaDof蛋白定位在细胞外，其余均定位在细胞核。启动子元件分析发现AaDof家族基因启动子区富含光、激素等多种响应元件。对AaDof在GA、UV-B和GA+UV-B处理下的表达模式分析发现，AaDof基因对GA胁迫处理响应较弱，仅有少量基因敏感，其表达主要受到UV-B胁迫影响。C1及C2.1亚族大部分基因在UV-B胁迫下上调表达，而A亚族大部分基因在UV-B胁迫下下调表达。qRT-PCR验证表明AaDof1、AaDof17和AaDof44在GA和UV-B处理下表达量显著上调，推测其可能通过参与GA和UV-B调控网络，正向调控青蒿素生物合成。结论 本研究系统鉴定了黄花蒿AaDof家族基因并筛选了3个可能正向调控青蒿素生物合成的候选AaDof基因，为黄花蒿Dof家族基因功能研究及其在青蒿素生物合成中的调控机制解析奠定基础。     

丹参酮生物合成相关SmERF108转录因子的鉴定及其靶基因分析＊

目的 鉴定与丹参酮合成相关转录因子AP2/ERF家族中SmERF108转录因子，并分析转录因子SmERF108的靶基因。方法 利用生物信息学在线分析平台如NCBI、PFAM等分析SmERF108的序列特征；MEGA-X软件用于构建SmERF108与不同功能转录因子的系统进化树；拟南芥原生质体转化法鉴定SmERF108蛋白的亚细胞定位；通过实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）对SmERF108基因在丹参不同器官和组织差异表达进行检测；利用酵母体系对SmERF108的转录激活活性进行探究并用酵母单杂技术确定其靶基因。结果 SmERF108具有典型的AP2/ERF保守结构域，属于ERF-B3亚组，系统进化树和保守基序分析显示SmERF108与丹参中SmERF128、青蒿中AaERF2亲缘关系较近且保守基序分布一致；亚细胞定位显示SmERF108蛋白定位于细胞核；SmERF108基因在周皮中表达最高，且呈现周皮（R1）>韧皮部（R2）>木质部（R3）的规律；酵母自激活验证SmERF108具有转录激活活性，同时酵母单杂交确认其能与关键酶基因SmCPS1启动子结合。结论 鉴定到丹参中一个新转录因子SmERF108，生物信息学分析及差异表达分析预测与丹参酮合成相关，分子互作初步证实靶基因为SmCPS1二萜环化酶。     

秦艽WRKY转录因子家族生物信息学分析

目的 利用生信技术分析秦艽WRKY家族，为进一步研究GmWRKY转录因子对秦艽次生代谢产物生物合成的分子调控机制提供信息。方法 基于秦艽转录组注释结果挖掘WRKY家族成员，通过NCBI-tBlastx和SMART保守结构域预测进一步筛选得到41条WRKY序列并进行生信分析。基于getorf预测开放阅读框（open reading frame，ORF）区，对41条序列的ORF片段进行MEME保守基序分析和ClustalW比对，采用MEGAX构建邻接法（neighbor-joining，NJ）系统发育树。利用Omicshare GO对41个WRKY成员进行富集分析，利用String进行WRKY成员蛋白互作网络预测分析。通过转录组FPKM值对GmWRKY成员的基因表达情况进行热图分析，并对蛋白互作核心成员进行基因相对表达分析。结果 41个秦艽WRKY成员中大部分成员的保守基序为“WRKYGQK”，仅GmWRKY27保守基序发生氨基酸突变，为“WRKYGKK”。依据WRKY特征结构域将41条序列的51个结构域分为3大类和8个亚类型，第I大类为氮端（N）和碳端（C），第II大类下设5个亚类型，以及第III大类；此外，系统进化树可将51个WRKY结构域分成4大组，GroupI[I(N)]、GroupII（IIa＋IIb）、GroupIII[I(C)＋IIc]、GroupIV（IId＋IIe和III），该结果与经典的WRKY家族分类特点基本一致。GO分析发现秦艽WRKY家族成员广泛参与代谢调控过程。当茉莉酸甲酯（jasmonic acid methyl ester，MeJA）诱导秦艽后，蛋白网络互作的核心成员GmWRKY1和GmWRKY17表达显著提高，推测这些WRKY成员与秦艽次生代谢产物的调控关系密切。结论 为进一步开展秦艽WRKY转录因子功能研究奠定基础。     

