酒精对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变影响研究

目的：探讨酒精对HBV DNA多位点基因变异的影响,为慢性乙型肝炎的临床诊断和治疗提供依据。方法:选取45例慢性乙肝患者为研究对象,分为嗜酒组和非嗜酒组,采用DNA芯片技术, 检测HBV DNA前C区1896及1814位点、BCP区1762及1764位点、P区528及552位点的基因变异。结果:嗜酒组在BCP区1762 、1764位点的变异率明显高于非嗜酒组(P均＜0.05)。在前C区1896、1814位点,P区528、552位点变异率差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论:酒精可导致乙肝病毒BCP区1762 、1764位点发生基因突变,BCP区基因变异可促进HBV在人体内的复制表达,加重慢性乙型肝炎患者的病情。     

自然发生和拉米夫定诱导的乙型肝炎病毒逆转录酶区序列变异的特征

目的 研究慢性乙型肝炎（CHB）患者在自然状态或在拉米夫定（LVD）长期治疗过程中乙型肝炎病毒（HBV）逆转录酶区（RT）序列变异出现的时机和特点。方法 120例CHB患者按测序时机分3组：Ⅰ组初治患者25例，Ⅱ组病毒学突破患者74例，Ⅲ组病毒学部分应答患者21例。所有患者留血清标本，提取血清HBV—DNA，应用PCR扩增，直接测序HBV RT区，Chromas2．0软件分析HBVP基因RT区变异，同时使用Clustalxl．81．msw进行基因型分析。结果 120例CHB患者中，B型34例（28.3％），C型85例（70．8％），B／C型1例（0．8％）。Ⅰ组患者中，2例（8．0％）出现rt变异原发性LVD耐药（LVDr），其中1例为rtM204V＋rtL180M变异，另1例为rtL180M变异与野毒株并存；Ⅱ组患者中，67例（90．5％）出现继发性LVDr变异，rt变异位点为rtM204V／I、rtL180M、rtV173L／M、rtV207M/L/I、rtA181T,rtM250L；Ⅲ组患者中，出现rtV1911、rtF221Y变异各1例，没有出现LVDr相关的变异。结论 CHB患者在自然状态下和病毒学突破时HBV可出现LVDr变异，治疗前后对HBV逆转录酶区（RT）序列分析可指导临床抗HBV药物的选择。     

慢性乙型肝炎HBV前C区基因突变的临床研究

采用聚合酶链反应（PCR）及单链构象多态分析（SSCP）银染技术检测了32例HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者及乙肝病毒携带者的前C区基因变异。结果表明有前C区基因突变株感染者8例，突变株感染者检出率为25．0％；突变株的检出率以慢性乙肝重度最高，其次是慢性乙肝中度、轻度患者，乙肝病毒携带者最低；抗－HBe阳性患者前C区突变株检出率高于HBeAg阳性患者。提示HBV前C区突变与病情轻重及e系统血清标志有关。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎不同病毒基因型患者的疗效

目的探讨慢性乙型肝炎病毒（HBV）基因型与拉米夫定疗效的关系。方法选用200例HBV DNA、HbeAg阳性，血清丙氨酸氨基转氨酶（ALT）异常的慢性乙型病毒性肝炎患者，口服拉米夫定（100mg／d）24个月。采用荧光探针定量PCR（FQ—PCR）检测HBVDNA，分析乙肝病毒野生型YMDD及突变耐药型YIDD／YVDD，HBV基因分型。结果200例慢性乙肝患者C基因型占39％，B基因型占26％，D基因型占22％，B＋C混合基因型占10％，其他占3％，包括1例出现YIDD耐药株。口服拉米夫定12个月后，YMDD变异发生率为6％（12／200）；口服拉米夫定24个月后，YMDD变异发生率为15％（30／200）。结论本研究中乙肝患者HBV基因型以C型为主，其次为B型及D型：服用拉米夫定后大多数患者的DNA水平明显降低，拉米夫定治疗可加速病毒YMDD变异发生，且与服药时间呈正相关；YMDD突变与乙肝病毒的基因型无关。     

乙肝患者前S1蛋白和HBV—DNA检测结果分析

目的探讨乙型肝炎患者前S1蛋白和HBV—DNA检测的临床价值．方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测748例乙肝患者HBV—M和前S1蛋白，并与HBV—DNA做对比分析。结果在HBsAg／HBeAg／HBcAb均阳性的高复制组中，前S1蛋白阳性占86．9％，HBV—DNA阳性占98.2％；HBsAg／HBeAb／HBcAb均阳性的低复制组中，前S1蛋白阳性占31.1％，HBV—DNA阳性占41．6％；HBsAb／HBeAb／HBcAb均阳性的康复组中．前S1蛋白和HBV—DNA均为阴性．结论前S1蛋白能够敏感地反映乙型肝炎病毒的复制情况，尤其可以反映HBeAg阴性的乙型肝炎惠者是否有病毒复制。     

