新疆光果甘草黄酮对人肝癌Bel-7402细胞增殖的抑制活性研究

目的探讨新疆光果甘草（Glycyrrhiza glabraL）总黄酮及单体成分光甘草定（glabridin,Gb）对人肝癌Bel一7402细胞增殖的抑制活性。方法采用乙醇提取法从光果甘草制备总黄酮提取物（G卜A）;经聚酰胺富集法精制而制备黄酮含量高于50％的标准化提取物（GF—B）;从GF-B中纯化制备单体成分光甘草定（Gb）;以人肝癌Bel-7402细胞株作为体外模型,用MTT法测定各样品对肝癌细胞增殖的抑制活性。结果制备和鉴定3种提取物：GF—A（总黄酮含量31．18％）、GF—B（含量52．5％）和Glabridin单体;3种物质对人肝癌Bel-7402细胞的增殖显示明显的抑制活性,其浓度在25～250btg／mL范围内对肿瘤细胞的最高抑制率分别达67．92％、84．28％和90．11％。结论人肝癌Bel-7402细胞对光果甘草总黄酮的抗癌活性具有一定的敏感性;单体Gtabridin可能是光果甘草总黄酮中抗癌活性较高的有效成分之一。     

甘草查尔酮类化合物对人肝癌Bel-7402细胞的抗癌活性研究

目的以天然查尔酮类化合物异甘草素(ILG)为先导物进行结构修饰,制备3-甲氧基异甘草素(3-MO-ILG),并研究ILG与3-MO-ILG的体外抗癌活性。方法利用酸催化的羟醛缩合反应制备ILG与3-MO-ILG目标化合物;应用人肝癌Bel-7402细胞为体外模型,用MTT法观察2种化合物对肝癌细胞增殖的抑制活性;用流式细胞仪测定促Bel-7402细胞凋亡能力;用张氏肝细胞(chang liver)测定对正常细胞的毒性。结果化合物ILG和3-MO-ILG对正常肝细胞无明显毒性,而对肝癌Bel-7402细胞的增殖有一定的抑制活性,浓度在5～200μg/mL范围内,对肝癌Bel-7402细胞的抑制率分别为23.28%～80.01%及41.96%～86.10%;2种化合物对肝癌细胞有明显的促进凋亡作用,最高凋亡率分别可达85%和93.5%。结论人肝癌Bel-7402细胞对甘草查尔酮类化合物具有较高的敏感性;ILG衍生物对人肝癌Bel-7402细胞增殖的抑制活性呈浓度依赖性,而对正常细胞的毒性明显小于对癌细胞的毒性;其抗癌作用机制可能是通过增殖抑制和促进凋亡来产生。本研究为甘草查尔酮类化合物中筛选抗肝癌候选药物奠定一定基础。     

桂皮酸诱导Bel-7402人肝癌细胞凋亡的作用及机制

[目的]通过检测不同浓度的桂皮酸对人肝癌Bel-7402细胞生存率及凋亡的影响,明确中药桂皮酸诱导该肿瘤细胞凋亡的作用和机制.[方法]采用MTT法检测0、1、3、5和10 mmol/L桂皮酸对正常肝细胞CL48及人肝癌细胞Bel-7402生存率的影响;采用PI/Annexin V双染法检测O、1、3、5和10 mmol/L桂皮酸对Bel-7402细胞凋亡作用的影响;应用Western-blot技术检测不同浓度桂皮酸对Bel-7402细胞中Bax、cytochrome c、caspase 8、caspase 9及caspase 3的作用.[结果]MTT结果显示桂皮酸能剂量依赖性地抑制Bel-7402细胞的生长,而对正常肝细胞的生存率无影响,P＜0.05.PI/Annexin V双染法,流式细胞仪检测显示空白对照组细胞凋亡率为(5.43±0.57)％,浓度为1、3、5和10mmol/L的桂皮酸处理组细胞凋亡率分别为(7.37±0.74)％、(13.73±1.5)％、(25.67±2.15)％和(52.23±4.18)％.蛋白质印迹法结果显示,桂皮酸能促进Bel-7402细胞caspase 8、caspase 9及caspase 3的切割;促进Bax蛋白转位至线粒体及cytochrome c的释放.[结论]桂皮酸具有抑制肝癌Bel-7402细胞生长及促进其凋亡的作用,可能是通过促进Bax蛋白转位至线粒体,从而刺激cytochrome c释放至胞浆,激活caspase蛋白导致肿瘤细胞凋亡.     

