NF - κB抑制剂PDTC对小鼠肝癌细胞生长的影响

[目的]观察核因子-κB(NF- κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对小鼠肝癌Hca -F细胞生长的影响.[方法]用含PDTC的完全培养基体外培养Hca -F细胞,用MTT法测Hca -F细胞增殖抑制率.体内实验中所有小鼠均接种Hca -F并随机分为两组:攻击对照组腹腔注射生理盐水,PDTC治疗组腹腔注射P...     

小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca-F的再克隆技术

[目的 ]探讨小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca -F的再克隆技术。 [方法 ]采用有限稀释法对已使用多年的小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca -F进行再克隆 ;6 15小鼠皮下接种 ,检测再克隆瘤株淋巴结转移能力。 [结果 ]共分离出 3个不同的瘤株 ,Hca -F - 2 - 2 4c6 ,Hca -F -3-d4 ,Hca -F - 3-a4 ,流式细胞仪检测证明 3株瘤细胞均为单克隆细胞。动物实验证明三株瘤细胞淋巴结转移率分别为 95 .5 % ,87% ,4 2 .5 %。 [结论 ]有限稀释法操作简单 ,克隆的形成率高     

TWEAK在肝癌细胞系高/低淋巴道转移株中表达的初步分析

[目的]研究肿瘤坏死因子样弱凋亡因子（TWEAK）在小鼠腹水型肝癌细胞系高／低淋巴道转移株（Hca—F／Hca—P）中的表达及差异。[方法]分别提取Hca—F和Hca—P细胞的总RNA，通过RT—PCR在mRNA水平检测TWEAK基因的表达；提取Hca—F和Hca—P细胞的总蛋白，用蛋白印迹法从蛋白表达水平验证差异表达。[结果]RT—PCR检测到两株细胞均在358bo处出现特异性扩增的条带，并且Hca—F的条带亮度低于Hca—P，图像分析显示，Hca—F细胞中TWEAK的转录子含量低于Hca—P细胞（P〈0．05）；蛋白免疫印迹法验证两株细胞表面均有TWEAK蛋白的表达，Hca—P强于Hca—F，与基因芯片的结果一致。[结论]TWEAK在鼠腹水型肝癌细胞系Hca—F和Hca—P均有表达，且Hca—F中较低，而在Hca—P中表达较高。这说明了TWEAK可能与淋巴道转移有关，同时可能参与了细胞的凋亡与组织分化。     

两株不同转移力Hca对宿主免疫功能比较动态影响

本文对两株荷瘤Balb/C小鼠的免疫功能进行动态观察。通过测定局部瘤生长速度转移潜伏期、转移率、淋巴细胞分裂原反应性,脾细胞自然细胞毒性、脾脏及淋巴结内T细胞亚群变化等指标,提示荷瘤早期和中期,宿主免疫功能不稳定,荷瘤晚期,宿主免疫功能受抑制。其中高转移16A_3组与低转移A_2组引起的宿主免疫反应有着明显的差异。前者最终导致宿主免疫功能严重降低;后者只引起宿主免疫功能轻微降低。表明转移能力不同的瘤细胞,尽管来源于同一亲本Hca瘤株,但其生长速度,对宿主免疫系统的影响、免疫原性也均呈现异质性。     

小鼠腹水型肝癌高、低转移细胞系的超微结构定量分析

本文对小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系（Ｈｃａ－Ｆ２５／Ｌ－１６Ａ３）和低转移细胞系（Ｈｃａ－Ｆ２５／Ｌ－Ａ２）的超微结构进行了比较观察，并应用体视学方法进行了定量分析。结果表明Ｈｃａ－Ｆ２５／Ｌ－１６Ａ３细胞剖面平均直径、核质比较均Ｈｃａ－Ｆ２５／Ｌ－Ａ２大。Ｈｃａ－Ｆ２５／Ｌ－１６Ａ３细胞的分裂相、核畸形、核仁边集较多见，胞质中粗面内质网、游离核糖体较丰富，细胞表面微绒毛较多。表明不同转移能力的Ｈｃａ瘤细胞在形态上也有差异。     

对小鼠腹水型肝癌细胞(H_(22))的形态学及转移能力的进一步观察

本实验利用以淋巴道转移为主的小鼠腹水型肝癌(H_(22))模型,深入研究了H_(22)瘤细胞的病理形态学及其在转移能力上的差异。根据病理形态学的观察,H_(22)瘤细胞仍保持了来源于上皮组织的特点,这与用肝脏特异性酶检测的结果是一致的,证明H_(22)瘤细胞属于分化较低的肝细胞癌,而不是多形细胞肉瘤。采用体内经淋巴系统筛选后出现的高转移力的H_(22)-F10细胞,将之与其原代细胞(H_(22)-F0)进行比较,无论从侵袭力和转移程度上,二者确实存在着较明显的差异。这种筛选方法,为只经过淋巴道转移的瘤株,找到了一个初步检测肿瘤有无异质性的简便方法。H_(22)瘤株虽然是肝细胞癌,但它却与淋巴系统这个微环境有特殊的亲和性,这是该模型的一个突出特点。     