艾bZIP基因家族全基因组鉴定及萜类合成调控基因筛选北大核心CSCD

艾是我国重要的药用植物和经济作物,具有温经散寒、止痛、抗炎、抗过敏等功效。艾叶精油富含挥发性萜类化合物,广泛应用于艾灸及保健品中,市场开发潜力巨大。bZIP转录因子家族在植物中数量众多,广泛参与植物生长发育、胁迫应答和萜类等次生代谢产物合成调控,但艾bZIP家族及其功能鲜有报道。该研究基于艾基因组系统鉴定bZIP家族转录因子,分析其蛋白理化性质、进化关系、保守基序和启动子顺式作用元件等特性,并筛选可能参与萜类合成调控的候选基因。结果显示:从基因组水平共鉴定到156个AarbZIP转录因子,其编码氨基酸为99~618 aa,相对分子质量为11.7~67.8 kDa,理论等电点为4.56~10.16。根据拟南芥bZIP家族分类,AarbZIP蛋白分为12个亚族,同一亚族蛋白具有相似的保守基序。启动子顺式作用元件分析表明AarbZIP家族与光和激素响应密切相关。同源性比对和系统发育分析共筛选出5个可能参与萜类合成调控的AarbZIP基因。qRT-PCR结果表明5个候选AarbZIP基因在艾不同组织中表达存在显著差异,其中AarbZIP29和AarbZIP55在叶片中表达量最高,AarbZIP81、AarbZIP130、AarbZIP150在花蕾中表达量最高。该研究为艾bZIP家族基因的功能研究及其在艾萜类合成中的调控作用解析奠定基础。     

乌拉尔甘草TIFY基因家族鉴定及调控分析＊

目的 为了探索乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）TIFY基因家族的特征并预测其功能，本研究在全基因组层面，应用生物信息学方法对乌拉尔甘草TIFY基因家族进行鉴定和分析。方法 在乌拉尔甘草全基因组数据基础上，利用NCBI、MEME及TBtools等工具，结合基因保守结构域，对乌拉尔甘草TIFY基因家族的序列特征、分类、系统发育和基因表达模式进行分析。结果 在乌拉尔甘草中鉴定到TIFY家族基因成员18个（GurTIFY1-GurTIFY18），分别属于TIFY、JAZ、PPD、ZML四个亚家族，编码的核苷酸长度为444-1266 bp，氨基酸长度在147-421 aa之间，等电点为4.57-9.68，分子质量为16741.11-44426.5 Da，含有10个保守基序和4个保守结构域。基因表达结果表明GurTIFY基因中GurTIFY15、GurTIFY4、GurTIFY1、GurTIFY11等在乌拉尔甘草叶和根中的表达水平具有显著差异性。结论 本研究为深入理解TIFY基因响应非生物胁迫的调控机制和参与次生代谢物质累积的功能奠定基础，并为乌拉尔甘草优质品种选育提供科学参考。     

