CRISPR/Cas9技术应用的研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫系统,通过其转录产物crRNA(CRISPR RNA)及CRISPR相关蛋(CRISPR-associated,Cas),尤其是Cas9蛋白特异性抑制入侵的DNA.该系统由于其快捷靶向以及其作为一种特定位点核酸酶的高效性和多重修饰的可能性,被广泛应用于基因编辑领域.本文主要从CRISPR/Cas9系统的相关概念及原理、技术研究进展、应用研究进以及CRISPR/Cas9技术应用的未来发展进行阐述.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用研究进展

近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术经过不断完善和改造,正逐步取代锌指核酸酶(ZFN)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术,成为具有广阔应用前景的第三代基因编辑技术。CRISPR/Cas9技术目前已广泛应用于细胞的基因编辑和基因调节、基因敲除动物模型的构建、人类疾病动物模型的治疗研究等领域。此外,已有相关实验证实该技术能够在人类胚胎中发挥基因编辑的作用,并且国内外已有2项CRISPR/Cas9临床试验正在开展,未来应用于临床靶向治疗前景广阔。现就CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用原理及其应用的最新研究进展进行综述。     

CRISPR - Cas13a结合重组酶介导的扩增快速检测副溶血性弧菌方法的建立

目的 将重组酶介导的扩增（RAA）技术与成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a（CRISPR - Cas13a）检测系统相结合,建立一种快速、灵敏、特异的副溶血性弧菌检测方法（RAA - Cas13a）。方法 样本DNA经RAA扩增后,产物采用CRISPR - Cas13a检测系统进行检测,比较CRISPR - Cas13a与琼脂糖凝胶电泳对RAA产物的检测敏感性。对方法进行灵敏度与特异度测试,通过临床样本检测比较建立的方法与real - time PCR法的一致性。结果 CRISPR - Cas13a对RAA产物的检测敏感性高于琼脂糖凝胶电泳法;建立的RAA - Cas13a方法检测副溶血性弧菌的灵敏度为10拷贝DNA分子/反应,与其他病原体之间无交叉反应,与real - time PCR对临床样本的检测阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）,二者的检测一致性较高（kappa = 0.934）。结论 建立的RAA - Cas13a方法具有快速简单、灵敏特异等优点,为副溶血性弧菌的快速检测提供了新的工具。     

利用CRISPR/Cas9技术构建人TCRP1基因敲除慢性髓系白血病K562细胞系及其生物学功能检测

目的选取人慢性髓系白血病(CML)细胞K562为实验对象, 利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除舌癌耐药相关蛋白1(TCRP1)基因的CML细胞系K562/TCRP1-KO, 通过细胞增殖、细胞凋亡、药物敏感性等功能试验比较K562/TCRP1-KO与对照细胞(K562/cas9-CTL)的表型差异, 初步探讨TCRP1基因参与CML发病的可能机制。方法在特定位点设计针对TCRP1的小向导RNA(sgRNA), 寡核苷酸片段退火后与线性化的Cas9表达载体重组, 慢病毒包装系统转染293T细胞, 收集纯化病毒感染K562细胞, 嘌呤霉素加压筛选阳性多克隆, 有限稀释法进一步筛选出单克隆K562/TCRP1-KO, Sanger测序和Western blot检测成功敲除的稳定细胞株, 同时构建转染lentiCRISPR载体的K562细胞作为对照细胞株(K562/cas9-CTL), 采用细胞计数法、CCK8法及伊马替尼(IM)梯度稀释法、流式细胞术分别对K562/TCRP1-KO和K562/cas9-CTL进行细胞增殖、药物敏感性及细胞凋亡分析。结果成功构建了用...     

