乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变及其临床意义

目的探讨利用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)前C区/BCP区基因突变方法的临床价值及前C区/BCP区基因突变的临床意义。方法应用基因芯片技术检测95例慢性乙型肝炎患者的HBV前C区G1896A(nt1896G→A)、A1814C(nt1814A→C)及HBV C基因启动子(BCP)T1762A、G1764A(nt1762A→T、nt1764G→A)四位点突变,同时检测血清HBV DNA含量及ALT、AST水平。结果95份血清标本中,有91份分别检测到了HBV前C区/BCP区基因突变,阳性率95.8%,其中61896A突变33例(36.3%),A1762T G1764A联合突变64例(70.3%),G1896A A1762T G1764A联合突变22例(24.2%),未检测到A1814C突变毒株。抗-HBe阳性的慢性乙肝患者HBV前C区/BCP区突变率较HBeAg阳性的患者明显增高。G1896A突变后血清ALT水平与未变异组比较有显著性差异(P<0.05),而其他各组的肝功能无显著变化。G1896A A1762T G1764A联合突变后,血清HBV DNA水平较未变异组降低(P<0.05),其他各组间则无显著变化。结论应用基因芯片法测定HBV特定变异位点,可一次同时检测多个突变位点,具有一定的临床应用价值。HBV前C区/BCP区突变对血清HBVDNA水平和肝功能有一定的影响。     

HBV多基因位点变异与肝细胞癌相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒前C区和C基因启动子基因变异与肝细胞癌发生的关系。方法采用实时荧光PCR检测29例慢性乙型肝炎（CHB）,27例乙型肝炎肝硬化（LC）,26例HBV相关肝细胞癌（HCC）患者血清HBV前C区G1896A和BCP区A1762T／G1764A的变异情况。结果HCC组和LC组前c区G1896A和BCP区A1762T／G1764A变异率均显著高于CHB组（P≤0．005）,HCC组和LC组间无显著差异（P〉0．05）。结论乙型肝炎病毒C基因启动子和前c区基因变异与肝细胞癌、肝硬化的发生密切相关。     

基因芯片检测慢性乙肝患者HBV-DNA变异的临床研究

目的应用新型基因芯片研究乙肝病毒多点基因变异在慢性乙肝患者中的意义，为临床诊断和治疗提供依据。方法对132例慢性乙肝患者采用DNA芯片技术，检测HBV—DNA基因6个位点的变异。结果132例慢性乙型肝炎患者均存在HBV—DNA位点的变异，其中前C区1896G—A变异率为23．5％。e抗原阳性者占4．O％（4／74）。e抗体阳性者占48．3％（28／58），后者变异株显著高于前者，此突变有助于HBV逃避免疫攻击而形成慢性感染状态；前C区1814变异率为3．8％；C区启动子1762变异率为56．1％，1764变异率为53．8％，且两种变异常同时出现，与重型肝炎、肝硬化和肝癌的发生相关；P区528变异率为9．8％，552M—I变异率38．6％，552M—V变异率为10．6％，552变异与核苷类似物耐药相关。结论HBV—DNA位点变异对于判定疾病的稳定与进展有重要作用。     

乙型肝炎病毒特定变异位点的结果分析

目的检测HBV基因多态性,从而有助于抗病毒药物的选择及疾病预后的判断。方法通过基因芯片技术,将HBV DNA进行PCR扩增,然后进行扩增产物尽杂交,芯片显色,结果分析。结果包括前C区1896位、BCP区1762/1764位、P区528/552位的突变普遍存在。①160例标本中,在HBeAg( )组中G1896A突变为7例(14.3%),在HBeAg(-)组中G1896A突变为56例(46.3%);②160例标本中,慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化、乙肝肝癌组中A1762T/G1764A的突变率为36.7%(40/109)、51.4%(19/37)、91.7%(11/12);③30例用拉米呋定抗HBV治疗的慢性乙型肝炎患者中,治疗前用基因芯片法检测都为野生株,经治疗后血清HBV DNA滴度下降而转阴,但随着治疗时间延长出现血清HBV DNA反跳8例,其中552位突变1例,528位突变7例。结论基因芯片法结果准确高效,具有推广价值;HBV DNA位点的变异对于疾病的进展、预后、临床用药有重要作用。     