阿德福韦酯联合拉米夫定治疗慢性乙肝的疗效研究

目的观察阿德福韦酯联合拉米夫定治疗慢性乙肝的临床疗效。方法选择我院2008年1月～2010年1月住院治疗的慢性乙肝患者72例,随机分为联合组（阿德福韦酯联合拉米夫定）和对照组（单独应用阿德福韦酯）各36例．比较两组治疗12个月后的应答率、YMDD变异率、ALT复常率、HBeAg转阴率、HBV—DNA转阴率,并观察用药的安全性。结果联合组的完全应答率达52．8％（19／36）,明显高于对照组的27．8％（10／36）,两组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。对照组ALT复常率为52．8％（19／36）,而联合组治疗12个月后ALT复常率为83．3％（30／36）,两组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。两组治疗12个月后,对照组出现YMDD变异共7例,YMDD变异率为19．4％（7／36）,而联合组出现YMDD变异共2例,YMDD变异率为5．6％（2／36）,联合组的YMDD变异率明显低于对照组,两组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。两组治疗12个月后,对照组HBV—DNA转阴率,联合组HBV—DNA转阴率为61．1％（22／36）,两组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。两组治疗12个月后,联合组HBeAg转阴率为50．0％（18／36）,而对照组HBeAg转阴率为16．7％（6／36）,两组比较差异有显著性统计学意义（P〈0．01）。结论阿德福韦酯联合拉米夫定治疗慢性乙肝的疗效优于单独应用阿德福韦酯的疗效,能明显改善患者的肝功能,提高HBV—DNA及HBeAg转阴率。值得广泛推广和应用。     

HBeAg阳性患者血清中Pre-S1抗原与C基因启动子变异的检测

目的 研究HBV C基因启动子(Basic Core Promoter，BCP)与前S1(Pre-S1)抗原基因变异的关系，以及BCP基因变异与HBV DNA含量的关系。方法 分别对94例HBeAg阳性乙肝患者进行酶联免疫吸附法(ELISA)检测Pre—S1抗原，PCR荧光定量技术检测HBV DNA，PCR—微板核酸杂交ELISA技术检测BCP中nt1762A—T和nt 1764G—A的基因突变。结果 在94例HBeAg阳性乙肝患者血清检测中，Pre—S1抗原阳性有65例，其中BCP阳性51例，BCP变异率为78．5％；Pre—S1抗原阴性有29例，其中BCP阳性23例，BCP变异率为79．3％。74例BCP基因突变血清中，55例(74．3％)的HBV DNA拷贝数超过了10^5 CPS／ml；而在20例非BCP基因突变血清中，只有6例(30％)的HBV DNA拷贝数超过了10^5CPS／ml。结论 e抗原阳性乙肝患者中，Pre—S1抗原的存在与BCP的变异并无相关性，但BCP基因变异与HBV DNA拷贝数则成正相关，它们都可反映乙肝病情的严重程度及其愈后、转归。     

α-干扰素治疗慢性乙型肝炎94例临床观察

目的：总结α-干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效与临床指标变化特点，提出干扰素疗效预测的相关指标。方法：对干扰素治疗的慢性乙型肝炎94例，按丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平分组；对行肝活检的42例按炎症程度分组，观察其对乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎脱氧核糖核酸(HBV—DNA)转阴率的影响，并了解转阴时间，以提出最佳抗病毒方案。结果；(1)随着ALT、肝组织炎症程度增加，HBeAg、HBV—DNA转阴率增加。(2)在HBV—DNA转阴的患者中，治疗3个月时38例(84．4％)转阴，6个月时44例(97．8％)转阴。(3)在干扰索治疗中，已HBeAg血清转阴的5例HBV-1896前c区变异株患者，4例已HBV—DNA转阴的病情复发，1例始终无效。结论：治疗前ALT水平肝组织炎症程度高的对干扰素反应好，对治疗6个月无效者，建议停药；治疗前存在HBV一1896前C区变异株可影响疗效。     