黄酮类化合物Davidigenin的合成及对人肝癌Bel-7402细胞的抗癌活性研究

目的合成黄酮类化合物Davidigenin(二氢异甘草素,DH-ILG),并对体外抗肝癌活性进行研究。方法对2,4-二羟基苯乙酮和对羟基苯甲醛进行羟基的保护,并通过羟醛缩合反应后行脱保护而合成异甘草素(ILG);通过2种催化氢化反应系统对ILG进行还原而制备目标化合物Davidigenin,对于氢化还原试剂进行筛选,用光谱方法对结构进行鉴定;应用人肝癌Bel-7402细胞株为体外模型,用MTT法观察Davidigenin对人肝癌细胞增殖的抑制活性。结果经2种催化氢化还原试剂得到的目标化合物产率分别为20%及91.45%;Davidigenin对人肝癌Bel-7402细胞的增殖有抑制活性,在浓度为25～200μg/mL范围内,其抑制率为2.76%～65.27%,且活性强度低于异甘草素。结论利用二氧化铂对查尔酮类化合物分子侧链中的α-β不饱和双键进行选择性还原反应的效果明显高于钯碳催化还原;人肝癌Bel-7402细胞对Davidigenin的抗癌活性具有一定的敏感性;查尔酮类化合物分子侧链中的α-β不饱和双键是其抗癌活性的必要条件。本研究对甘草查尔酮类化合物的抗癌构效关系研究及抗肝癌候选药物筛选奠定一定基础。     

纯中药制剂"卡宁"对肝癌细胞的作用

目的：观察抗癌中药“卡宁”对体外培养的肝癌细胞株BEL-7402细胞的凋亡抑制基因bcl-2的影响,探讨其抗肿瘤治疗的作用机制。方法：取体外培养的对数生长期BEL-7402细胞,随机分为4组：对照组,5-氟尿嘧啶组,含药“卡宁”血清1组（10％含药血清组）和含药“卡宁”血清2组（15％含药血清组）;采用MTT比色法观察不同浓度含药血清对体外培养的人肝癌细胞株BEL-7402细胞的抑制能力,PCR检测其对凋亡抑制基因bcl-2的影响。结果：PCR结果显示．“卡宁”1、2组bcl-2的活性明显低于对照组（P=0．038）;MTT结果显示,细胞生长抑制率随含药血清作用时间及浓度的增加而增大（P〈0．05）,15％含药血清72h的作用最强。结论：对肿瘤细胞bcl-2的抑制可能是抗癌中药“卡宁”诱导肿瘤细胞凋亡作用机制的一部分。     