姜黄素对小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株(HCa-F)生物学行为的影响

目的研究姜黄素对小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株(HCa-F)生长和转移行为的影响。方法体外实验中用15~250μmol/L姜黄素分别处理HCa-F细胞48h,以MTT法检测HCa-F细胞的生长活性;以生长曲线评估姜黄素对细胞增殖的影响;以流式细胞仪检测姜黄素对细胞周期分布的影响。体内实验中,于615小鼠腹腔、足垫接种HCa-F细胞,通过ip给药的方法,观察姜黄素对腹腔接种HCa-F细胞的615小鼠生存率的影响和对HCa-F细胞在615小鼠淋巴道转移的影响。结果姜黄素可抑制HCa-F细胞的生长,对HCa-F细胞生长抑制率为7.23%~82.23%,呈剂量依赖性,IC50为51.48μmol/L。以非细胞毒性最大剂量15μmol/L姜黄素作用48h后,HCa-F细胞的群体倍增时间增加,生长速度受到抑制,细胞周期被重新分布,阻滞于S期。姜黄素ip给药50mg/kg抑制小鼠腹水瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,使瘤细胞淋巴道转移率从70%下降到40%。结论姜黄素可抑制小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株(HCa-F)的增殖与转移。     

GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10侵袭和转移的抑制作用

目的：观察GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞侵袭和转移的抑制作用,为开发具有我国独立的知识产权、针对性强的抗癌小肽类药物奠定临床前的实验基础。方法：MTT法检测GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的细胞毒作用；应用C57BL/6J小鼠，尾静脉注射小鼠黑色素瘤B16-F10细胞建立人工肺转移模型，通过免疫组化分析检测GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞肺转移瘤形成的影响。结果：1×10^-4mol•L^-1 GHGKHKNK八肽作用48 h对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的增殖抑制率为17.4%；高剂量组（500 μg•kg^-1•d^-1）GHGKHKNK八肽明显抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的肺转移。结论： GHGKHKNK　八肽具有 抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞生长和侵袭转移的作用。     

香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414对小鼠肝癌细胞Hca生物学功能的影响

[目的]通过诱导表达香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414,研究其对小鼠肝癌细胞Hca的生物学功能影响,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的机制。[方法]构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414,用毕赤酵母GS115体系进行诱导表达,将已鉴定的诱导表达蛋白作用于小鼠肝癌细胞Hca,用MTT法测定不同浓度目的蛋白组、顺铂(DDP)组及空白对照组的抑瘤率,用流式细胞术检测目的蛋白对肿瘤细胞的凋亡作用,同时用MTT法检测目的蛋白对正常鸡胚成纤维细胞的毒性作用。[结果]Western-blot结果显示目的蛋白成功表达;MTT法检测结果显示,不同浓度此蛋白对Hca细胞的生长抑制作用(OD595)与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05),7.5μg/mL、15μg/mL和30μg/mL目的蛋白的最大抑瘤率分别为70.03%、82.02%和74.66%,均超过5μg/mL DDP的作用;流式细胞术结果显示,此蛋白具有诱导Hca细胞凋亡的能力,早晚双期细胞凋亡诱导率与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05),浓度为30μg/mL时诱导凋亡的作用最强,早晚两期凋亡率分别为(9.28±0.04)%和(9.37±0.03)%;同时此蛋白对正常细胞无毒性作用。[结论]香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中成功诱导表达,此蛋白对小鼠肝癌细胞Hca生长具有抑制作用,能够诱导其产生凋亡,为进一步深入研究香菇菌C91-3的抗肿瘤机制奠定了基础。     

小鼠腹水型肝癌肺转移亚株与淋巴结转移亚株若干生物学特性的比较

本实验用小鼠腹水型肝癌(Hca) 分别经腹水→足垫→淋巴结→腹水……,与腹水→尾静脉→肺→腹水……循环传代10次,得到淋巴结筛选型(HcaSL_(10))和肺筛选型(HcaSP_(10))。将两者均分别向足垫和尾静脉注射,观察各自的淋巴结转移率和肺转移率。发现HcaSL_(10)淋巴结转移率明显高于HcaSP_(10);HcaSP_(10)肺转移率明显高于HcaSP_(10)并对两者进行了细胞形态学,细胞电泳率,促血小板聚集能力等方面的比较。其结果提示HcaSL_(10)与HcaSP_(10)细胞性质存在着差异。     