慢性乙肝患者HBV—DNA与免疫标志物模式和肝功能指标的关系

目的探讨慢性乙肝患者HBVDNA含量与免疫标志物及肝功能损害的关系。方法对442例住院和门诊慢性乙肝患者分别检测HBV—M、HBVDNA含量及转氨酶（ALT、AST）,对检测结果进行统计学分析。结果血清HBVDNA含量与HBV—M模式有关,HBeAg阳性者HBVDNA含量均〉10^3拷贝／ml,其中含量在10^5—10^7拷贝／ml者为53．45％,〉10^8拷贝／ml者为43．10％,与HBeAg阴性组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）。ALT、AST异常率随HBVDNA含量增高而增高。结论HBeAg与HBVDNA含量明显相关;慢性乙肝患者肝功能状态与血清HBVDNA含量有关。     

乙型肝炎病毒多聚酶基因YMDD变异与临床治疗反应

目的：了解深圳地区慢性乙型肝炎患者在长期拉米夫定治疗中HBV多聚酶基因YMDD变异的情况及其对治疗反应的影响。方法：对100例拉米夫定治疗中28例出现血清病毒核酸（HBV DNA）阳性的患者,采用限制性片段长度多态性分析法（PCR－RFLP）检测YMDD变异,并观察其血清HBV DNA及丙氨酸转氨酶（ALT）水平。结果：100例中有17例YMDD变异阳性，其中以YVDD（M550V）变异为主,占64．7％（11／17），YIDD（M550I）变异为35．3％（6／17）。发生YMDD变异的患者均伴有HBV DNA及ALT水平反跳，1例住院患者停用拉米夫定后出现病情加重。结论：深圳地区慢性乙型肝炎患者在长期拉米夫定治疗中（疗程1年，100md/d）HBV多聚酶基因YMDD变异率为17．0％（17／100）。发生变异者较无变异者疗效降低，检测YMDD变异有助于监测疗效。     

慢性HBV感染患者bcp/pc区点突变模式、pres区缺失及其临床意义

目的阐明HBV(hepatitis B virus,HBV)感染患者不同临床阶段bcp/pc(basic core promoter,BCP/precore,PC)点突变模式及pres区缺失突变规律,并探讨其临床意义。方法慢性HBV感染患者180例,其中,无症状HBV携带者13例,慢性乙型肝炎者75例,HBV相关肝硬化及肝癌分别为62、30例。Qiagen法提取血清HBV-DNA,常规PCR扩增目的基因,纯化PCR产物ABI377DNA自动测序仪直接双向测序。直接测序失败者,回收目的 DNA与PMD-18T载体连接,克隆质粒双向测序。DNAStar软件包的SeqMan软件进行生物信息分析。结果 Bcp/pc区点突变包括nt1753、nt1762、nt1764、nt1776、nt1803、nt1846、nt1896。HBV携带者、慢性乙型肝炎、HBV相关肝硬化及肝癌患者nt 1762(nt 1764)点突变率分别为7.7%、68.0%、72.7%(68.0%)及90.9%(81.8%),肝癌患者G1896A突变频率占54.6%。A1762T+G1764A联合突变占36%;A1762T、G1764A、G1896A联合突变占11%;T1753A/C、A1762T、G1764A、G1896A发生率为7%。克隆测序显示,肝硬化及肝癌患者bcp区起始点A1727G点突变率分别为72%、63%。HBeAg阴性患者存在更多的基因变异(P=0.022),G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素(P<0.05)。Bcp区点突变与HBeAg阴性无明显关系。肝硬化和肝癌患者pres基因缺失突变频率最高,肝癌及肝硬化患者pres1、pres2及pres1+s2缺失频率分别为7.1%、71.4%、7.1%及41.2%、58.8%、29.4%(P<0.05)。结论 A1727G、A1762T、G1764A及A1762T/G1764A联合突变、pres缺失在HBV相关肝硬化及肝癌患者多见,可能是肝脏疾病进展的危险因素,G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素。Bcp/pc点突变及pres区缺失可能为肝癌发生的早期预测因素,值得进一步研究。     

乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片的临床应用

目的:评价临床应用乙型肝炎病毒(HBV)基因多态性芯片(中科院上海微系统和信息技术研究所等研制),检测HBV基因前C区1896、1814,基本C区启动子(BCP)1762和1764,P区的YMDD基序552位等的点突变的效能。方法:以该芯片检测49例不同临床类型乙型肝炎病人血清,并对部分血清的PCR扩增产物进行测序分析。结果:HBV前C区1896位在血清HBeAg阳性病例中,野生株、混合(野生/突变)株、突变株和未确定(无杂交信号)的检出率,分别为57.7％,38.5％,0和3.8％;血清抗HBe阳性病例中,相应为33.3％,22.2％,33.3％和11％,后者突变株显著高于前者(P<0.01)。所有病例HBV前C区的1814位均为野生,未检出突变。BCP 1762和1764双突变在慢性重型肝炎和肝炎肝硬化的检出率分别为66.7％和69.2％,显著高于慢性肝炎的19%(P<0.01)。10例拉米夫定治疗6月以上,HBV DNA仍阳性者中,7例检出P区YIDD或YVDD突变,1例兼有YIDD和YVDD突变,余2例无杂交信号。7例1 896,4例BCP,6例YMDD的测序和芯片检测结果一致,6例无信号位点的测序结果显示,这些位点附近,出现了与杂交探针错配的突变。结论:初步结果提示,该芯片适用于临床检测HBV前C区、P区一些已知热点的突变,并可用于研究这些突变与疾病严重性,及产生抗HBV药物耐药间的相互关系。     

Hot spot mutations of hepatitis B virus pre-C/C gene and its promotor in Chinese patients and the clinical implications

OBJECTIVE: To study if the functions of C gene and its promotor are related to the pathogenesis of hepatitis B and to describe their hot spot mutations in Chinese patients. DATA SOURCES: We have studied this subject in recent years. A mini-review is based on some unpublished works. DATA SELECTION: The sequence data of C gene and core promotor (cp) of hepatitis B virus (HBV) were analysed in the asymptomatic carriers (AsC) and the patients of hepatitis with various severity. RESULTS: Pre-C A1896 mutation occurred in 67% of anti-HBe-positive and 38% of HBeAg-positive cases. All were chronic infections. In C gene, 8 missense mutations in the segment of codon 48-60, and 28 in codon 84-101 were found, more in severe patients. The cp mutations of nt 1762 and nt 1764 occurred more in HBeAg-negative than in positive cases (49% vs 20%), and more in patients than in AsC (56% vs 10%). CONCLUSIONS: A1896 often occurred in nature infection course. The cp and clustering C gene mutations would more frequently lead to prolonged active infection and advanced liver diseases.     

乙型肝炎病毒核心启动子热点突变与HBcAg存在状态

目的：研究乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核心启动子（ＢＣＰ）区１７６２位和１７６４位热点突变对ＨＢｅＡｇ存在状态的影响。方法：采用错配引物的ＰＣＲ结合限制性内切酶技术检测９０例不同ＨＢｅＧａ状态的ＨＢＶ无症状携带者的ＨＢＶＢＣＰ热点突变。结果：６０例ＨＢｅＡｇ阴性者中ＨＢＶＢＣＰ热点突变者２６例（４３．３％）,其中２０例伴有ＨＢＶ前Ｃ区（Ｐｒｅ－Ｃ）区１８９６位热点突变;３０例ＨＢｅＡｇ阳性者中仅３例（１     

乙型肝炎病毒前-C区1896和基本C区启动子区1762、1764 双突变及YMDD变异对拉米呋啶治疗的影响

目的:研究乙型肝炎病毒前-C区G1896A突变和基本C区启动子区A1762T、G1764A双突变对拉米呋啶治疗的影响。 方法:采用直接测序法对服药前、中、后的血清标本的逆转录多聚酶区及前-C、基本C区启动子区进行检测。 结果:①前-C区G1896A和基本C区启动子区A1762T、G1764A双突变在出现治疗中病毒学反弹与未出现治疗中病毒学反弹患者间及发生血清学转移与未发生血清学转换患者间差异无显著性(P>0.05);②G1896A突变在发生YMDD变异和未发生YMDD变异的患者间差异有显著性(P<0.05),发生YMDD变异的患者很少伴有G1896A突变率低(9%);③出现治疗中病毒学反弹的患者YMDD变异增加,与未出现治疗中病毒学反弹的患者比较差异有显著性(P<0.05)。 结论:前-C区G1896A和基本C区启动子区A1762T、G1764A双突变对拉米呋啶治疗后出现的治疗中病毒学反弹和血清学转换没有影响;在G1896A突变株YMDD变异减少;YMDD变异株的出现对治疗后出现的治疗中病毒学反弹有影响;YMDD变异可能是加剧肝细胞损伤引起治疗中病毒学反弹的因素之一。     