慢性乙型肝炎C基因启动子1762/1764双位点和前C区1896位点变异的检测

目的了解慢性乙型肝炎病毒C基因启动子1762/1764双位点变异和前C区1896位点变异的情况以及对血清学的影响,并观察出现1762/1764双位点变异后拉米夫定治疗疗效.方法采用微板核酸杂交-ELISA方法和PCR法检测162例慢性乙型肝炎C区基因启动子1762/1764双位点变异和前C区1896位点变异,35例慢性乙型肝炎患者服用拉米夫定抗病毒治疗,观察肝功能、HBV复制指标、病毒变异等变化.结果慢性轻型乙肝,慢性中、重型乙肝和肝硬化3组1762/1764双位点变异率分别为14.9%,40.7%和39.0%,1896位点变异率分别为11.9%,40.7%和65.9%;HBeAg＋和HBeAg-2组1762/1764变异率分别为31.1%和28.4%,1896变异率分别为5.4%和60.2%;10例出现1762/1764双位点变异的患者接受拉米夫定治疗12月末,2例复发,并检测出变异株和YMDD变异,其中1例发展为重型肝炎并死亡;24月末,4例复发,并检测出变异株.结论HBV CP1762/1764变异与病情轻重有一定关系,不能完全中止HBeAg的复制,不同于前C区1896位点对血清学的影响;拉米夫定治疗可以抑制变异株,但随着疗程的延长,变异株又会重新出现.     

肝脏疾病进展与乙型肝炎病毒前 C／C 区突变

目的：研究慢性乙型肝炎患者前C/C区突变位点与肝脏疾病进展的临床意义。方法应用实时荧光定量PCR及直接测序法检测HBeAg阴性慢性乙型肝炎30例、HBeAg阳性慢性乙型肝炎20例,分析前C/C区变异位点与患者病情进展的相关性。结果肝硬化组前C/C区变异位点T1762/A1764、A1896发生率（86.3％,54.5％）明显高于慢性肝炎组（32.1％,35.7％）,差异均有统计学意义（ P ＜0.05）。慢性肝炎组与肝硬化组HBV载量差异无统计学意义（ P ＞0.05）;HBeAg阴性患者T1762/A1764,T1766/A1768,A1896变异位点发生率较HBeAg阳性患者显著增高（ P ＜0.05）。结论 T1762/A1764,A1896突变率的增加会促使肝脏疾病进展至肝硬化;HBeAg阴患者T1762/A1764,T1766/A1768,A1896变异位点的频率增加会促进肝脏疾病的进展。     

乙型肝炎病毒基因组基本核心启动子变异分析

目的研究慢性乙型肝炎患者感染的HBV基因组中基本核心启动子基因变异状况。方法收集16例慢性乙型肝炎患者的血清标本,抽提血清中HBV DNA,PCR法扩增HBV BCP区基因,PCR产物测序并分析核苷酸序列中的变异位点。结果 12例成功提取DNA,其中2例标本因PCR产物太弱,无法满足测序要求,其他10例测序标本均属于B型,与参考序列AF100309同源性最高;发现HBV BCP共有5个变异点,分别为T1753C、A1762T、G1764A、G1752A和A1775C。结论 HBV BCP变异可能影响HBV前C基因组mRNA转录,是HBV持续感染和肝病变进展的原因之一。     

治疗基线乙型肝炎病毒BCP区和PC区变异对拉米夫定耐药预测的探讨

目的探讨慢性乙型肝炎患者治疗基线乙型肝炎病毒(HBV)BCP区和PC区基因变异对拉米夫定耐药的影响。方法收集接受拉米夫定(100mg/片)初治2年内耐药的26例(耐药组)和2年内无耐药的16例(对照组)慢性乙型肝炎患者治疗基线的血清标本,采用型特异性多引物对巢式PCR法检测HBV基因型,用PCR产物直接测序技术检测治疗基线HBV的BCP区、PC区和P区变异位点,对发生频率较高的两组位点变异进行统计学分析。结果两组病人无1例发生P区rt204/180变异;在HBV BCP/PC区突变中,耐药组与对照组在点突变A1762T(38.48%vs 68.75%,P>0.05)、G1764A(26.92%vs50.00%,P>0.05)和G1896A(19.23%vs 18.75%,P>0.05)差异无统计学意义;对照组在点突变C1799G(43.75%vs 0,P<0.05)、T1802C(18.75%vs 0,P<0.05)、G1838A(25.00%vs 0,P<0.05)、A1846C(37.50%vs 0,P<0.05)、C1856T(31.25%vs 0,P<0.05)、G1888A(25.00%vs 0,P<0.05)明显高于耐药组。结论治疗基线HBV BCP区的A1762T/G1764A变异和PC区的G1896A变异对拉米夫定的2年疗效影响不大;治疗基线HBV BCP区的C1799G、T1802C、G1838A、A1846C的变异和PC区的C1856T、G1888A的变异可能是接受拉米夫定初始治疗获得长期维持应答的预测因素之一。     

乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片的临床应用

目的:评价临床应用乙型肝炎病毒(HBV)基因多态性芯片(中科院上海微系统和信息技术研究所等研制),检测HBV基因前C区1896、1814,基本C区启动子(BCP)1762和1764,P区的YMDD基序552位等的点突变的效能。方法:以该芯片检测49例不同临床类型乙型肝炎病人血清,并对部分血清的PCR扩增产物进行测序分析。结果:HBV前C区1896位在血清HBeAg阳性病例中,野生株、混合(野生/突变)株、突变株和未确定(无杂交信号)的检出率,分别为57.7％,38.5％,0和3.8％;血清抗HBe阳性病例中,相应为33.3％,22.2％,33.3％和11％,后者突变株显著高于前者(P<0.01)。所有病例HBV前C区的1814位均为野生,未检出突变。BCP 1762和1764双突变在慢性重型肝炎和肝炎肝硬化的检出率分别为66.7％和69.2％,显著高于慢性肝炎的19%(P<0.01)。10例拉米夫定治疗6月以上,HBV DNA仍阳性者中,7例检出P区YIDD或YVDD突变,1例兼有YIDD和YVDD突变,余2例无杂交信号。7例1 896,4例BCP,6例YMDD的测序和芯片检测结果一致,6例无信号位点的测序结果显示,这些位点附近,出现了与杂交探针错配的突变。结论:初步结果提示,该芯片适用于临床检测HBV前C区、P区一些已知热点的突变,并可用于研究这些突变与疾病严重性,及产生抗HBV药物耐药间的相互关系。     

DNA芯片分析乙型肝炎病毒基因多态性简便方法研究

目的 建立一种简便方法,用于乙型肝炎病毒基因(HBV DNA)多态性分析.方法 将标记生物素的dUTP在双重聚合酶链反应(PCR)时掺入DNA样品目的断片,并将目的断片杂交于含HBV核苷酸序列(1896、1814、1762、1764、P区552)的野生型及突变型探针的DNA芯片上,用亲和素-碱性磷酸酶进行显色,并转印于尼龙膜上,再用光学扫描仪读取结果.结果 42例乙型肝炎患者HBV核苷酸序列1896、1814、1762、1764、P区552位点突变率分别为40%、31%、50%、50%、10%;该法检测敏感度为5.6×102病毒拷贝数/毫升;特异性高;强、弱阳性批内变异系数(CV)分别为15.1%和19.8%.结论 生物素-亲和素系统用于HBV DNA多态性芯片显色,该法简便,不需特殊设备,易于推广应用.     

