人骨髓间充质干细胞对同种异体调节性T细胞的影响及可能机制实验研究

本研究探讨人骨髓间充质干细胞（human mesenchymalstem cells,hMSC）对同种异体CD4^＋CD25^＋调节T细胞的作用,进一步查明人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞免疫调节作用的可能机制。从人骨髓中分离培养hMSC,通过免疫组织化学方法检测其表面标记并进行鉴定。从非亲缘供者健康人外周血中提取单个核细胞,在IL-2作用下体外培养,实验组加入不同数量级hMSC（1×10^3,1×10^4,1×10^5）共培养5天,对照组加入PBS。于结束培养前18小时经3H-TdR标记后用β液体闪烁计数仪检测T淋巴细胞增殖,流式细胞术检测各组CD4^＋CD25^＋T细胞的百分率,RT-PCR检测各组细胞Foxp3的相对表达量（Foxp3/β-actin）,ELISA分别测定上清中TGF-β、IL-10、IFN-γ和IL-12的表达。Pearson检验分析Foxp3相对表达量与CD4^＋CD25^＋T细胞百分率的相关性,以及Foxp3相对表达量、CD4^＋CD25^＋T细胞百分率与T淋巴细胞增殖程度（counts per minute,CPM值）,细胞因子TGF-β、IL-10、IFN-γ和IL-12表达量的相关性。结果表明：hMSC能明显抑制T淋巴细胞增殖,且抑制作用与hMSC呈剂量依赖性;实验组各组CD4^＋CD25^＋T细胞亚群含量以及Foxp3相对表达水平均较对照组明显增加（p〈0.05）,且实验组间比较差异仍具有统计学意义（p〈0.05）;Foxp3表达水平、CD4^＋CD25^＋T细胞百分率与T淋巴细胞增殖水平呈明显负相关（p〈0.05）,与TGF-β、IL-10表达量呈明显正相关,而与IFN-γ和IL-12的表达无明显相关性。结论：hMSC呈剂量依赖性抑制同种异体淋巴细胞增殖,其机制可能与hMSC通过分泌TGF-β、IL-10促进CD4^＋CD25^-T细胞向表达Foxp3的CD4^＋CD25^＋调节T细胞转化,进而发挥免疫抑制作用有关。     

间充质干细胞影响T淋巴细胞杀伤K562细胞效应的研究

本研究探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）对T淋巴细胞杀伤K562细胞的影响。从骨髓中分离培养MSCs，尼龙棉柱法分离外周血T细胞，将T细胞与MSCs共培养，用流式细胞术检测T细胞亚群的变化．乳酸脱氢酶法检测与MSC共培养及单独培养的T细胞对K562细胞的杀伤效应，用ELISA法检测IFN-γ IL-4的表达。结果表明，与MSC共培养3天后，CD4^＋与CD4^＋ CD25^＋ T细胞与单独培养组相比显著升高（P〈0．05），CD8^＋T细胞则无显著差异（P〉0．05）；与MSC共培养的T细胞对K562细胞的杀伤作用减弱，同时IFN-1表达减少，IL-4表达增加。结论：MSC减弱了T细胞对K562细胞的杀伤效应，与反应体系中CD4^＋ CD25^＋ T细胞比例增多及IFN-γ、IL-4表达水平改变有关。     

人骨髓间充质干细胞对免疫介导型再生障碍性贫血患者TGF-β1的影响

目的 为了研究间充质千细胞（mesenchymal stem cell，MSC）对免疫介导型再生障碍性贫血患者的免疫调节作用。方法 利用密度梯度离心法分离培养骨髓间充质千细胞，通过流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度，然后接种于96孔板中，与经分离的再生障碍性贫血T淋巴细胞共培养，以单独培养的T淋巴细胞和MSC为对照组，分别采用RT-PCR检测TGF-β1基因的表达，ELISA检测TGF-β1蛋白的表达。结果单独T、单独MSC、T＋MSC各组表达TGF-β1基因和蛋白水平差别均有显著的统计学意义（P＜0．05）。结论MSC对TGF-β1有负调控作用。     

