核酸转染哺乳动物细胞技术的探讨

核酸转染哺乳动物细胞技术已成为基因功能研究的一个极为重要的手段。目前,已广泛地应用于研究病毒核酸的致癌作用,细胞癌基因的转化作用及核酸的编码功能等方面。我们在开展脊髓灰质炎病毒核酸的分子生物学研究工作中,对该病毒cDNA与病毒RNA的转染技术加以探讨。     

HIV-Ⅰ CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA质粒的构建和表达研究

目的 构建HIV-1 CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒，并鉴定、检测基因及其表达。方法 用PCR技术获得人免疫缺陷病毒CN54株的gagprotease基因，并使其两端带上合适的酶切住点，将其定向插入到包含脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒pSVA14中，替代其部分结构基因，构建HIV基因嵌合缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组的表达质粒。经筛选、鉴定后用脂质体转染技术将新构建的质粒转入Hela细胞内，用Western Blot方法检测目的基因在Hela细胞内的表达。结果 PCR技术扩增所得的人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因经琼脂糖凝胶电泳、DNA测序证实成功获得，未引入突变碱基，筛选、鉴定证明gagprotease基因被正确定向插入到脊髓灰质炎病毒的cDNA序列之中，Western Blot检测到gagpro-tcase基因正确表达了相关蛋白。结论 成功构建了表达人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因的缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组嵌合质粒，为利用脊髓灰质炎病毒作人免疫缺陷病毒基因的表达载体奠定了基础，此研究对开发以脊髓灰质炎病毒为艾滋病的疫苗载体有重要意义。     

冷盐沉淀同步分离dsRNA病毒基因组和结构多肽的方法

目的 :探索一条既能获得dsRNA病毒全基因组 ,又能同时获得该病毒完整结构多肽的方法。方法 :将分别感染了蓝舌病毒 (BTV)和人轮状病毒 (HRV)的培养细胞分别破碎以释出病毒后 ,结合应用差速离心和蔗糖梯度离心技术 ,获得了这两种病毒的纯化粒子 ;再用 1%的SDS裂解病毒 ,0 .2 5mol/L的KCl沉淀其结构蛋白 ,而病毒基因组悬于上清。结果 :所沉淀的蛋白用PBS(pH 7.8)适当稀释后 ,即可用作抗原 ;上清用酚∶仿抽提 1次后 ,即可用于核酸分子生物学研究。结论 :此方法为一套既能有效同步分离dsRNA病毒核酸和结构多肽等活性生物大分子 ,又能节约实验材料和时间的有效方法。     

HIV-1前病毒基因扩增诊断早期HIV感染的研究

目的 建立HIV前病毒核酸的检测方法，并探讨其早期诊断断HIV-1感染的效果。方法从HIV1 2蛋白印迹法确定HIV抗体阳性、并经病毒载量检测阳性的HIV感染者血浆中提取基因组DNA，应用合成HIV-1基因组gag区九条引物随机组合RT-PCR扩增HIVgag区核酸片断，筛选扩增灵敏度最高的三个扩增片断。其引物组合扩增样本核酸PCR产物经凝胶电泳观察判断结果。结果该方法的敏感性为94．17％，特异性为100％，三个片断扩增灵敏度分别为76．67％、87．5％、69．17％。结论PCR扩增HIV前病毒保守区多个基因片断，具有较高的灵敏度和特异度，方法简单，可以应用到HIV感染的早期诊断中。     

血、便、痰和尿标本中SARS冠状病毒核酸的检测和病毒基因谱的初步建立

目的：利用冠状病毒全基因组芯片检测SARS患者血、便、痰和尿标本中的冠状病毒核酸并试图建立其基因谱。方法：提取SARS患者血、便、痰和尿样本中的冠状病毒RNA，经全基因组随机反转录和PCR扩增标记成荧光探针，与SARS病毒全基因组芯片进行杂交，同时用体外培养的病毒RNA和从健康人血液中提取的RNA做对照。结果：SARS患者的4种标本中都能检测到冠状病毒核酸的存在，与整个病毒基因组相比，大都为一些不连续的片断。其中尿、痰和便标本中的基因谱较为相似，另外，发现编码S1蛋白的核酸在一些标本中是连续的，具体为23份血标本中有2份是连续的，13份痰标本中有8份是连续的，51份便标本中有48份是连续的，2份尿标本中都是连续的。结论：冠状病毒全基因组芯片能够检测出SARS患者血、便、痰和尿标本中的冠状病毒核酸，并能建立各来源标本中病毒核酸的基因谱。     