慢性HBV感染患者bcp/pc区点突变模式、pres区缺失及其临床意义

目的阐明HBV(hepatitis B virus,HBV)感染患者不同临床阶段bcp/pc(basic core promoter,BCP/precore,PC)点突变模式及pres区缺失突变规律,并探讨其临床意义。方法慢性HBV感染患者180例,其中,无症状HBV携带者13例,慢性乙型肝炎者75例,HBV相关肝硬化及肝癌分别为62、30例。Qiagen法提取血清HBV-DNA,常规PCR扩增目的基因,纯化PCR产物ABI377DNA自动测序仪直接双向测序。直接测序失败者,回收目的 DNA与PMD-18T载体连接,克隆质粒双向测序。DNAStar软件包的SeqMan软件进行生物信息分析。结果 Bcp/pc区点突变包括nt1753、nt1762、nt1764、nt1776、nt1803、nt1846、nt1896。HBV携带者、慢性乙型肝炎、HBV相关肝硬化及肝癌患者nt 1762(nt 1764)点突变率分别为7.7%、68.0%、72.7%(68.0%)及90.9%(81.8%),肝癌患者G1896A突变频率占54.6%。A1762T+G1764A联合突变占36%;A1762T、G1764A、G1896A联合突变占11%;T1753A/C、A1762T、G1764A、G1896A发生率为7%。克隆测序显示,肝硬化及肝癌患者bcp区起始点A1727G点突变率分别为72%、63%。HBeAg阴性患者存在更多的基因变异(P=0.022),G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素(P<0.05)。Bcp区点突变与HBeAg阴性无明显关系。肝硬化和肝癌患者pres基因缺失突变频率最高,肝癌及肝硬化患者pres1、pres2及pres1+s2缺失频率分别为7.1%、71.4%、7.1%及41.2%、58.8%、29.4%(P<0.05)。结论 A1727G、A1762T、G1764A及A1762T/G1764A联合突变、pres缺失在HBV相关肝硬化及肝癌患者多见,可能是肝脏疾病进展的危险因素,G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素。Bcp/pc点突变及pres区缺失可能为肝癌发生的早期预测因素,值得进一步研究。     

慢性乙肝患者e抗原血清转换与HBV基因变异的关系

目的 :了解慢性乙肝患者e抗原血清转换中HBV -DNA前C基因及C基因启动子变异的关系。方法 :HBV -DNA阳性且e抗原 /或e抗体阳性的慢性乙型肝炎患者各 30例 ,以PCR结合微板核酸杂交 -ELISA方法检测乙肝病毒前C基因 (nt 1896、nt 1899)及其基本核心启动子 (BCP ,nt 176 2、nt 176 4)变异。结果 :不论前C基因还是BCP变异 ,均与e抗原血清转换相关 (P <0 .0 5 ) ;不论e抗体阳性组还是e抗原阳性组 ,BCP变异均高于前C基因变异 (P <0 .0 5 ) ,但二者均不相关 (P >0 .0 5 )。结论 :乙肝病毒C基因启动子与前C基因的变异是随机的 ,都可下调HBeAg的表达 ,前者更易于发生变异。     

乙型肝炎病毒核心基因启动子变异对HBeAg表达及病情的影响

目的:研究乙型肝炎病毒核心基因启动子(HBVBCP)变异对HBeAg表达及病情的影响。方法:采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对176例HBV慢性感染者血清进行检测HBVBCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764G→A联合突变。采用ELISA检测技术,检测患者血清HBV标志物。结果:在176例HBV慢性感染者中检出HBVBCP区T1762A1764G变异者73例,HBVBCP变异的阳性率为41.5%,HBVBCP变异在HBeAg阴性病例的阳性率为49.4%,显著高于HBeAg阳性病例的阳性率33.3%。HBVBCP双变异在慢性乙型肝炎轻、中、重度组,肝炎肝硬化组,慢性重症肝炎组和原发性肝癌组的阳性率分别为28.0%、31.4%、34.2%、39.4%、60.0%和70.0%。各型肝病与HBVBCP变异的阳性或阴性进行相关分析,结果有显著性差异。结论:本组病例HBVBCP变异的阳性率为41.5%,变异可引起HBV感染者的HBeAg阴转。HBVBCP变异与HBV慢性感染的临床类型呈正相关,随着病情加重,BCP变异的阳性率有增高趋势。     

乙型肝炎病毒基本核心启动子T1762A1764 联合突变的临床意义

目的:研究乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子(BCP)T^1762A^1764联合突变情况及其临床意义。方法:采用聚合酶链反应(PCR)与限制性长度片段多态性分析(RFLP)相结合，检测130例乙型肝炎患者BCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764碱基G→A联合突变。结果：HBeAg( )和HBeAb( )两组患者中BCP T^1762A^1764联合突变率的不同频率分别为慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B，CHB)40．0％和85．7％，无症状携带者(Asymptomatic carrier，ASC)22．2％和65．0％，献血员为5％。BCP T^1762A^1764双点联合突变组HBV-DNA≥10^5 cps／ml检出例数81例(96．4％)，非突变组HBV-DNA≥10^5 cps／ml检出例数25例(54．3％)。结论：BCP T^1762A^1764联合突变与乙型肝炎的发生、发展以及预后有关，可能是CHB与ASC患者HBeAg(-)的原因之一，可促进乙肝病毒繁殖。对慢性乙型肝炎患者检测HBV BCP T^1762A^1764联合突变有一定的临床意义。     