干扰素-γ与间充质干细胞在免疫抑制中的协同作用及机制研究

目的 探讨干扰素-γ(IFN-γ)对正常人骨髓间充质干细胞(MSC)免疫活性的影响,阐明IFN-γ与MSC在免疫抑制中的协同作用.方法 ①ELISA法检测IFN-γ(终浓度100 ng/ml)对正常人骨髓来源MSC前列腺素E2(PGE2)、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达水平的影响.②RT-PCR法检测100 ng/ml IFN-γ作用下MSC内吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)基因表达水平变化.③体外刺激正常人外周血T细胞增殖,并与正常人骨髓来源MSC共培养,检测T细胞增殖水平;在共培养体系中分别加入重组人IFN-γ(100 ng/ml)及鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(单抗,5μg/ml),检测T细胞增殖水平变化.结果 ①MSC单独培养24 ～ 48 h可检测到PGE2、HGF、TGF-β1三种细胞因子表达;IFN-γ可促进MSC上述细胞因子的表达[实验组及对照组PGE2、HGF、TGF-β1表达水平分别为(1715.5 ±628.6) pg/ml对(1344.5±709.4) pg/ml;(4031.8±1496.8) pg/ml对(2452.4±1375.3)pg/ml;(1753.5±413.8) pg/ml对(1026.6±450.5) pg/ml,P值分别为0.001、0.011及＜0.001].②MSC单独培养48 h后,RT-PCR法未检测到IDO基因表达.与IFN-γ共培养后,IDO基因呈高水平表达.③在体外MSC可以显著抑制T细胞增殖,外源性IFN-γ不影响MSC对T细胞增殖的抑制作用[T细胞增殖抑制率分别为(40.4±10.9)％和(36.7±7.4)％,P=0.272];在反应体系中加入抗IFN-γ单抗后,MSC抑制T细胞增殖作用显著减弱[T细胞增殖抑制率分别为(40.4±10.9)％和(23.9±7.6)％,P =0.002].结论 MSC组成性表达PGE2、HGF及TGF-β1等免疫抑制性细胞因子,在一定水平IFN-γ作用下,MSC分泌上述3种细胞因子水平明显上调,IDO mRNA表达水平显著增高,MSC免疫活性增强.骨髓MSC在体外可以显著抑制T淋巴细胞增殖,IFN-γ与MSC在免疫抑制中具有协同效应.     

IFN-γ增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制能力

本研究旨在探讨IFN-γ对脐带间充质干细胞免疫抑制能力的影响。利用细胞因子刺激细胞表面受体的方法改变MSC的免疫抑制能力。用MSC与淋巴细胞共培养实验检测激活后MSC对淋巴细胞增殖抑制的变化。用荧光定量PCR实验和ELISA实验检测激活后MSC基因和蛋白的表达变化情况。结果表明：IFN-γ可以增强脐带MSC的免疫抑制能力,IFN-γ激活后的MSC能更有效的抑制淋巴细胞的增殖,上调MSC细胞内免疫抑制基因IDO1,COX2和HM—G等的表达和可溶性免疫抑制蛋白HLA-G、KYN、IL-10、PGE2等的分泌,并在细胞共培养实验中将间充质干细胞的免疫抑制功能提高2—7倍。结论：IFN-γ可有效提高MSC的免疫抑制能力。     

IFN-γ在骨髓增生异常综合征发病中作用

目的 研究骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓内T细胞亚群水平，T细胞产生IFN-γ能力，及与造血干细胞凋亡的关系，探讨T细胞、IFN-γ在MDS发病中作用。方法 骨髓单个核细胞经短期培养并激活T细胞，采用细胞内因子测定技术，用流式细胞术测定骨髓内T细胞亚群，T细胞IFN-γ水平，RT-PCR技术测定BMMNC凋亡基因Fasm-RNA水平。结果 MDS患者骨髓内异常活化的T细胞(CD3^ CD45RO^ 、CD4^ CD45RO^ 、CD8^ CD45RO^ 细胞)增多，活化的T细胞产生IFN-γ增多，并与Fas-mRNA存在相关性。结论 MDS患者骨髓内活化的T细胞增多，这些细胞产生的IFN-γ可能增加凋亡基因Fas的表达。     