喀什0507JS32病毒的分离鉴定

2005年7～8月，在喀什地区采集蚊虫进行病毒分离，从当地居民家畜圈采集的一组库蚊分离到0507JS32病毒，该病毒对C6／36细胞致病变，而对Vero细胞不致病变。电镜观察显示，完整病毒颗粒呈球形，直径55nm，无包膜，衣壳表面壳粒结构明显。基因组核酸电泳显示基因组为12节段双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）。利用辽宁病毒（Liaoning virus，LNV）第12基因片段特异性引物对病毒RNA进行RT-PCR扩增，PCR产物进行序列测定，所得核酸序列进行BLAST比较，结果显示，与LNV病毒第12基因片段核酸序列同源性大于89％，证实该病毒为LNV病毒。     

喀什分离到新型双链RNA病毒

2005年7～8月在喀什地区采集蚊虫13,491只,50～100只／组进行研磨,取上清在06／56和Veto细胞上进行病毒分离,获得24个对06／36细胞致病变而对Vero细胞不致病变的病毒。24个病毒分离物的基因组核酸电泳显示相同的12节段双链RNA（double stranded ENA,dsENA）带型。以随机六聚体g1物pd（N）6反转录制备病毒基因组cDNA,采用辽宁病毒（liaoning virus,LNV）第j25因片段特异性引物进行POE扩增,PCE产物进行核酸序列测定,序列BLAST比对显示与GenBank中已知LNV第12基因片段核酸序列同源性超过85％,证实24个病毒分离物均为LNV。核酸序列系统进化分析显示与LNV-NE9712进化关系更接近。     

HIV-1假病毒的研究进展

假病毒是一种病毒的核酸由另一种病毒编码的包膜蛋白所包被,从而形成的具有外源性病毒囊膜,而基因组保持着逆转录病毒本身基因组特征的病毒.假病毒因其丧失了病毒的自我复制能力及其安全系数高等优点,已经被广泛应用于包括人类免疫缺陷病毒(HIV)在内的多项研究中.HIV假病毒通过识别膜蛋白基因的功能有助于研究病毒侵入过程、病毒调节基因功能以及评估中和抗体效价.     

应用逆转录聚合酶链反应鉴定脊髓灰质炎病毒

应用逆转录聚合酶链反应鉴定脊髓灰质炎病毒孔健，徐爱强，董春明，刘萍，迮文远为了排除急性驰缓性麻痹（ＡＦＰ）病例中的非脊髓灰质炎病例，提高诊断脊髓灰质炎病例的正确性和及时性，我们（应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）鉴定脊髓灰质炎病毒（简称ＰＶ）的灵...     

从乙脑病毒感染的鼠脑纯化感染性核酸及其在无细胞体系转译的研究

乙脑病毒颗粒中的基因组为(+)RNA,其RNA本身具有感染性。研究乙脑病毒基因组RNA在无细胞体系的转译及某些抑制物(如干扰素)的作用机理等,需要制备感染性RNA。用通常的方法制备乙脑病毒感染性RNA,工作量大,步骤繁琐。本文介绍了一种从乙脑病毒感染的鼠脑纯化感染性核酸的简便方法,并测定了在无细胞体系的转译能力。从受乙脑病毒感染的鼠脑先提取总核酸,然后用甲基酯化牛血清白蛋白-硅藻土(MAK)柱进行层析。总核酸溶于0.1MNaCl的磷酸缓冲液(0.05M, pH6.8)中加到柱上,继而以递增NaCl浓度(0.4M     