剑叶龙血树4CL基因的克隆及其功能预测

目的 对剑叶龙血树4CL家族基因进行克隆及功能预测,筛选出可能参与黄酮类生物合成相关的4CL基因,为深入阐述龙血竭的形成机制奠定基础。方法 在前期转录组测序数据的基础上,初步筛选4CL家族基因,并对其进行基因克隆及功能预测,筛选可能与黄酮类及木质素类化合物合成相关的4CL基因;以剑叶龙血树组培苗为研究对象,对其进行过氧化氢、茉莉酸、水杨酸等胁迫处理,实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析不同胁迫处理条件下4CL基因的相对表达变化规律。结果 在剑叶龙血树转录组数据库中共注释得到6个4CL基因并成功完成其基因克隆;其中3个基因（Dc4CL1、Dc4CL2和Dc4CL3）在龙血竭形成过程中呈现差异表达,Dc4CL1基因和Dc4CL2基因的表达模式与木质素类化合物生物合成的关键酶基因表达变化趋势一致,而Dc4CL3基因的表达模式与黄酮类化合物生物合成的关键酶基因表达变化趋势一致;系统发育分析结果显示,Dc4CL1和Dc4CL2属于Ⅰ类4CL基因,而Dc4CL3基因属于Ⅱ类4CLs基因;胁迫处理结果显示,Dc4CL均有差异性表达变化,其中Dc4CL3基因的相对表达量显著高于其他Dc4CL基因。结论 对龙血竭形成过程中起关键催化作用的4CL基因进行初步的筛选,其中Dc4CL1基因和Dc4CL2基因（Ⅰ类）可能主要参与木质素类化合物的生物合成,Dc4CL3基因（Ⅱ类）可能是龙血竭形成过程中黄酮类化合物生物合成的关键催化酶基因。     

赶黄草的转录组测序及分析

目的获得赶黄草Penthorum chinense转录基因参考序列和表达量信息,探索赶黄草药用活性成分生物合成的遗传基础,为赶黄草的重要功能基因研究提供参考。方法采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序技术,对赶黄草进行转录组测序,对获得的数据进行过滤组装,对得到的unigene进行比对注释,同时对本研究获得赶黄草活性成分合成相关代谢通路基因进行分析。结果共获得了40 005 442条有效的短读序,通过de novo拼接得到42 306个unigene,开放阅读框(ORF)分析共计得到518个ORF,其中75个ORF具有转录因子结构域。通过KEGG分析,检测到33、32、59、68个unigene分别参与黄酮类生物合成、固醇类生物合成、萜类骨架生物合成和羧酸代谢。结论本研究发现的这些基因对赶黄草遗传改良和药用活性物质的生物合成路径相关基因研究有着重要意义。     

盐胁迫下的3代白木香离体根的转录因子表达分析

目的研究3代白木香Aquilaria sinensis离体根在盐胁迫条件下的转录因子表达模式差异,对响应盐胁迫的各代转录因子家族差异基因的变化规律进行分析。方法以组织培养的白木香离体根为材料,采用IlluminaHiseq4000双端PE150测序方法,将所有白木香Unigene序列与植物转录因子数据库(PlantTFDB)进行比对,对盐胁迫组与对照组间的3代差异转录因子进行重点分析。结果 3代白木香离体根转录组测序片段经de novo拼接共获得48 286条Unigene序列,含有1 156个潜在的白木香转录因子,分布于54个转录因子家族。其中bHLH、ERF、NAC家族是富集最多的3个家族。在第1、2、3代盐胁迫白木香根中分别筛选出290、277、349个差异表达转录因子,NAC、MYB以及WRKY家族上调表达的差异表达基因(DEG)数量随胁迫代数增加而增多,而GRAS家族上调表达的DEG数量随胁迫代数增加而减少。3代共有的差异转录因子有70个,其中8个基因的下调表达倍数随盐胁迫代数增加而递增。结论盐胁迫对白木香转录因子表达影响主要以下调为主。盐胁迫组与对照组的差异转录因子数量随着盐胁迫代数增加而增加。不同转录因子家族基因受盐胁迫诱导表达情况不同,一些基因可能参与了胁迫记忆的传递。该研究有助于在整体水平加深了解白木香转录因子表达特性,为进一步研究白木香胁迫记忆及白木香盐胁迫响应分子机制提供参考。     