流式细胞术研究间充质干细胞对人Th1细胞的作用

本研究应用流式细胞术(FCM)探究胚胎骨髓来源的间充质干细胞(FBM-MSC)对人Th1细胞的作用。体外分离、培养、扩增人FBM-MSC,并对其进行免疫表型及分化潜能的鉴定。CD4+T细胞单独培养或与FBM-MSC共培养(FBM-MSC/CD4),通过FCM和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别测定单独培养的CD4+T细胞和FBM-MSC/CD4中Th1细胞(干扰素-γ+)的数量。结果表明,FBM-MSC的免疫表型及分化潜能均符合间充质干细胞(MSC)的标准。FBM-MSC对Th1细胞的发育具有抑制作用。FCM检测发现,FBM-MSC/CD4中Th1细胞数量明显低于单独培养的CD4+T细胞。ELISA检测结果表明,IFN-γ的蛋白水平在FBM-MSC/CD4中亦低于单独培养的CD4+T细胞;同时,FBM-MSC/CD4中IL-6的表达水平明显高于单独培养的CD4+T细胞或FBM-MSC细胞中的水平。而IL-6中和抗体能够增加FBM-MSC/CD4中的Th1细胞数量和IFN-γ的水平。结论:FBM-MSC对人Th1细胞具有抑制作用,IL-6信号通路可能是该抑制作用的机制之一。     

骨髓间充质干细胞对T细胞亚群的影响

本研究探讨人骨髓间充质干细胞对植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）刺激引起的T细胞增殖的影响和可能机制。应用CD3^＋磁珠分选T淋巴细胞，从骨髓分离出的间充质干细胞经照射后与T细胞共培养过夜，经PHA（5μg/ml）作用72小时后，应用BrdU检测T细胞的增殖情况，应用流式细胞术检测T细胞的Annexinv／PI的水平。对未经照射的骨髓间充质干细胞处理的T细胞，用PHA处理72小时后收集T细胞，应用流式细胞术检测CD4，CD8以及CD4和CD25的表达，同时设立未经PHA处理的T细胞与照射的骨髓间充质干细胞共培养组，及未经骨髓间充质干细胞处理的T细胞组。结果表明：骨髓间充质干细胞抑制PHA引起的T细胞的增殖，但不诱导T细胞凋亡。与未处理组相比，骨髓间充质干细胞处理组中T细胞的CD4^＋CD8^＋细胞比例无显著变化；但在PHA作用下，骨髓间充质干细胞处理组中T细胞的CD4^＋亚群显著增加，且呈剂量依赖性，但CD4^＋CD25^＋细胞亚群显著减少。结论：骨髓间充质干细胞抑制PHA刺激所引起的T细胞增殖，对CD8^＋T细胞的抑制作用更强．推测其可能的机制与CD4^＋调节性T细胞的参与有关．但与CD25^＋T调节细胞无明显关系。     

小鼠骨髓间充质干细胞对脾细胞免疫反应的影响

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mMSC)对脾细胞免疫反应性增殖的作用及机制.方法 分别采用有丝分裂原刀豆球蛋白A(ConA)(20 μg/ml)和异基因抗原(异基因小鼠脾细胞)作为刺激因素,观察不同比例mMSC对同基因和异基因脾细胞增殖的影响.MTT法测定脾细胞免疫反应性增殖水平;流式细胞术检测CD4+/CD8+细胞比值、CD4+CD25+细胞百分比;ELISA法检测IFN-γ、IL-2、TGF-β1.、IL-4水平.结果 ①ConA刺激时,mMSC对同基因和异基因(BALB/c)脾细胞的反应性增殖的抑制作用相似,呈细胞数量依赖性,当细胞比例为1:1时,抑制率为84.21%.在异基因抗原刺激下,mMSC对同基因和异基因脾细胞反应性增殖的抑制作用相似,细胞比例为1:10时,抑制率为88.07%,呈细胞数量依赖性.②在ConA刺激下,mMSC-S脾细胞比例为1:1组的CD4+/CD8+比值为2.61±0.24,CD4+CD25+细胞比例为(6.34±0.69)%,与对照组比较差异有统计学意义(P《0.05).在异基因抗原刺激下,1:10组CD4+/CD8+比值为2.49±0.14、CD4+CD25+细胞比例为(8.31±0.80)%,与对照组比较差异有统计学意义(P《0.05).③在共培养体系中mMSC可抑制IFN-γ、IL-2的分泌,促进TGF-β1、IL-4的分泌,其水平与mMSC的数量呈正相关.结论 在体外培养体系中,mMSC呈数量依赖性抑制同基因或异基因脾细胞对有丝分裂原和异基因抗原诱发的免疫反应性增殖;在mMSC作用下,脾细胞中CD4+/CD8+比值增高、CD4+CD25+细胞比例升高,致炎因子分泌降低、抗炎因子分泌升高,并呈mMSC数量依赖性.     