基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究

目的 探讨基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究。方法 通过BLAST收集GenBank数据库中135株全基因组测序大肠埃希菌、203株鸟枪法测序大肠埃希菌的CRISPR/Cas和PCR扩增、测序获得本实验室保存361株大肠埃希菌（包括38株大肠埃希菌O157：H7）的CRISPR序列,应用CRISPR Finder在线软件分析CRISPR特征、DNAMAN软件进行间隔序列的比对,使用Clustal Ⅹ进行cas多序列比对和Mega 5.1软件构建系统进化树。结果 本研究以全新的视角对大肠埃希菌的CRISPR/Cas位置进行描述;结果显示,135株全基因组测序、203株鸟枪法测序和361株本实验室测序的大肠埃希菌中分别有77.04%、100.00%和75.62%的大肠埃希菌具有CRISPR1,分别有74.81%、100.00%和92.24%的大肠埃希菌具有CRISPR2,分别有11.85%、0和1.39%的大肠埃希菌具有CRISPR3和CRISPR4;GenBank数据库下载的全基因组测序的1株和本实验室测序的2株大肠埃希菌存在4个CRISPR位点;缺少cas的CRISPR1下游有插入序列存在。在699株大肠埃希菌中,8株O55：H7、180株O157：H7、8株O157：HNM、40株O104：H4、4株O145：H28有独特的CRISPR;间隔序列的缺失可发生在CRISPR中间;依据I-E和I-F的cas构建系统发育树,均可分为两类。结论 大肠埃希菌的CRISPR/Cas可能作为鉴定强毒株大肠埃希菌或者新型菌株的分子标志物。间隔序列的缺失或获得可能与噬菌体有关。     

应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小窝蛋白1基因的神经细胞构建与功能鉴定

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑系统建立小窝蛋白1(CAV-1)基因敲除的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y),并验证其对流行性乙型脑炎病毒(JEV)的易感性。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,基于人源CAV-1基因的外显子区(EXON)序列设计小向导RNA(sgRNA),将sgRNA连接到载体PX459质粒上。将重组质粒转染至SHSY5Y细胞中,使用嘌呤霉素筛选稳定敲除CAV-1蛋白的SH-SY5Y细胞,并用免疫印迹法验证CAV-1蛋白的敲除效果。免疫荧光法比较CAV-1基因敲除的SH-SY5Y株与野生型细胞株对JEV感染性的差异。结果经酶切和测序鉴定,重组真核表达质粒构建正确,转染并筛选的单克隆细胞中没有CAV-1蛋白的表达,成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株。与野生型SH-SY5Y细胞株相比,CAV-1基因敲除的细胞株对JEV的感染性下降约90%(P0.001)。结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株,该细胞株可用于进一步研究CAV-1蛋白在JEV感染中的作用机制。     

CRISPR1上游侧翼序列用于大肠埃希菌和志贺菌鉴定的效果评价

目的 探讨基于成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）1上游侧翼序列对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。方法 通过BLAST重复序列识别并获得全基因组测序大肠埃希菌和志贺菌的CRISPRs和CRISPR相关基因（CRISPR-associated,cas）,并分析其种系;选取CRISPRs上、下游各500 bp侧翼序列,使用Clustal X进行序列比对;采用PCR方法扩增CRISPR1上游侧翼序列,以确定其对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。结果 73.4%（149/203）的大肠埃希菌存在I-E型CRISPR/Cas系统,包含了A、B1、D种系;8.4%（17/203）的大肠埃希菌存在I-F型CRISPR/Cas、17.2%（35/203）的大肠埃希菌不存在CRISPR/Cas,这2种大肠埃希菌均属于B2种系;9株志贺菌均存在I-E型CRISPR/Cas。在大肠埃希菌（B2种系外）、志贺菌CRISPR1上游和大肠埃希菌（B2种系）各存在61 bp侧翼序列,序列一致性为99%,且有种属特异性,PCR扩增此区域鉴定大肠埃希菌和志贺菌的灵敏度和特异度均>91%。结论 基于CRISPR1上游序列可用来鉴定大肠埃希菌和志贺菌,且具有很好的效果。     