铜银离子协同氯化消毒对脊灰病毒核酸的破坏作用

目的 探讨铜银离子协同氯化消毒对病毒核酸的破坏作用。方法 铜银离子协同氯化消毒（40μg.L^-1银离子,400μg.L^-1铜离子和0．3mg.L^-1游离氯）前后用逆转录PCR的方法检测协同消毒前后脊灰病毒的核酸,并用免疫印记法（DIBA）检测脊灰病毒的抗原性（蛋白质）;用核酸修复实验测定噬菌体f2的核酸修复率,并用血清方法检测噬菌体f2的抗原性。结果 RT－PCR检测显示铜银离子协同氯化消毒前脊髓灰质炎病毒I型（PVI）的特异条带为阳性,协同消毒后的为阴性;DIBA检测显示协同消毒前后的结果均为阳性,铜银离子协同氯化消毒灭活作用后,大肠杆菌噬菌体f2的核酸修复离随作用时间延长而降低;噬菌体的抗原性与正常无明显差别。结论 结果提示铜银离子协同氯化消毒灭活水中病毒的作用位点可能在病毒的核酸。     

浙江省某地区脊髓灰质炎病毒的分离与鑑定

近五十年来脊髓灰质炎在世界各国流行,国内若干地区亦有脊髓灰质炎流行的报告,为了配合脊髓灰质炎临床病例的诊断及了解脊髓灰质炎各型病毒的分布情况,以便进一步采取有效的预防措施,广泛的进行脊髓灰质炎病毒的分离与鑑定实有其需要。1963年6～9月间浙江某地区有脊髓灰质炎病例,我们收集84例麻痹型患者及某托儿所16例密切接触者并有发热及咽部红肿上感症状的粪便标本共100份与接触者粪便25份,应用人胚腎细胞培养作病毒分离,现将结果报告如下:     

纯化乙脑病毒基因组 RNA 的一种简便途径

动物病毒基因组的提取,一般以组织培养病毒悬液为材料,视病毒类别而分别经分级离心、浓缩、密度梯度离心或层析等法获得较纯的病毒,再以蛋白变性剂清除其结构蛋白。披膜病毒基因组的提纯亦然。考虑到乙脑病毒在受染鼠脑中的滴度一般比组织培养高数十倍,我们用琼脂糖凝胶平板电泳直接自受染鼠脑总核酸制备纯化乙型脑炎病毒基因组大小的RNA获得成功,并观察了该组分RNA于小麦胚无细胞体系的转译能力。材料与方法(一)毒株乙脑病毒京卫研1株(A_238～45代)。     

滨海响水两县随机监测外环境水中脊髓灰质炎病毒分析

对滨海响水两县随机监测 8个镇河水中脊髓灰质炎病毒的带毒情况 ,科学制订脊髓灰质炎防制对策措施。我们采用新建立的“细胞吸附浓集法” ,对河、塘、沟水中的脊髓灰质炎病毒进行检测。结果 :在监测的 40份平行水样中 ,脊髓灰质炎病毒阳性 10份 ,阳性率 2 5 .0 % ;非脊髓灰质炎病毒阳性 2 9份 ,阳性率 72 .5 % ,其中 ,混合脊髓灰质炎病毒阳性 10份 ,阳性率 2 5 .0 %。结论 :说明外环境水被脊髓灰质炎病毒和非脊髓灰质炎病毒的污染较重     

用核酸杂交技术检测抗病毒i-RNA制剂中病毒核酸的残留及其在免疫小鼠体内的动态变化

以生物素化dUTP标记CI(?)、株基因组Hind Ⅲ酶切Y片段为探针,用核酸杂交技术检测抗HCMV-iRNA制剂中巨细胞病毒核酸的残留,同时用HCMV免疫小鼠观察病毒核酸在小鼠体内的存留时间。结果,HCMV DNA在小鼠体内的存留时间有明显的个体差异,而与HCMV DNA有同源序列的RNA在免疫后7天被清除。在4批来自羊肝、脾组织的抗HCMV-iRNA 制剂中,有3批查出HCMV核酸。     