TGF-β1和IL-10对间充质干细胞来源细胞外囊泡免疫调节功能的影响

目的:探讨TGF-β1和IL-10对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)分泌的细胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)免疫调控功能的影响。方法:分离扩增人脐带来源的MSC,分别用TGF-β1和IL-10处理72 h,提取上清中MSC-EV。应用BCA法测定提取EV的总蛋白含量,在透射电子显微镜下观察EV的形态结构,流式细胞术检测EV表面标志物以鉴定MSC-EV。在ConA刺激后的人外周血单个核细胞(PBMNC)培养体系中,加入不同处理方法获得的EV,培养72 h后应用流式细胞仪检测PBMNC的凋亡,以及CD4+CD25+/CD127-调节T(Treg)细胞比例。应用CBA试剂盒和ELISA试剂盒检测培养PBMNC上清以及MSC-EV中IL2,IL4,IL6,IL10,IFN-γ,TNF-α,Th17A和TGF-β1的含量。结果:不同处理后的EV在透射电子显微镜下均呈现特征性杯口状膜样结构,均表达CD9,CD44,CD63及CD81。TGF-β1处理后MSC-EV促PBMNC凋亡的能力明显增强(P 0.01),不同处理后EV均可以提高Treg细胞比例。MSC-EV可以提高PBMNC培养上清中IL-10的含量,TGF-β1处理MSC-EV共培养后的PBMNC上清TGF-β1含量较未处理组明显降低(P 0.05)。TGF-β1处理后的MSC-EV样本IL-6含量显著升高,TGF-β1含量降低。结论:TGF-β1处理后MSC-EV的免疫调控功能发生改变,其意义值得进一步研究阐明。     

HMGB1对健康人骨髓间充质干细胞增殖和细胞因子分泌的影响

目的:探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)对健康人骨髓间充质干细胞(MSC)增殖及相关细胞因子分泌的影响。方法:分别用CCK-8法和流式细胞术检测HMGB1对MSC增殖的影响,以不同浓度重组人HMGB1(100、200、400、800和1 000 ng/ml)分别作用MSC 24、48、72 h后,CCK-8法检测不同浓度的HMGB1对MSC增殖的影响。确定HMGB1对MSC作用的最佳实验药物浓度(200和1 000 ng/ml),进一步用流式细胞术明确HMGB1对MSC增殖的影响。采用ELISA与q PCR法检测HMGB1作用前后MSC中IL-10、TGF-β1、TSG-6、IFN-γ的表达水平。结果:MSC的鉴定,流式细胞术检测结果显示,培养细胞表面表达CD105、CD73、CD90,不表达CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR。CCK-8法检测HMGB1对MSC增殖的影响发现,与对照组比较,HMGB1 100、200和400 ng/m L作用于MSC 24、48和72 h可明显促进MSC增殖(P0.05),以200 ng/ml浓度作用的增殖效果最明显。流式细胞术检测结果显示,HMGB1于200 ng/ml时可诱导MSC由G1期进入S期,促进MSC增殖。q PCR法检测结果显示,在HMGB1200 ng/ml作用下,MSC中IL-10、TGF-β1、TSG-6 mRNA较作用前表达增高,IFN-γ表达降低。ELISA实验表明,与对照组比较,HMGB1 200 ng/ml作用48 h后,MSC分泌的细胞因子IL-10、TGF-β1、TSG-6蛋白水平显著升高(P0.05),IFN-γ蛋白水平无明显变化(P0.05)。结论:重组人HMGB1可促进健康人MSC增殖和影响其细胞因子分泌。     