4株志贺菌无抗生素压力下连续传代90次的耐药表型及CRISPR/Cas系统变化

目的 分析无抗生素压力下连续传代90次的4株志贺菌耐药表型及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）基因变化。方法 对临床分离的4株耐药谱不同的志贺菌进行无抗生素压力连续传代90次,传代结束后用琼脂稀释法检测传代前、后志贺菌最小抑菌浓度;用PCR对CRISPR位点进行扩增并测序,CRISPR Finder和Clustal X 2.1分析CRISPR位点的变化。结果 经无抗生素压力传代90次后,4株志贺菌对某些抗生素的敏感性有不同程度的增加：mel-sf1998024/zz对氨苄西林、头孢氨苄、头孢噻肟、氯霉素的耐药性降低,mel-s2014026/sx对诺氟沙星、甲氧苄啶的耐药性降低,mel-sf2004004/sx对氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻肟、氯霉素、甲氧苄啶的耐药性降低,mel-sf2013004/bj对氯霉素的耐药性降低;志贺菌mel-sf1998024/zz和mel-sf2013004/bj经无抗生素压力传代后,CRISPR3位点3''的重复-间隔序列丢失,其中间隔序列匹配基因的编码产物是Cas蛋白。结论 志贺菌在无抗生素压力下,可降低或丢失对某些抗生素的耐药性。部分志贺菌CRISPR3位点的结构发生了变化,CRISPR3位点与cas基因可能存在共进化。     

肺炎克雷伯菌中CRISPR调控耐药机制及其分布特征与分离地点的关系

  目的  了解呼吸道标本肺炎克雷伯菌中成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）对耐药的调控机制,并分析其CRISPR分布特征与分离地点的关系。  方法  收集并提取120株肺炎克雷伯菌的基因组DNA,通过扩增CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated）系统相关基因CRISPR 1、CRISPR 2来确定CRISPR阳性菌株。CRISPR阳性菌株的耐药表型用BD Phoenix-100细菌鉴定仪进行检测,利用CRISPR Target寻找间隔序列同源噬菌体或质粒,并在Center for Genomic Epidemiology上查找同源质粒或噬菌体的耐药信息并检测间隔序列所在菌株的耐药基因,分析两者携带耐药基因的关系。采用CRISPR Finder分析CRISPR并运用多序列比对分析间隔序列的一致性。  结果  CRISPR1、CRISPR2阳性率分别为12.50%和13.33%;间隔序列同源质粒与其所在菌株均携带共同的耐药基因,且菌株的耐药表型与其携带的耐药基因高度符合;相同地点菌株的CRISPR分布具有极高相似性。  结论  肺炎克雷伯菌通过将外来质粒的耐药基因片段整合到菌株的基因组中实现对菌株耐药性的调控;CRISPR中间隔序列的分布与菌株分离地点密切相关,为临床治疗和感染控制工作提供理论依据。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术对抗病毒潜伏感染的应用进展

目前抗病毒治疗主要靶向产毒阶段的病毒蛋白酶系统,而对于具有潜伏感染特征的病毒无效,因此能够靶向病毒基因组的抗病毒药物将是未来对抗病毒潜伏感染的研究策略.CRISPR/Cas9作为一种近年快速发展的基因编辑技术,在对抗病毒潜伏感染方面取得一定的成果,如HIV、人致病疱疹病毒、HBV等.此文对其应用进展进行综述,并总结了逃逸突变体的产生、脱靶效应、载体安全性等问题,以期为研制有效的抗潜伏感染病毒的治疗方法提供参考依据.     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 StxⅡ基因表达

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性。方法针对EHEC O157∶H7StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态细胞,采用RT-PCR及胶体金法检测StxⅡ基因表达情况,绘制菌株生长曲线,将菌株培养上清液接种Vero细胞观察细胞病变情况。结果测序分析显示pdCas9-StxⅡ表达质粒被成功构建;转化EHEC O157∶H7(00G097)感受态细胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表达均受抑制,EHEC O157∶H7生长曲线未受影响(P值均0.05)。pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培养上清液对细胞的毒性效应(CPE为30%)显著低于对照菌株00G097和pdCas9-00G097(CPE均80%)。结论成功构建的pdCas9-StxⅡ表达质粒能特异抑制EHEC O157∶H7StxⅡ基因表达、降低细胞毒性,为进一步研究志贺毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病机理和基因工程减毒活菌苗奠定了基础。     