基于转录组测序的牛蒡木质素类物质生物合成途径及关键酶基因分析

目的获得牛蒡Arctiumlappa根功能基因数据库,分析其木质素类化合物生物合成途径及关键酶基因。方法以牛蒡根为研究对象,利用华大基因BGISEQ-500测序平台进行转录组测序,通过从头组装获得Unigene,利用各种已有的核酸和蛋白质数据库对Unigene进行注释和分类,利用KEGG代谢途径分析木质素生物合成途径及其关键酶基因,利用三维同源建模分析苯丙氨酸解氨酶(AlPAL)的结构特点。结果通过转录组测序共获得54 215个Unigene,其中42 003个Unigene被任一数据库注释,1 668个Unigene被注释到54个转录因子家族中;KEGG途径分析鉴定了423个Unigene参与了木质素的生物合成。AlPAL空间结构模型显示其为同型四聚体,每个单体由3个结构域组成,包括4-甲基-咪唑-5-酮(MIO)结构域、核心结构域和屏蔽结构域,其中MIO结构域包含保守的三肽ASG,构成AlPAL酶的催化活性中心。结论对牛蒡根转录组进行分析,为牛蒡功能基因鉴定、次生代谢途径解析及其调控机制研究奠定了实验基础。     

鱼腥草bZIP基因的鉴定与分析

目的 筛选使鱼腥草Houttuynia cordata具有不同环境适应性的候选bZIP基因,为后续繁育出具有更强环境适应性的鱼腥草品种奠定基础。方法 以鱼腥草转录组数据为基础,鉴定了HcbZIP基因家族成员,并对其理化性质、系统进化树、motif基序及在2个不同生态型鱼腥草中的表达进行分析。结果 共鉴定得到163个HcbZIP基因,编码蛋白质的氨基酸数量在115（HcbZIP48和HcbZIP149）～703 aa（HcbZIP97）,超过53%的家族成员为碱性蛋白,超过84%的家族成员为不稳定蛋白,所有家族成员均为亲水性蛋白。二级结构中,161个家族成员是由α-螺旋、延伸链、β-折叠和无规则卷曲4部分构成,β-折叠所占比例最低,α-螺旋和无规则卷曲所占比例较高。系统进化树分析将163个家族成员分成了9个类别,包括C、S、G、A、I、U、H、F和D,其中被归到D类别中的HcbZIP基因数量最多共有35个,数量最少的为C类别仅有4个,没有HcbZIP基因被归类到E和B类别中。Motif基序分析发现,motif1（RLLQNRESARRSRLRKKAYVQELESSVAK）高度保守在每个家族成员中均鉴定到且构成了bZIP基因的保守结构域。不同类别下的基因其motif基序构成较为接近,且部分motif基序只存在特定类别的基因中。表达分析发现,在鱼腥草7号药材中表达的HcbZIP基因数量多于鱼腥草6号药材,同时也发现单独在7号药材中表达的HcbZIP基因数量也多于鱼腥草6号药材。共发现6个HcbZIP基因,HcbZIP156、HcbZIP153、HcbZIP147、HcbZIP149、HcbZIP48和HcbZIP127在6号和7号药材中均呈现出较高的表达量。通过比较6号和7号的差异bZIP基因发现,共有96个差异表达HcbZIP基因,并将其分成了2大类,共63个差异基因在7号药材中表达量较高,33个差异基因在6号药材中表达量较高。结论 共筛选出4个基因HcbZIP154、HcbZIP150、HcbZIP26和HcbZIP18作为鱼腥草6号和7号2种材料能够形成适应不同生态条件的候选HcbZIP基因。     