层粘连蛋白对两株小鼠肝癌克隆细胞系体外附壁及浸润的影响

Ｈｃａ－Ｆ和Ｈｃａ－Ｐ细胞系是从小鼠癌中分离出来的具有不同转移能力的两株克隆。在Ｃ３Ｈ／ｈｅｊ小鼠实验组显示，Ｆ细胞比Ｐ细胞具有较强的侵袭力和淋巴道转移能力。在体外附壁实验中，Ｆ细胞比Ｐ细胞更易贴附于层粘连蛋白上，而且，在后者加上Ⅳ型胶原基质后，Ｆ细胞的贴壁能力更增强；纤维连接蛋白加上Ⅳ型胶原可促进Ｐ细胞贴壁。     

高低转移小鼠肝癌细胞线粒体DNA遗传变异的研究

目的 检测和分析转移特性不同的两个小鼠肝癌细胞亚系线粒体DNA(mtDNA)的遗传变异,探讨线粒体DNA遗传改变与肿瘤发生发展的关系.方法 PCR-RFLP和序列测定技术.结果 对mtDNA的tRNA Ile GlN Met基因和ND3基因以及D-loop片段进行的扩增和限制性片段长度多态性分析结果 显示,无扩增片段长度呈多态性,且这两个肝癌细胞系mtDNA的所有限制性片段方式和大小完全一致.序列测定发现,这两个肝癌细胞系在线粒体DNA的 D-loop区存在序列差异.结论 mtDNA 非编码区内的遗传改变,反映了肿瘤发生发展过程中环境和遗传因素的影响,有可能与肿瘤细胞的恶性表型有关.     

shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK的表达及细胞迁移和侵袭

目的：研究shRNA对小鼠肝癌细胞株Hca-F JNK基因表达的抑制作用及对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,阐明JNK表达水平与小鼠肝癌细胞淋巴转移潜能的关系。方法：构建3条shRNA表达载体,以脂质体法稳定转染Hca-F细胞;RT-PCR 和 Western blotting检测shRNA对JNK基因和蛋白表达的抑制作用,筛选出RNA干扰效果最好的shRNA;Transwell 实验检测Hca-F细胞穿膜细胞数观察shRNA对Hca-F细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。结果：成功构建pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞,筛选出对JNK表达抑制效果最好的shRNA;其转染后JNK mRNA表达水平与其他组比较明显下调 ( P<0.01 );JNK蛋白质表达水平与其他组比较明显减少 ( P<0.01 );转染shRNA后Hca-F细胞穿膜细胞数均显著下降（P<0.05）。结论：通过建立pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞株,获得JNK表达稳定下调的Hca-F细胞株,抑制JNK表达水平可降低小鼠肝癌细胞的迁移和侵袭能力,JNK可能是决定肝癌淋巴转移潜能的重要基因之一。     

人乳腺癌MCF-7/ADM细胞的耐药谱及brca1基因表达的实验研究

[目的]研究人乳腺癌MCF-7/ADM细胞的耐药谱并探讨brca1基因产物表达与该细胞耐药性的相关性。[方法]经MTT法检测MCF-7/ADM细胞的耐药谱;通过免疫荧光法检测brca1基因产物表达情况。[结果]测得MCF-7/ADM细胞对阿霉素的耐药倍数为3.7倍;对长春新碱的耐药倍数为70.3倍;对氟尿嘧啶的耐药倍数为7.8倍。brca1基因产物在MCF-7/ADM细胞中的表达强度(98.23±7.63)高于MCF-7/S细胞(8.69±1.25),差异具有显著性意义(P<0.01)。[结论]MCF-7/ADM细胞是多药耐药细胞株,brca1与肿瘤多药耐药产生可能有一定的相关性。     

GRP94表达在大细胞肺癌NCI-H460细胞对顺铂耐药中的作用

[目的]检测在诱导剂A23187与抑制剂BAPTA - AM作用下,大细胞肺癌细胞NCI - H460中GRP94的表达水平,并分析其表达在肺癌细胞对顺铂耐药发生中的作用.[方法]将NCI - H460细胞分为诱导剂A23187组、抑制剂BAPTA - AM组和对照组,RT - PCR、Western blot方法检测...     