基于不同方法的大肠埃希菌分型效果评价

目的 评价并验证成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）、血清学和多位点测序分型（MLST）方法对大肠埃希菌分型的效果。方法 使用CRISPRsFinder分析大肠埃希菌全基因组序列的CRISPRs间隔序列,使用在线软件SeroTypeFinder和MLST获得血清型和序列型（ST）;采用PCR扩增并分析349株大肠埃希菌CRISPRs,使用CRISPRs间隔序列预测血清型和ST,并比较血清学和MLST分型结果。结果 将I-E型CRISPR/Cas、I-F型CRISPR/Cas和CRISPR3-4分别命名CT-Ⅰ、CT-Ⅱ和CT-Ⅲ。根据CRISPRs间隔序列构成和排列进一步进行分型,203株大肠埃希菌被分为79个CT型别,76个血清型和66个ST。CRISPRs分型的区分能力最强,辛普森指数为0.936。CRISPRs和血清学的关联程度最高,调整兰德指数为0.908。CRISPRs型能进一步区分相同血清或ST产志贺毒素的大肠埃希菌［O157∶H7（ST11）、O104∶H4（ST678）和O26∶H11（ST21）］菌株。扩增实验室菌株的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3、CRISPR4和CRISPR3-4,检出率分别为81.1%、94.5%、1.4%、1.4%和4.6%;根据CRISPRs间隔序列预测O157∶H7（ST11）和ST131准确率分别为95.0%和100.0%。结论 基于CRISPRs的大肠埃希菌的分子分型方法呈现较好的分型效果和临床应用效果,预期可以成为大肠埃希菌分型的重要分子标志物。     

研究者发起的临床研究项目质量控制体系探讨

我国在逐步加强对医疗卫生机构开展的研究者发起的临床研究(investigator initiated trials, IIT)的规范管理, 建立健全IIT项目质量控制体系越来越受到重视。作者通过检索国内外医疗机构和科研院所临床研究相关部门的官方网站, 结合文献研究法, 梳理国内外IIT项目质量管理现状, 发现我国尚存在质量管理标准及规范缺乏、质控机制不健全、质量风险意识不强、质量监督力度不够以及临床研究人员质控能力不足等问题。建议我国在构建IIT项目质量控制体系时应制定适用于IIT项目的质量管理标准和规范、建立系统的质控机制(如探索建立由项目组/科室-医院-国家监督机构/同行评议专家团队等组成的三级质控模式、推行全流程质控机制)、加强政策引导和制度建设以及强化对临床研究人员的规范化培训等。     

大学生久坐行为/屏幕时间与心理健康的Meta分析

目的系统梳理久坐行为/屏幕时间与大学生心理健康影响的相关文献, 旨在探讨大学生久坐行为/屏幕时间与心理健康之间的关系, 为促进大学生心理健康发展提供理论依据。方法在PubMed、Embase、Cochrane Library、中国知网、维普数据库和万方数据知识服务平台进行检索, 截止日期为2022年7月14日, 研究久坐行为/屏幕时间与大学生心理健康研究相关文献。由一名研究者按照拟订方案对纳入的文献进行数据提取并进行质量评分, 再由另一名研究者进行复核;对符合纳入标准的文献进行系统综述, 并根据文献可提取数据的情况, 采用Stata 14.2软件进行Meta分析。结果共有36篇文献符合纳入标准, 包括35篇观察性研究和1篇干预性研究。对久坐行为(4篇)、屏幕时间(9篇)与大学生抑郁、屏幕时间与大学生焦虑(4篇)进行Meta分析, 对其他研究进行系统综述。久坐行为与大学生抑郁的Meta分析结果显示, 较长的久坐时长增加了大学生抑郁风险(OR=1.07, 95%CI:1.05～1.10)。亚组分析显示, 未校正混杂因素模型中, 较长的久坐时长与抑郁不存在相关性(OR=1.74, 95%CI...     

过氧化物酶体生物发生因子5(PEX5)缺失导致小鼠精子发生失败和不育

目的：过氧化物酶体生物发生因子5(PEX5)对雄性小鼠精子发生及生育功能的影响。方法：利用CRISPR/Cas9及LoxP/Cre技术构建睾丸特异性Pex5基因敲除(Pex5 cKO)小鼠模型,通过苏木精-伊红染色(HE)、免疫蛋白印迹(Western blot)和免疫荧光(IF)染色分析评估雄性小鼠的生殖器官及精子发生的情况。结果：Pex5 cKO雄性小鼠正常成熟交配窝仔数为0,与野生型(WT)雄性小鼠窝仔数(6.32±0.26)相比差异有统计学意义(t=21.46,P<0.0001),且HE染色结果发现,Pex5 cKO小鼠附睾中无精子发生。结论：PEX5在小鼠精子发生过程中发挥重要作用。     