舟山眼镜蛇毒及其有效组分体内外抑瘤的作用

目的：观察蛇毒（SV）及其有效组分体内外的抗癌活性,为SV抗肿瘤新药的开发提供实验依据。方法：采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）筛查不同浓度（5—20mg／mL）SV及其7种分离组分对人结肠癌细胞株（HCT-8）、人肝癌细胞株（Bel-7402）、人口腔上皮癌细胞株（KB）、人乳腺癌细胞株（MCF-7）的影响;并用小鼠肝癌（H22）动物移植瘤作为实验动物模型,进一步观察SV及其组分Ⅳ（0．01-0．03mg／kg）对瘤重、脾重、外周血白细胞和体质量的影响。结果：SV、Ⅲ2和Ⅳ的肿瘤抑制作用较为明显,三者的浓度在20μg／mL时,对HCT-8、Bel-7402、KB以及MCF-7具有非常显著的抑制作用,对HCT-8的抑制率分别为84．37％、79．39％和85．78％;对Bel-7402的抑制率分别为89．64％、88．13％和92．08％;对KB的抑制率分别为90．08％、91．30％和93．93％;对MCF-7的抑制率分别为89．88％、89．49％和92．33％。腹腔注射10d后,组分Ⅳ对H22有明显的抑制作用,SV组分Ⅳ3个浓度组的瘤重分别为（0．81±0．20）g、（0．70±0．18）g、（0．61±0．17）g,均明显低于对照组瘤重[（1．19±0．21）g,P〈0．05],肿瘤生长抑制率（IR）分别为31．93％、41．17％和48．73％。Ⅳ各剂量组小鼠脾脏指数较对照组增加,白细胞数与对照组相比无明显变化。结论：SV及其7种分离组分均能有效抑制4种人肿瘤细胞株（HCT-8、Bel-7402、KB及MCF-7）的生长,不同的SV分离组分对同一肿瘤细胞抑制作用有差异;不同肿瘤细胞对同一SV分离组分的反应性也不同。SV分离组分Ⅳ对动物移植性肿瘤小鼠肝癌H22有良好的实验疗效。     

稳定表达细胞色素P4501A1人肝癌细胞系的建立

目的：建立稳定表达人细胞色素P4501A1（CYP1 Al）的人肝癌细胞系（Bel-7402）。方法：通过将人细胞色素P4501A1（CYP1 Al）的表达质粒转染到人肝癌细胞系（Bel-7402），经G418抗性筛选得到稳定的克隆并扩大培养成系。Western Blotting检测蛋白的表达。细胞增殖试验鉴定CYPI AI的多环芳烃类底物二甲基苯并蒽（DMBA）对Bel-7402／1 Al细胞的增殖抑制作用。双核微核实验对Bel-7402／1A1细胞进行了遗传毒理的短期实验。结果：转染后筛选得到的Bel-7402抗性克隆，Westem Blotting检测表明有较高的CYPlAl蛋白表达。细胞暴露于DMBA时，Bel-7402／1A1与Bel-7402细胞相比。细胞增殖明显抑制。双核微核试验表明Bel-7402／1A1细胞的微核率随DMBA浓度增高而显著增加，Bel-7402无明显变化。连续传代后仍有CYPlAl标志酶EROD的较高表达，该酶活性能被CYPl A1抑制剂α-萘黄酮抑制。结论：建立了一个新的稳定表达CYPl A1的1个肝癌细胞系（Bel-7402／CYPlA1），可代谢多环芳烃化合物产生更大的毒性。该细胞系可用来筛选能被CYPlA1代谢的化合物，或能抑制CYPl A1活性的化舍物，并可用来研究CYPl A1的催化性质及被CYPl A1代谢的化合物的毒性机理。     

链球菌蛋白对人肝癌Bel-7402细胞及人正常肝细胞生长的影响

目的观察链球菌蛋白对人肝癌Bel-7402细胞及人Chang氏正常肝细胞生长增生的影响。方法常规培养链球菌,提取细菌全蛋白并通过阴离子交换层析获得蛋白分离组分SpⅠ和SpⅡ。不同浓度链球菌蛋白(10、50、100mg/L)作用于人肝癌Bel-7402细胞及人Chang氏正常肝细胞24～72h后,采用MTT法检测两种细胞的增生活性。倒置显微镜下观察50mg/L链球菌全蛋白和SpⅡ对两种细胞的形态学变化。结果MTT结果显示,链球菌全蛋白及SpⅡ能显著抑制Bel-7402细胞的生长,与蛋白剂量和作用时间呈负相关关系;SpⅠ对Bel-7402细胞未显示出明显增生抑制作用。链球菌全蛋白及SpⅡ对人Chang氏正常肝细胞显示出不同程度的刺激生长作用。倒置显微镜下观察,链球菌全蛋白及SpⅡ作用后的Bel-7402细胞,细胞稀疏、脱落、排列紊乱,失去正常形态,而人Chang氏细胞未发现明显的形态学变化。结论链球菌全蛋白及SpⅡ能抑制人肝癌Bel-7402细胞的增生,并且能在一定程度上促进人Chang氏正常肝细胞增生。     