转化生长因子β1对人外周血T淋巴细胞体外增殖及活化的影响

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)对人T淋巴细胞的增殖及活化的影响.方法:以MTT法检测TGF-β1对T淋巴细胞增殖的影响;流式细胞术检测TGF-β1对T淋巴细胞活化的影响及CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的数量;ELISA法检测TGF-β1对T淋巴细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)的影响.结果:不同浓度的TGF-β1分别作用不同时间后,均可抑制T淋巴细胞的增殖,并随时间的延长、浓度的增加抑制作用增强.不同浓度的TGF-β1作用72 h,均能抑制T淋巴细胞活化,活化标志CD69表达率明显降低(P＜0.01);均能明显上调CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的比例(P＜0.01);均能抑制T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2(P＜0.01),且呈剂量依赖性.结论:TGF-β1可以抑制T淋巴细胞的增殖,抑制T淋巴细胞活化,上调CD4+CD25+调节性T细胞的比例,并抑制IFN-γ、IL-2的分泌.     

干扰素-γ增强人脐带间充质干细胞免疫抑制作用的研究

目的:观察干扰素-γ(IFN-γ)增强人脐带间充质干细胞(HUMSCs)在体外对CD4+T细胞增殖的抑制作用。方法:采用胶原酶Ⅱ对人脐带组织进行消化,分离出间充质干细胞(MSCs),贴壁培养,经过传代纯化后,在体外将HUMSCs与CD4+T细胞[健康成人的外周血单个核细胞(PBMC)用免疫磁珠分选得到]共培养,CD4+T细胞用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记,流式细胞仪测定CD4+T细胞的增殖情况,并通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以及Westernblot分别测定未经处理的HUMSCs以及IFN-γ处理后HUMSCs的吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)基因及蛋白表达水平。结果:IFN-γ处理后的HUMSCs能够抑制CD4+T细胞的增殖(P<0.05),而未处理的HUMSCs对CD4+T细胞的增殖抑制作用不显著。IFN-γ处理后的HUMSCs能够表达IDO,而未处理组则不表达IDO。结论:IFN-γ能够通过IDO的表达增强HUMSCs在体外对CD4+T细胞增殖的抑制作用。     

慢病毒介导TGF-β3/BMP-2联合基因转染诱导兔骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化

目的重组慢病毒介导TGF-β3/BMP-2联合基因转染兔骨髓间充质干细胞,诱导其软骨细胞分化,与TGF-β3单基因转染诱导其软骨细胞分化的效率作比较。方法全骨髓贴壁法分离、培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术检测细胞表面抗原,培养后通过重组慢病毒分别转染阴性对照(N组)、TGF-β3单基因(T组)、TGF-β3/BMP-2联合基因(TB组),培养14 d后,荧光显微镜下观察各组细胞形态,RT-PCR、Western blot分别检测SOX-9、蛋白多糖、Ⅱ型胶原在基因水平与蛋白水平的表达量。结果流式细胞术检测造血干细胞标志物(CD34,2.07%)、白细胞表面抗原(HLA-DR,1.73%)均为阴性,透明质酸受体(CD44,82.79%)为阳性,荧光显微镜观察诱导后细胞形态多为多角形、方形或者类圆盘状,RT-PCR、Western blot结果均示T组、TB组SOX-9、蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达量均比空白对照组(C组)、N组高(P<0.05),且TB组表达量高于T组(P<0.01)。结论 TGF-β3/BMP-2联合基因转染骨髓间充质干细胞能诱导其成软骨细胞分化,且联合基因转染效率高于TGF-β3单基因转染。     