耐药结核病患者支持体系提高诊疗服务可及性的定性研究

目的分析耐多药/利福平耐药结核病(multidrug-resistant/rifampicin-resistant tuberculosis, MDR/RR-TB)患者支持体系对患者治疗依从性和治疗效果的作用, 为完善以患者为中心的MDR/RR-TB诊疗服务支持体系提供依据。方法基于利益相关者理论, 于2021年1—7月, 采用目的抽样法, 在上海、安徽、浙江、江苏, 选取明确利益相关者(医保部门工作人员和省级疾病预防控制中心领导)、预期利益相关者(地市级疾病预防控制中心领导、基层疾病预防控制中心工作人员、MDR/RR-TB定点医院医务人员和MDR/RR-TB患者)、潜在利益相关者(MDR/RR-TB患者家属以及邻居或同事等)为访谈对象, 进行有关患者支持的半结构式访谈。研究对象的纳入以信息达到编码或主题饱和以及意义饱和为标准。采用主题框架法分析访谈资料。结果共纳入访谈对象25人, 其中明确利益相关者4人、预期利益相关者19人、潜在利益相关者2人。提炼出3个与MDR/RR-TB患者支持体系相关的主题, 分别是明确利益相关者提供政策支持促进MDR/RR-TB患者获得诊疗管理服务, 预期利...     

本刊2016年5期优秀论文名单

正为鼓励更多的优秀论文刊发《江苏预防医学》杂志,编辑部从2015年1期起,每期进行优秀论文评选,每篇奖励500元。现由审稿专家评出本刊2016年5期优秀论文8篇,名单如下:张黎,李靖欣,王雨潇,等:H7N9禽流感病毒HA2基因真核表达与免疫原性初步研究;李志锋,胡建利,鲍倡俊,等:AllGlo探针实时Real-time RT-PCR检测发热伴血小板减少综合征病毒;樊欢,吴涛,朱小娟,等:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157:H7StxII基因表达;     

通过CRISPR Cas/9系统敲除ICP227蛋白基因抑制单纯孢疹病毒HSV-1的复制

CRISPR-Cas9基因编辑技术是基于细菌或古细菌CRISPR介导的获得性免疫系统衍生而来,由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA,指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA,诱发同源重组或非同源末端链接,进而实现在目的 DNA上进行编辑.病毒通过特异的受体侵染细胞[1],其基因组在细胞内发生复制、转录、翻译等过程完成其生活周期,某些DNA病毒或逆转录病毒基因组会整合到宿主基因组中.基因治疗是病毒感染疾病治疗的新趋势,因此,基因编辑技术在持续感染的病毒或潜伏感染病毒疾病治疗中具有重大的潜在意义.本文我们利用CRISPR-Cas9敲除HSV-1病毒复制过程中重要基因,从而抑制病毒的复制,对病毒感染的治疗中有重要意义.     

VSMC-Cx43-/-条件性基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的 应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43-/-)模型.方法 采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰.通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载...     

VSMC-Cx43-/-条件性基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43^-/-)模型。方法采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰。通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体,该载体包含3.0 kb 5’同源臂、1.9 kb的flox区域和3.0 kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得3只阳性F1代小鼠(Cx43^flox/+)。将获得的flox杂合子Cx43^flox/+小鼠自交,获得flox纯合子Cx43^flox/flox小鼠。然后用Cx43^flox/flox小鼠和Myh11-CreERT2小鼠交配,最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠(该小鼠简写为:VSMC-Cx43^-/-)和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠(Cx43^flox/flox)。用PCR进行基因型鉴定,用Western blot技术检测Cx43在大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。结果基因型鉴定、免疫荧光和Western blot检测结果表明VSMC-Cx43^-/-基因敲除小鼠模型构建成功,小鼠一般性状无改变,小鼠大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中Cx43蛋白表达均下降。因此,可作为长期稳定模型研究血管平滑肌Cx43的功能。结论应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统成功构建了VSMC-Cx43^-/-基因敲除小鼠模型,为深入研究Cx43在血管疾病中的作用提供工具。