白杨素对5- 氟尿嘧啶诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡的增敏机制研究

目的 探讨白杨素对5- 氟尿嘧啶（5-FU）诱导肝癌Bel-7402 细胞凋亡的增敏作用。方法 白 杨素单独或联合5-FU 作用Bel-7402 细胞,用MTT 法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡与周期分 布变化;Western blotting 检测Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白。结果 50 ～ 250μmol/L 白杨 素作用Bel-7402 细胞48 h 呈浓度依赖性的抑制细胞活力,且100μmol/L 白杨素组细胞存活率为（82.261± 7.793）%。100μmol/L 白杨素单独作用24 h 对Bel-7402 细胞活力和凋亡均无影响（P >0.05）。与空白对照 组比较,100μmol/L 白杨素作用24 h 后,不同浓度5-FU（12.5、25.0 及50.0μg/ml）作用48 h 对Bel-7402 细胞活力的抑制作用增强（P <0.05）;25.0μg/ml 5-FU 诱导Bel-7402 细胞凋亡率增加（P <0.05）;G2/M 期 细胞比例升高（P <0.05）;促凋亡蛋白Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平上调（P <0.05）;抗凋亡 蛋白Bcl-2 表达水平下调（P <0.05）。结论 白杨素增强5-FU 诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡,其机制可能 与线粒体凋亡通路激活有关。     

NO供体型大黄酸衍生物的合成及抗肿瘤活性

以大黄酸为原料,利用其羧基通过不同的连接臂与呋咱氮氧化合物偶联,得到7个NO供体型大黄酸衍生物,其结构经红外光谱、核磁共振氢谱和质谱确证。采用MTT法测试了目标化合物对人肝癌细胞HepG2、Bel-7402,人结肠癌细胞HCT116,人骨肉瘤细胞U2OS,耐药细胞Bel-7402/5-FU及正常肝细胞LO2的体外抗细胞增殖活性。结果显示,所有目标化合物对受试的肿瘤细胞和耐药细胞均具有较强的增殖抑制活性,其中化合物4g对人肝癌细胞HepG2、Bel-7402,人骨肉瘤细胞U2OS及耐药细胞Bel-7402/5-FU具有强的增殖抑制活性,而且对正常细胞影响很小,表现出较好的选择性。采用Griess法测定了目标化合物4g在肿瘤细胞HepG2中对NO释放的影响。结果表明,化合物4g在细胞中能释放高浓度的NO,其抗肿瘤作用可能与NO的释放相关。NO清除剂验证实验表明,化合物4g的抗肿瘤活性部分来自于NO的释放。     

复方斑蝥含药血清抑制人肝癌Bel-7402细胞增殖的机制研究

目的 探讨复方斑蝥抑制人肝癌Bel-7402细胞增殖的作用机制.方法 血清药理学方法制备复方斑蝥血清并处理人肝癌Bel-7402细胞,MTY方法观察其对人肝癌Bel-7402细胞增殖的抑制作用,RTPCR技术检测其对c-Myc、p53基因表达的影响.结果 复方斑蝥含药血清能够显著抑制Bel-7402细胞的增殖,并下调c...     