铜银离子协同游离氯灭活病毒的作用部位

目的：探讨铜银离子协同氯化消毒灭活病毒的作用位点．方法：用透射电子显微镜（ＴＥＭ）观察了协同消毒前后的病毒形态，并用逆转录ＰＣＲ的方法检测协同消毒前后病毒的核酸．结果：消毒前后ｆ２的外形没有变化，ｆ２对大肠杆菌的吸附力没有改变；协同消毒后脊髓灰质炎病毒Ｉ型（ＰＶＩ）为圆形颗粒，蛋白衣壳内结构被破坏；ＲＴ－ＰＣＲ检测显示协同消毒前ＰＶＩ的特异条带为阳性，协同消毒后的为阴性．结论：结果提示铜银离子协同氯化消毒灭活水中病毒的作用位点可能在病毒的核酸．     

诺瓦克病毒ORF1-ORF2序列核酸片段克隆的构建

目的 构建诺瓦克病毒核酸片段克隆.方法 选取诺瓦克病毒阳性标本,应用 RT-PCR方法 扩增目标片段,将其克隆到质粒,通过酶切、测序鉴定.结果 成功构建诺瓦克病毒核酸片段克隆.结论 成功地获得了可作为核酸检测阳性对照的诺瓦克病毒核酸片段克隆,为该病毒的分子生物学检测和进一步研究奠定了基础.     

急性病毒性心肌炎和心包炎活检组织病因学研究

目的：通过心肌心包活检组织病理学及分子生物学检测对病毒性心肌炎进行病因学研究。方法：对所选病例临床特点,活检组织病理以及应用逆转录巢式PCR偶联直接循环核酸测序与序列分析检测病毒结果进行总结。结果：急性心肌炎病理诊断符合率43．5％,心肌心包活检组织肠道病毒阳性率51．6％（16／31例）,其中柯萨奇B组1例,ECHO病毒1例,脊髓灰质炎病毒1例。结论：病毒性心肌炎和心包炎病毒感染以柯萨奇B组病毒为主,中重型病例急性炎症期心肌中多有病毒复制,病理损伤也较明显。     

寨卡病毒基因序列分析及核酸检测方法

目的 分析寨卡病毒基因组序列特征,建立寨卡病毒的核酸检测方法.方法 构建81种虫媒传播黄病毒和寨卡病毒的系统进化树,比较寨卡病毒与登革病毒4型、日本脑炎病毒的核酸和氨基酸序列差异,分析亚洲型和非洲型寨卡病毒基因变异位点,尤其是中国的4株输入性寨卡病毒基因序列.通过比较亚洲型和非洲型寨卡病毒全基因组核酸序列,设计一组寨卡病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针,并检测其敏感性与特异性.结果 81种虫媒传播黄病毒中,寨卡病毒与Spondweni、Kedougou病毒同源性最近.全基因组核酸序列比较结果显示寨卡病毒与登革病毒4型的同源性比日本脑炎病毒更近,而氨基酸序列比较结果显示寨卡病毒与日本脑炎病毒的同源性更近.与传统亚洲型寨卡病毒比较,广东GD01株有5个氨基酸突变位点,广东GDZ16001株有3个,浙江ZJ03株有6个,赣县VE Ganxian株有33个.所设计的PCR引物和探针对质粒标准品检测呈阳性,检测下限为100拷贝/mL,对细胞培养的寨卡病毒RNA检测呈阳性,而对登革病毒1～4型和日本脑炎病毒检测呈阴性.结论 寨卡病毒与Spondweni病毒同源性最近,赣县VE Ganxian株的高变异显示寨卡病毒正在快速变异.本研究设计的PCR引物和探针可用于亚洲型和非洲型寨卡病毒株检测,具有较高的敏感性和特异性.     

RD、Hep-2、L20B细胞用于脊髓灰质炎病毒学监测的实验研究

目的：观察RD、Hep—2和L20B用于脊髓灰质炎病毒学常规监测的实验结果，提高脊髓灰质炎病毒的检出率。方法：对RD、Hep—2和L20B用于脊髓灰质炎病毒监测进行了实验研究。用细胞培养法进行病毒分离。结果：L20B细胞对脊髓灰质炎病毒具有较强的敏感性和特异性，但非脊髓灰质炎肠道病毒(NPEV)在RD细胞上呈选择性增值，可能会造成NPEV检出率下降。结论：RD、HeP—2和L20B细胞可用于脊髓灰质炎病毒学常规监测。