Wnt3a转基因骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的影响

目的 观察Wnt3a转基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)对T淋巴细胞增殖的影响.方法 从C57BL/6小鼠骨髓中分离培养MSC,用流式细胞术检测细胞表面标志并在不同诱导条件下进行成骨和成脂分化鉴定;采用AdEasy系统将携带Wnt3a基因的重组质粒以脂质体法转染HEK293细胞,收集病毒液感染MSC,以含绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)作对照,荧光显微镜下观察GFP的表达,Western blot检测MSC中Wnt3a和β-catenin蛋白表达;制备BALB/c小鼠脾淋巴细胞悬液,Wnt3a转基因MSC、Ad-GFP转导MSC分别按1∶100、1∶50及1∶10比例和ConA刺激的脾淋巴细胞共培养,48 h后应用CCK-8法、ELISA法检测T淋巴细胞的相对增殖率和培养上清中细胞因子含量变化.结果成功获得MSC,细胞表型检测为CD44+、CD90.2+、CD34-、CD45-,诱导后可向成骨细胞、脂肪细胞分化;包装的腺病毒滴度达1×1010 pfu/ml,病毒液感染MSC后72 h GFP表达最强,感染效率为50％～60％.Western blot结果显示Wnt.3a转基因MSC中Wnt3a和β-catenin蛋白的表达水平明显增强;MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性,在MSC与脾淋巴细胞比例为1∶10时,Ad-GFP转导MSC组T淋巴细胞增殖率为(55.41±1.75)％,IFN-γ分泌量为(326.70±14.41)pg/ml;Wnt3a转基因MSC组T淋巴细胞增殖率为(37.27±2.66)％,IFN-γ分泌量为(218.80±12.93)pg/ml,但各组MSC对IL-2的分泌无明显影响.结论 Wnt3a转基因MSC较Ad-GFP转导的MSC抑制T淋巴细胞增殖的作用更显著.     

胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的免疫调节

背景：众多研究表明间充质干细胞能发挥免疫调节功能,抑制T细胞增殖。目的：观察胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的调节作用。方法：将人胚胎骨髓间充质干细胞与正常人外周血单个核细胞或CD4＋T细胞以1∶10比例共培养4d,以单个核细胞或CD4＋T细胞单独培养为对照。应用实时定量PCR检测细胞白细胞介素17mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测细胞上清中白细胞介素17蛋白水平,流式细胞术检测Th17细胞数量。结果与结论：胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞共培养组白细胞介素17mRNA表达水平明显高于单个核细胞组（P〈0.01）。与此一致的是,胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞或CD4＋T细胞共培养组细胞上清中白细胞介素17蛋白水平明显高于单个核细胞组、CD4＋T细胞组（P〈0.05,P〈0.01）。胚胎骨髓来源间充质干细胞与CD4＋T细胞共培养组Th17细胞数量明显高于CD4＋T细胞组（P〈0.01）,但胚胎骨髓来源间充质干细胞本身并不表达白细胞介素17。表明胚胎骨髓来源间充质干细胞可促进人Th17细胞增殖。     

间充质干细胞对活化T淋巴细胞的免疫调节作用

本研究的目的是探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对活化T淋巴细胞的免疫调节作用及其在allo—HSCT相关GVHD防治中的作用。用终浓度为10μg/ml的PHA于不同时间作用T淋巴细胞，以^3H—TdR掺入法检测T细胞增殖功能；以不同数量的MSC分别与活化T淋巴细胞作用，根据MSC数量不同实验分为A组（对照组，不加MSC）、B组（MSC2×10^4）、C组（MSC4×10^4）、D组（MSC8×10^4），用^3H—TdR掺入法检测作用前后T细胞功能，FCM检测细胞免疫表型。结果显示，在终浓度为10μg／ml PHA作用下，T淋巴细胞的增殖能力随培养时间的延长而增强，48小时达高峰。FCM检测MSC细胞表型表明：CD44、CD105、CD29、FIK1表达阳性，不表达CD33、CD34、CD45、HLA—DR。随着MSC数量增加，与共培养前相比，T细胞的SI值逐渐降低（P〈0．05），但C组和D组间比较无差异（P〉0．05）。在低数量MSC作用下，CD3^＋CD4^＋表达低于对照组（P〈0．05），CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋高于对照组（P〈0．05）；C组和D组与对照组相比，CD3^＋CD4^＋表达明显降低（P〈0．01），CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋明显增高（P〈0．01）。结论：丝裂原PHA可以使T细胞活化；骨髓MSC在体外可以使活化T细胞功能和细胞免疫表型发生改变，下调CD3^＋CD4^＋的表达，上调CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋的表达。     

胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的免疫调节

背景:众多研究表明间充质干细胞能发挥免疫调节功能,抑制T细胞增殖。目的:观察胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的调节作用。方法:将人胚胎骨髓间充质干细胞与正常人外周血单个核细胞或CD4+T细胞以1∶10比例共培养4d,以单个核细胞或CD4+T细胞单独培养为对照。应用实时定量PCR检测细胞白细胞介素17mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测细胞上清中白细胞介素17蛋白水平,流式细胞术检测Th17细胞数量。结果与结论:胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞共培养组白细胞介素17mRNA表达水平明显高于单个核细胞组(P<0.01)。与此一致的是,胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞或CD4+T细胞共培养组细胞上清中白细胞介素17蛋白水平明显高于单个核细胞组、CD4+T细胞组(P<0.05,P<0.01)。胚胎骨髓来源间充质干细胞与CD4+T细胞共培养组Th17细胞数量明显高于CD4+T细胞组(P<0.01),但胚胎骨髓来源间充质干细胞本身并不表达白细胞介素17。表明胚胎骨髓来源间充质干细胞可促进人Th17细胞增殖。     

TGF-β1诱导肝星状细胞活化调控肝癌的炎症和免疫反应

目的通过TGF-β1诱导活化的肝星状细胞与肝癌细胞SMMC7721共培养,观察肝癌的炎症和免疫变化。方法选取厦门大学附属福州第二医院体外培养人肝星状细胞LX-2,用10μg/L TGF-β1处理LX-224 h,取活化LX-2上清液共培养SMMC7721细胞12 h后,用Disitetide处理共培养细胞,流式细胞术观察CD4+CD25+T细胞干预前后的表达变化,ELISA观察白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)干预前后的表达情况。结果 10μg/L的TGF-β1刺激LX-2后,α-SMA基因和蛋白水平表达均明显增加。活化的LX-2上清液与SMMC7721共培养后,CD4+CD25+的表达比例较SMMC7721中明显增加(P=0.003),IL-8和IL-10的表达水平也明显上调(P0.001),用Disitetide抑制TGF-β1后CD4+CD25+的表达比例较共培养组中明显减少(P=0.025),IL-8和IL-10的表达水平也明显下调(P0.001)。结论 TGF-β1可以诱导肝星状细胞活化从而促进肝癌细胞的炎症和免疫反应。     

骨髓间充质干细胞抑制异体T淋巴细胞反应的实验研究

目的了解骨髓间充质干细胞(MSC)能否诱导异体T淋巴细胞反应性下降,探讨防治异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病的途径。方法骨髓来源的MSC经60Co照射后与异体T淋巴细胞共培养,用3H-TdR掺入的方法测定共培养前后T淋巴细胞增殖状态及对异体细胞和非特异性分裂原刀豆素A(ConA)的反应性变化。结果MSC与异体T淋巴细胞共培养后,并不刺激T淋巴细胞的增殖;MSC作为刺激细胞与异体T淋巴细胞的首次及二次接触均不引起T淋巴细胞活化。单独T淋巴细胞的放射性核素每分钟闪烁计数(CPM)值为27529±969,首次接触与二次接触的CPM值分别为9126±654及13260±874。混合淋巴细胞反应结果表明,与MSC共孵育后的异体T淋巴细胞对MSC同源淋巴细胞反应性下降,共孵育前的CPM值为45876±5285,共孵育后的CPM值为9850±1618,ConA刺激的细胞增殖活性也显著减低。结论骨髓MSC在体外可使异体T淋巴细胞对异体抗原的反应性减低,这种作用与其低免疫原性有关。