3-甲基腺嘌呤对人耐药大肠癌SW480细胞增殖及自噬活性的影响

目的：研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对耐5-氟尿嘧啶（5-Fu）结肠癌SW480细胞增殖及自噬活性的影响,探讨自噬抑制剂在逆转结直肠癌耐药中的作用。方法：浓度递增筛选法诱导耐5-Fu（100kig／L）的SW480细胞株,用10umol／L浓度的3一MA处理后,再用5-Fu（浓度200μg／L）作用24h。采用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,丹酰戊二胺（MDC）染色和电镜检测细胞自噬活性变化。结果：3-MA对耐药细胞自噬活性的抑制率达89．7％,增殖抑制率为9．6％,凋亡率为5．7％,与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。经3-MA处理后,5-Fu对耐药SW480细胞增殖抑制率达71．6％±2．9％,凋亡率达36．6％土2．9％,而单用5-Fu细胞增殖抑制率仅为23．6％±2．9％,凋亡率仅为10．3％±2．5％,3-MA预处理后5-Fu对耐药细胞的增殖抑制率及凋亡率均明显增强（P〈0．05）,自噬泡数量显著减少,自噬活性明显降低（P〈0．05）。结论：3-MA单用时仅有较弱的抗肿瘤作用,与5-Fu联用时耐药细胞的增殖及自噬活性被显著抑制,增强了SW480耐药细胞对5-Fu的敏感性,提高了化疗效果。     

Survivin siRNA对肝癌细胞BEL-7402的增殖与对Survivin基因及蛋白表达的作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)对BEL-7402细胞的生长抑制与生存素(Survivin)基因及蛋白表达的影响。方法:合成Survivin siRNA,以不同浓度转染BEL-7402细胞,MTT法测定细胞生长抑制率,RT-PCR、Western-Blot检测BEL-7402细胞Survivin mRNA及蛋白的表达差异。结果:BEL-7402细胞转染FAM荧光标记的siRNA后,细胞内有绿色荧光表达。分别以10、30、50nmol/LSurvivin siRNA转染细胞后,MTT测得的细胞生长抑制率分别为(38.80±1.71)%,(54.50±1.16)%,(66.79±1.10)%,RT-PCR测得的Survivin mRNA表达分别为0.42±0.02,0.28±0.01,0.12±0.01,Western-Blot测得Survivin蛋白表达分别为0.55±0.04,0.32±0.02,0.21±0.02,三项指标与空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。随着Survivin siRNA浓度的增加,细胞抑制率呈上升趋势,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达逐渐降低,呈浓度-效应关系。结论:Survivin siRNA能抑制BEL-7402细胞的增殖与Survivin基因和蛋白表达。     

蜈蚣提取液对大鼠胰腺癌治疗作用的研究

目的探讨蜈蚣提取液对大鼠胰腺癌的治疗作用。方法90只SD大鼠按随机数字表法分为A、B、C三组,将二甲基苯并蒽（DMBA）直接置入到大鼠胰腺被膜下胰腺实质内,建立胰腺癌模型。A组每周灌服蜈蚣提取液一次,连续灌服5个月;B组每周腹腔注射曲古霉素（TSA）一次,连续5个月;C组不做干预饲养5个月,观察三组sD大鼠胰腺肿瘤的发生及生长情况,并进行）（2及秩和检验分析。结果A组与B组比较胰腺肿瘤的发生率差异无统计学意义（24．1％vs25．0％,P〉0．9）,A组、B组分别与C组比较差异有统计学意义（24．1％、25．0％vs51．7％,P〈0．05）;A组与B组的肿瘤大小比较差异无统计学意义（P〉0．05）,而A、B两组分别与C组的肿瘤大小相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论蜈蚣提取液能抑制SD大鼠胰腺癌的发生和生长。     

健脾化瘀方对肝癌bel-7402／5-FU细胞表面耐药蛋白影响的研究

目的初步明确健脾化瘀方对肝癌细胞表面多药耐药蛋白表达的影响,并探讨可能机制。方法选择肝癌细胞bel-7402、肝癌耐药细胞bel-7402／5-FU做为实验细胞,以流式细胞仪（FCM）检测细胞表面P～糖蛋白（P-gP）、MDR相关蛋白（MRPl）的表达率及细胞内罗丹明123（Rho123）的蓄积浓度。以MTT比色法测定不同浓度健脾化瘀方对bel-7402／5-FU细胞增殖的抑制。FCM检测复方作用后bel-7402／5-FU细胞表面P-gP的表达率及Rho123的蓄积浓度。结果bel-7402／5-FU细胞表面P-gP的表达高于亲本bel-7402细胞,细胞内Rho123蓄积浓度低于亲本细胞。健脾化瘀方可显著抑制细胞生长,并呈量效关系。浓度0．5mg·mL。的健脾化瘀方作用bel-7402／5-Fu细胞48h后,细胞表面P-gP的表达率明显下降,细胞内Rho123蓄积浓度升高。结论健脾化瘀方可能具有逆转肝癌耐药细胞多药耐药的作用,途径可能是通过降低P-gP的表达而实现的。     