乙型肝炎病毒前-C区1896和基本C区启动子区1762、1764 双突变及YMDD变异对拉米呋啶治疗的影响

目的:研究乙型肝炎病毒前-C区G1896A突变和基本C区启动子区A1762T、G1764A双突变对拉米呋啶治疗的影响。 方法:采用直接测序法对服药前、中、后的血清标本的逆转录多聚酶区及前-C、基本C区启动子区进行检测。 结果:①前-C区G1896A和基本C区启动子区A1762T、G1764A双突变在出现治疗中病毒学反弹与未出现治疗中病毒学反弹患者间及发生血清学转移与未发生血清学转换患者间差异无显著性(P>0.05);②G1896A突变在发生YMDD变异和未发生YMDD变异的患者间差异有显著性(P<0.05),发生YMDD变异的患者很少伴有G1896A突变率低(9%);③出现治疗中病毒学反弹的患者YMDD变异增加,与未出现治疗中病毒学反弹的患者比较差异有显著性(P<0.05)。 结论:前-C区G1896A和基本C区启动子区A1762T、G1764A双突变对拉米呋啶治疗后出现的治疗中病毒学反弹和血清学转换没有影响;在G1896A突变株YMDD变异减少;YMDD变异株的出现对治疗后出现的治疗中病毒学反弹有影响;YMDD变异可能是加剧肝细胞损伤引起治疗中病毒学反弹的因素之一。     

基因芯片检测HBV DNA聚合酶区基因多态性

目的 :建立基因芯片检测HBVDNA聚合酶区基因多态性。方法 :PCR扩增HBVDNAP区nt45 5～ 796片断 ,与预制的基因芯片杂交 ,运用激光共聚焦荧光检测系统扫描芯片分析基因突变类型。结果 :芯片检测HBVDNAP区变异具有较好的特异性和准确性 ;初步应用显示 :慢性乙肝组nt5 2 8和nt5 5 2位点突变率分别为 8.6%和 9.6% ,而无症状肝炎组和重症肝炎组突变率均为 0 ;拉米夫定治疗组与非拉米夫定治疗组比较 ,nt5 2 8突变率分别为 10 .5 %和 8.1% ,nt5 5 2突变率分别为 15 .8%和 8.1%。结论 :HBVDNA聚合酶区基因多态性分布与病情轻重无关 ,而与病程慢性迁延有关 ;拉米夫定在耐药突变中发挥了重要作用 ;基因芯片检测乙肝患者耐药基因有其临床应用价值。     

乙型肝炎病毒X基因变异和慢性乙型肝炎患者临床与组织病理学指标的相关性

 目的 探讨慢性乙型肝炎患者肝组织内乙型肝炎病毒（HBV）X基因部分区段的变异与HBV相关各临床与组织病理学指标的关系。方法 以83例慢性乙型肝炎肝穿刺活检标本作为研究对象，20例HBV相关性肝细胞癌作为对照；HBV X基因变异的研究采用PCR扩增和直接双向测序。免疫组化二步法显示肝组织内四种病毒蛋白的表达；荧光实时定量PCR检测肝组织内HBV DNA含量。结果 HBV X基因nt1583～1793区段错义突变主要出现在对应的X蛋白aa87（nt1632、1633）、88（nt1635、1636）、116（nt1719）、118（nt1726、1727）、119（nt1730）、127（nt1752）、130（nt1762）和131（nt1764）位氨基酸。nt1725～1730（aa118/119）突变与肝组织内HBcAg显著低表达（P=0.006），和HBV DNA低拷贝数（P=0.004）明显相关，尤以ACTGAC（TD）型突变最为明显；相反，nt1762/1764（aa130/131）位点突变则伴肝组织内HBcAg显著高表达（P=0.005）和高水平的HBV DNA含量（P=0.006）。同时，肝癌组中nt1725～1730 野生型所占比率明显高于慢性肝炎（P<0.05），而nt1762/1764 突变型所占比率肝癌组与肝炎组相比显著增高（P<0.01）。结论 肝组织内，在nt1725～1730突变能显著降低HBcAg 的表达和HBV DNA水平，nt1762/1764突变则相反。肝组织内HBV的高负载可能与肝细胞癌的发生有关