西伯利亚白刺L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶基因克隆与序列分析

目的 克隆西伯利亚白刺Nitraria sibirica维生素C合成过程中L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶（L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP）编码基因。方法 利用生物信息学方法对西伯利亚白刺三代转录组数据进行分析,共鉴定出2个GPP基因,并从西伯利亚白刺中成功克隆得到2条NsGPP基因序列,进一步利用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构、保守序列以及系统进化等进行分析,并结合RNA-seq数据分析其在盐胁迫下的表达模式,利用qRT-PCR实验检测其在不同组织中的表达水平。结果 从西伯利亚白刺中成功鉴定克隆出2个NsGPP基因,2个NsGPP基因所编码蛋白均含有保守的FBPase/IMPase/glpX-like（FIG）结构域,且与其他植物GPP蛋白具有较高的相似性。利用多个物种的GPP蛋白序列构建系统进化树,结果显示西伯利亚白刺与灌木或半木质化草本植物亲缘关系更近。Motif分析发现NsGPP蛋白与拟南芥等GPP蛋白较为相似,但也存在差异,并且2个NsGPP蛋白之间也存在差异。此外,NsGPP1与NsGPP2的蛋白三维结构之间也存在微小差别。RNA-seq分析表明,不同浓度NaCl处理下,NsGPP1的表达逐步升高的趋势,而NsGPP2的表达量则较低,且在盐胁迫后其表达水平逐渐降低。qRT-PCR实验结果显示,白刺GPP基因的表达存在组织表达特异性,且在同一组织中NsGPP1的表达水平显著高于NsGPP2。结论 从西伯利亚白刺中成功克隆到2个NsGPP基因,其编码蛋白均含有保守的FIG结构域,且与拟南芥等草本植物的GPP蛋白更为相似。NsGPP基因在不同组织中表达水平具有显著差异,其中NsGPP1可能参与西伯利亚白刺维生素C生物合成并参与白刺抵抗盐胁迫。为进一步解析白刺维生素C生物合成以及耐盐分子机制提供了理论依据。     

甘草microRNA及其靶基因的生物信息学预测

目的利用生物信息学手段预测甘草Glycyrrhiza uralensis的micro RNA(mi RNA),并实验验证其存在,确定相应的靶基因,为理解甘草mi RNA的生物学功能奠定基础。方法下载公共核酸数据库中的甘草高通量测序序列和表达序列、标签序列,使用Trinity和Assembler等软件拼接以获得转录本数据。基于mi RNA前体序列在植物物种间的保守性,将mi RBase数据库中的已知植物mi RNA前体与甘草转录组序列进行Blast比对,按照mi RNA前体应具备的标准进行筛选。通过stem-loop q RT-PCR实验验证mi RNA。使用ps RNATarget软件进行mi RNA的靶基因预测,并对靶基因进行功能分析。结果序列拼接获得88 263条甘草转录组数据。使用这些数据预测到分属于17个家族的49个mi RNA序列,以及相应的30个茎环结构前体,随机选取其中12个,经实验验证,确实存在。这些mi RNA靶向的172个基因主要参与基因转录调控、信号转导、发育调控和防御反应等生物学过程。结论新预测的甘草mi RNA及其靶基因为进一步研究mi RNA在甘草中的生物学功能奠定了基础。     

红花CtWD40基因克隆及表达分析

目的克隆红花WD40(CtWD40)转录因子,分析其在不同组织间的表达水平及与红花羟基黄色素含量的相关性。方法以红花花瓣转录组WD40候选基因为参考,克隆获得CtWD40基因序列。同时对该转录因子保守结构域、蛋白三维结构及系统发育等内容进行生物信息学分析,荧光定量PCR方法研究了该基因在红花不同组织中基因表达差异,并采用HPLC法测定红花各花期花瓣中羟基红花黄色素A含量。结果成功克隆CtWD40基因并且发现该蛋白序列中8个保守WD结构域,通过系统发育分析发现CtWD40与菊科WD40蛋白亲缘关系最近。结论 CtWD40基因在在不同花期花瓣组织中出现先升高后降低表达趋势,皮尔森相关系数分析揭示CtWD40在花瓣中基因表达水平与羟基黄花黄色素A含量具有显著相关性。     

金银花组蛋白甲基转移酶基因生物信息学及表达分析

该研究从金银花转录组数据库中获得23个组蛋白甲基转移酶基因,分别对其核苷酸特性、蛋白理化性质、亚细胞定位、二级结构及保守域、系统进化和基因表达情况进行分析。其中系统进化分析结果表明,23个金银花组蛋白甲基转移酶可以分为2类:赖氨酸甲基转移酶和精氨酸甲基转移酶。基因表达分析结果表明金银花组蛋白甲基转移酶基因具有明显的种间表达偏好性和器官表达偏好性,即23个组蛋白甲基转移酶基因在金银花花蕾中表达量均高于红金银花,但在金银花叶中表达量均低于红金银花,并获得8个花蕾特异性表达基因,为进一步了解金银花类药用植物中组蛋白甲基转移酶的功能以及活性成分表观调控提供依据。