厄洛替尼对MKN45细胞株放射增敏机制的实验研究

目的观察厄洛替尼联合放射线对MKN45细胞的影响,初步探讨厄洛替尼对其放射增敏机制。方法通过MTT法检测厄洛替尼、5-氟尿嘧啶（5-Fu）对MKN45细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测MKN45细胞经厄洛替尼、5-Fu及联合放射线处理后细胞的7周亡率及周期分布情况;WesternBlots法检测厄洛替尼、5-Fu及联合放射线对MKN45细胞的Bax与Bcl-2蛋白表达的影响。结果厄洛替尼、5-Fu均能抑制MKN45细胞的生长,与药物浓度及作用时间呈正相关（P〈0．01）。厄洛替尼联合组使G2／M、G0／G1期细胞比率增加最明显,与5-Fu联合组比较有统计学意义（70．32±0．65vs58．25±0．42,P〈0．01）;细胞凋亡率增加最多,与5-Fu联合组比较有统计学意义（19．21±1_23 vs 13．11±0．76,P〈0．01）;厄洛替尼联合组作用于细胞后,Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax蛋白表达则明显增加,与其他组比较差异显著（P〈0．01）。结论厄洛替尼的放射增敏机制与增加MKN45细胞的细胞凋亡率、G2／M和GO／G1期细胞比率;降低Bcl-2、升高Bax蛋白表达,从而降低Bcl-2／Bax比率有关。     

c-Myc反义寡核苷酸对人肝癌Bel-7402细胞增殖的双向调节作用

目的观察c-Myc反义寡核苷酸(c-Myc ASODN)对人肝癌Bel-7402细胞增殖的双重调节作用,探讨c-Myc基因的生物学功能.方法台盼兰拒染细胞计数,CCK-8细胞检测试剂盒检测各组细胞增殖抑制率,计算单纯黄连素组及合用c-Myc ASODN后IC50.结果单纯黄连素及c-Myc ASODN均能明显抑制细胞的增殖(P＜0.05),将黄连素合用c-Myc ASODN后,细胞增殖抑制率低于单用黄连素组,但仍高于c-Myc ASODN组.黄连素作用Bel-7402细胞的IC50值在合用c-Myc ASODN后增加1.42倍.结论c-Myc基因在Bel-7402细胞细胞生长环境良好时可促进细胞的生长,在细胞生长环境不利的情况下则诱导细胞的的凋亡,抑制细胞的生长.依据环境不同,对Bel-7402细胞增殖具有不同的调节作用,c-Myc ASODN通过下调c-Myc基因的表达,在不同的环境下亦表现出不同的生物学效应.c-Myc ASODN与黄连素合用能明显降低Bel-7402细胞对黄连素的敏感性.     

Hepsin蛋白对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨Hepsin蛋白对肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法:运用RT-PCR技术检测肝癌组织样品肝癌细胞系中Hepsin基因的表达水平,并从原发性肝癌患者的癌组织中扩增Hepsin基因编码区序列,该序列被克隆并构建pCMV-tag-HS表达质粒。将pCMV-tag-HS表达质粒转染人肝癌细胞系HepG2细胞、Bel-7402细胞,观察Hepsin蛋白对肝癌细胞的增殖能力和细胞凋亡效应的影响。结果:Hepsin基因在临床肝癌组织和人正常肝细胞L-02细胞中高表达,在人肝癌细胞系Bel-7402细胞、HepG2细胞和临床肝癌癌旁组织不表达或低表达,Hepsin蛋白可以增强肝癌细胞系的增殖能力,同时抑制肝癌细胞凋亡。结论:Hepsin蛋白促进肝癌细胞生长并抑制肝癌细胞凋亡。