胰腺癌细胞 TYMS 基因多态性与蛋白表达的关系

[目的]探讨胸苷酸合成酶（thymidylate synthase ,TYMS）基因多态性与胰腺癌细胞 TYMS蛋白表达的关系。[方法]利用 PCR及凝胶电泳分析7株胰腺癌细胞（AsPC-1,BxPC-3,Capan-1,SU86．86,T3M4, PANC-1与COLO357）TYMS基因型,使用Western Blot检测其 TYMS蛋白表达水平。[结果]7株人胰腺癌细胞TYMS基因5＇-UTR串联重复序列基因分型结果显示形成3种基因型,分别是2R/2R（T3M4与BxPC-3）,2R/3R（ASPC-1,Capan-1与 SU86．86）与3R/3R（COLO357与 PANC-1）。不同TYMS基因型蛋白表达OD比值分别为：3R/3R基因型细胞（COLO357与 PANC-1）1．724±0．062,1．063±0．134;2R/2R（T3M4与 BxPC-3）0．558±0．042,0．578±0．021;2R/3R（Capan-1,ASPC-1与 SU86．86）0．530±0．061,0．541±0．0396,0．612±0．036。3R/3R基因型细胞TYMS蛋白表达明显高于2R/2R和2R/3R基因型细胞,两组之间TYMS蛋白表达水平差异有统计学意义（ P ＜0．05）,但2R/2R与2R/3R两组之间TYMS蛋白表达无统计学意义（ P ＞0．05）。[结论]在胰腺癌细胞株中,TYMS不同基因型与其蛋白表达密切相关。     

小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6细胞模型的建立及其药物敏感性的评价

[目的]建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6细胞模型并应用姜黄素对该模型的药物敏感性进行评价。[方法]将小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株（HCa-P）经615小鼠腹中线皮下接种的方法获得淋巴结转移瘤1代细胞HCa-P/L1,再经小鼠淋巴系统筛选5次,筛选高转移细胞系HCa-P/L6。用15～240μmol·L^-1姜黄素（Curcumin,Cur）分别处理人肝癌细胞系（SMC7721和HepG2）和小鼠腹水型肝癌细胞（HCa-P/L6和HCa-P）48h,以MTT法考察4种细胞的药物敏感性。以非细胞毒性最大剂量Cur作用于HCa-P/L6和HCa-P,以生长曲线和群体倍增时间评估药物对细胞生长的影响,以流式细胞仪检 测药物对细胞周期分布的影响,考察两株小鼠腹水型肝癌细胞与姜黄素作用敏感性的差异。[结果]从HCa-P中筛选出具有多部位转移特性的淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6,转移率为100%。Cur明显抑制小鼠腹水型肝癌和人肝癌细胞的增殖,并呈 剂量依赖性（方差分析P〈0.05）。在30～120μmol·L^-1,Cur对小鼠肝癌的抑制作用强于对人肝癌的抑制作用;在60～240μmol·L^-1范围内,Cur对HCa-P/L6的抑制作用强于对HCa-P。在非细胞毒性最大剂量15μmol·L^-1 Cur作用下,HCa-P/L6和HCa-P的生长受到抑制（t检验P〈0.05）,并且呈时间依赖性（方差分析P〈0.01）,HCa-P/L6和HCa-P的群体倍增时间延长（卡方检验P〈0.01）,Cur对HCa-P/L6的抑制作用大于对HCa-P;细胞周期被重新分布,HCa-P/L6被阻滞在S期,HCa-P被阻滞于S期和G2/M期。[结论]从HCa-P中筛选出了淋巴道高转移细胞系HCa-P/L6。小鼠腹水型肝癌比人肝癌对姜黄素作用敏感,而且高转移细胞株系HCa-P/L6较低转移细胞株HCa-P对Cur更为敏感。HCa-P/L6为肿瘤淋巴道转移机制和中药活性成分筛选的研究提供了一个新的敏感模型。     

膜联蛋白A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立

目的:建立针对膜联蛋白A7(annexin A7)的shRNA(small hairpin RNA)稳定转染的小鼠肝癌细胞株Hca-F,为后续研究奠定基础.方法:构建3条针对annexin A7的shRNA(shRNA1、2、3),分别与pSilencer连接,构建表达载体并分别转染Hca-F细胞,在mRNA和蛋白质水平比较3条shRNA对annexin A7表达的抑制作用,筛选抑制效果最好的shRNA转染Hca-F.稳转后用含400 μg/ml G418的完全培养基筛选,获得annexin A7表达稳定下调的Hca-F细胞株后传代扩增,应用Western印迹法检测Hca-F细胞annexin A7蛋白的表达,并与空载体转染组及正常对照组进行比较.结果:经DNA测序鉴定,所得到干扰序列与GenBank中序列一致;筛选出其中shRNA1对annexin A7的表达抑制效果最好.pSilencer-shRNA1转染Hca-F细胞株后,annexin A7蛋白的表达远低于空载体转染组和正常对照组(0.318 6 vs 0.798 7,0.824 3,P<0.05),而后二者间无统计学差异.结论:成功建立了annexin A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为后续研究奠定了基础.