乙型肝炎患者血清HBV前C区A1896变异的检测分析

目的了解HBsAg（＋）/HBcAb（＋）/HBeAb（＋）的慢性乙肝病人血清乙肝病毒（HBV）DNA前C区A1896的变异情况及其与临床关系。方法对所有试验对象检测肝功能指标,根据检测结果分为丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高组和ALT正常组。用聚合酶链反应杂交（PCR-ELISA）定量检测HBV-DNA并进一步检测HBV前C区A1896位点的变异情况。结果 38例患者中有18例HBV-DNA阳性,其中15例发生A1896位点变异,变异率为83.3%（15/18）。ALT升高组的18例中,血清HBV-DNA阳性13例,阳性率72.2%,平均浓度为9.62×106（1.10×103～1.09×108）拷贝/ml,A1896变异13例,变异率为100%（13/13）。ALT正常组的20例中,HBV-DNA阳性5例,阳性率25.00%,平均浓度2.55×104（3.28×103～4.61×104）拷贝/ml。A1896变异2例,变异率为40%（2/5）。两组比较无论在HBV-DNA阳性率,还是A1896位变异率都具有统计学差异（P〈0.05）。结论 HBsAg（＋）/HBcAb（＋）/HBeAb（＋）的慢性乙肝患者存在较高的A1896变异率,ALT升高组HBV-DNA阳性率和变异率均高于ALT正常组（P〈0.05）,提示HBV A1896位点变异与肝脏病变活动加重和ALT升高有关。     

乙型肝炎病毒1896位点变异荧光PCR法检测及意义

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前C区1896位点突变与临床关系。方法：采用荧光聚合酶链反应（PCR）对74例各型乙肝患者HBV前C区基因进行扩增,鉴定前C区1896位点突变。结果：有41例（55．41％）发生了1896位点突变。其中慢性乙型肝炎（CHB）和肝硬化（LC）组均高于无症状HBV携带者组（ASC）（P〈0．05）。抗-HBe（＋）组的变异检出率为71．11％,高于HBeAg（＋）组的31．03％（P〈0．01）。并且随着HBVDNA含量的增高,其发生变异的可能性越大（P〈0．01）。结论：前C区1896位点突变的发生可能与机体长期的炎症活动、免疫压力的选择有关。     

乙型肝炎病毒X基因变异和慢性乙型肝炎患者临床与组织病理学指标的相关性

 目的 探讨慢性乙型肝炎患者肝组织内乙型肝炎病毒（HBV）X基因部分区段的变异与HBV相关各临床与组织病理学指标的关系。方法 以83例慢性乙型肝炎肝穿刺活检标本作为研究对象，20例HBV相关性肝细胞癌作为对照；HBV X基因变异的研究采用PCR扩增和直接双向测序。免疫组化二步法显示肝组织内四种病毒蛋白的表达；荧光实时定量PCR检测肝组织内HBV DNA含量。结果 HBV X基因nt1583～1793区段错义突变主要出现在对应的X蛋白aa87（nt1632、1633）、88（nt1635、1636）、116（nt1719）、118（nt1726、1727）、119（nt1730）、127（nt1752）、130（nt1762）和131（nt1764）位氨基酸。nt1725～1730（aa118/119）突变与肝组织内HBcAg显著低表达（P=0.006），和HBV DNA低拷贝数（P=0.004）明显相关，尤以ACTGAC（TD）型突变最为明显；相反，nt1762/1764（aa130/131）位点突变则伴肝组织内HBcAg显著高表达（P=0.005）和高水平的HBV DNA含量（P=0.006）。同时，肝癌组中nt1725～1730 野生型所占比率明显高于慢性肝炎（P<0.05），而nt1762/1764 突变型所占比率肝癌组与肝炎组相比显著增高（P<0.01）。结论 肝组织内，在nt1725～1730突变能显著降低HBcAg 的表达和HBV DNA水平，nt1762/1764突变则相反。肝组织内HBV的高负载可能与肝细胞癌的发生有关     

HBV多基因位点变异与肝细胞癌相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒前C区和C基因启动子基因变异与肝细胞癌发生的关系。方法采用实时荧光PCR检测29例慢性乙型肝炎（CHB）,27例乙型肝炎肝硬化（LC）,26例HBV相关肝细胞癌（HCC）患者血清HBV前C区G1896A和BCP区A1762T／G1764A的变异情况。结果HCC组和LC组前c区G1896A和BCP区A1762T／G1764A变异率均显著高于CHB组（P≤0．005）,HCC组和LC组间无显著差异（P〉0．05）。结论乙型肝炎病毒C基因启动子和前c区基因变异与肝细胞癌、肝硬化的发生密切相关。