HL-60细胞凋亡小体体外负载树突状细胞的实验研究

目的 :证实树突状细胞 (Dendritic cells,DCs)可通过吞噬凋亡小体获取抗原物质 ,探讨其在肿瘤免疫治疗中的意义。方法 :利用吸附单克隆抗体 -磁珠分离系统 (MACS) ,从人脐血中分离出 CD34+ 细胞 ,体外以重组 h GM- CSF+ h SCF+ h TNF-α+ h FL诱导培养 DCs,光镜观察诱生细胞的形态 ,流式细胞术 (FACS)检测其表型。电镜观察和流式细胞仪检测三氧化二砷 (As2 O3 )诱导凋亡的 HL - 6 0细胞 ,将凋亡的 HL- 6 0细胞与培养早期的 DCs共育 4～ 8h,电镜观察 DCs吞噬凋亡小体的现象。结果 :CD34+细胞经诱生后生成了大量具有典型形态和表型的成熟 DCs;电镜下见凋亡的 HL- 6 0细胞内凋亡小体形成 ,流式细胞仪检测 DNA含量 ,见亚二倍体峰形成。凋亡细胞与 DCs共育后 ,电镜下见 DCs吞噬凋亡小体的现象。结论 :DCs可通过吞噬凋亡小体摄取抗原物质。     

rAAV2载体介导G卯基因转染树突状细胞

目的：在诱导人骨髓CD34^＋细胞分化成树突状细胞（dendritic cells，DCs）的基础上，探讨2型重组腺相关病毒（Type 2 recombinant adeno-associated virus，rAAV2）载体介导绿色荧光蛋白（green fluo-rescent protein，GFP）基因转染DCs的条件。方法：采用免疫磁珠法分离纯化人骨髓来源的CD34^＋细胞。在含有IL-4和GM-CSF的培养体系中体外诱导CD34^＋细胞生成DCs，于第5天加入TNF-α诱导DCs成熟，在不同时间用rAAV2载体介导GFP基因转染未成熟和成熟的DCs。通过电子显微镜和流式细胞仪鉴定树突状细胞，荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达。结果：人骨髓CD34^＋细胞经诱导分化后，在光镜及透射电镜下均可观察到DCs的形态特征，流式细胞仪检测到DCs表型；荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞培养第3天、第5天和加入TNF-α后的rAAV2-GFP转染率分别为0．45％，13．54％和0．25％。结论：本实验中所采用的培养体系可成功将人骨髓CD34^＋细胞诱导分化成DCs，rAAV2／GFP转染DCs效率随细胞诱导分化时间的延长而增高，且转染未成熟DCs的效率高于转染成熟DCs。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓中不同细胞诱生树突状细胞的体外研究

目的:体外诱导慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)、CD34+细胞、单核细胞为树突状细胞(DCs),并对其形态、表型及其刺激T细胞增殖作用进行比较。方法:利用GM-CSF、IL-4、TNF-α体外定向诱导生成树突状细胞,利用流式细胞仪对所诱生的细胞进行细胞形态及表型检测,用D-FISH方法检测所诱生DCs的白血病源性。并应用MTT法检测所诱生的DCs刺激T细胞增殖的能力。结果:CML患者BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞体外均可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DCs,前者DCs产量明显高于后二者,但均具有刺激自体及异体T细胞增殖的能力,且三者无显著性差异。结论:来源于CML患者骨髓的BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞均可诱生成CMLDCs,对T细胞均具有刺激增殖能力,但BMMNCs所诱生的DC主要来源于未成熟的中性粒细胞。     

慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞诱生树突细胞的体外研究

目的 :体外诱生慢性粒细胞白血病 ( CML)患者外周血单个核细胞 ( PBMNCs)为树突细胞( DCs)。方法 :CML患者 PBMNCs在含 GM- CSF、IL- 4、TNF- α的培养液中培养 1 4d,倒置显微镜、电镜下观察细胞形态 ,流式细胞仪检测细胞的表面标志 ,免疫磁珠 ( MACS)富集所诱生的 DCs,用D- FISH、RT- PCR方法检测 DCs的白血病源性。利用 MTT法检测所诱生 DCs刺激 T细胞增殖能力。结果 :所诱生的细胞高表达 CD80 、CD86、CD1a、HLA- DR,电镜下细胞表面有丰富突起 ,细胞浆内有丰富线粒体 ,D- FISH、RT- PCR检测所诱生的 DCs具有 bcr/abl融合基因。CML DCs具有刺激 T细胞增殖能力。结论 :体外利用 CML患者 PBMNCs成功诱导生成了来源于 CML细胞的 DCs( CML DCs)。     

脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞体外培养体系的优化

目的：优化脐血CD34^＋造血干细胞（HPC）来源的树突状细胞（DCs）诱导培养方法，为体外研究CD34^＋HPC诱导产生功能性树突状细胞（DCs）的影响因素奠定基础。方法：淋巴细胞分离液（Ficoll）分离获得脐血单个核细胞，免疫磁珠阳性分选CD34^＋HPC，并用流式细胞术鉴定CD34^＋HPC纯度：比较GT（GM-CSF＋TNF—α）方案和GTI（GM—CSF＋TNF—α＋IL-4）方案及GTI方案中TNF—α．和IL-4不同时段加入对诱导培养产生的DCs成熟的影响：通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析细胞表型及3H—TdR检测DCs激发异体T细胞增殖能力。结果：免疫磁珠阳性分选CD34＋HPC纯度可达90％以上：将CD34＋HPC按GT方案和GTI方案进行培养，均可诱导产生DCs．但经GT方案诱导的DCsCD14表达较高，CD80、CD86、CD83、CD1a表达不如经GTI方案诱导的高；而GTI方案中，以TNF—α．0h加入、IL-448h加入诱导培养的DCs各表型表达相对较佳．并具有激发异体T细胞增殖能力。结论：CD34^＋HPC经过合适的培养体系能够诱导分化为功能性DCs，以GM—CSF与TNF-α 0h加入、IL-448h加入的GM—CSF＋TNF—α＋IL-4方案更为可取。     

紫杉醇诱导HeLa细胞凋亡的研究

目的：探讨紫杉醇抑制ＨｅＬａ细胞生长的机制。方法；经荧光染色，电镜观察细胞形态，ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ及流式细胞仪检测凋亡细胞。结果：紫杉醇作用２４ｈ经荧光染色细胞呈不均一亮蓝色，作用４８ｈ细胞被染色红色，电镜观察可见细胞变小，染色质浓缩并产生凋亡小体，ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ未见明显的梯形条带，流式细胞仪检测紫杉醇作用２４ｈ细胞凋亡。结论；紫杉醇可诱导细胞凋亡，也可直接杀伤ＨｅＬａ细胞，而且以后者为主     

A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞的研究

目的 探讨用钙离子载体A23187通过钙动员机制使人急性粒细胞性白血病细胞系HL-60细胞迅速分化为树突状细胞(DCs)的方法,为今后临床用DCs进行抗白血病免疫治疗打下基础.方法 将生长良好的HL-60细胞加入不同浓度A23187(45～720 ng/mL)或联用重组人γ-干扰素(rhIFN-γ,1000 U/mL)培养20～96 h,倒置显微镜和扫描电镜观察其形态学特征,流式细胞术检测其免疫表型,混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果 HL-60细胞加入适量A23187(180 ng/mL)或联合rhIFN-γ(1000 U/mL)诱导20 h后,即可出现细胞表面树状突起,且树突状细胞表面特异性成熟标志抗原CD83、共刺激分子CD80、CD86表达升高;培养48 h,CD83分子表达开始降低;培养72 h,可获得DC的典型形态,CD80、CD86分子表达持续升高.同种异体混合淋巴细胞反应检测经A23187或联用rhIFN-γ诱生的DCs可明显刺激同种异体T淋巴细胞增殖.结论 钙离子载体可诱导HL-60细胞分化为高表达共刺激分子及具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的成熟DCs,钙动员有望成为一种快速获取DCs的有效方法.     

补骨脂素加长波紫外线对HL-60细胞凋亡的影响

目的：探讨补骨脂素（psoralen,PSO）加长波紫外线（ultraviolet-A,UVA）的光化学疗法（PUVA）对人急性髓细胞白血病（FAB-M2）细胞株HL-60细胞凋亡的作用及部分作用途径。方法：以HL-60细胞株为研究对象,以0、10、20、40、80μg/ml PSO加波长为360nm的UVA,作用于HL-60细胞,通过流式细胞仪检测HL-60细胞在PUVA后的凋亡情况;电镜下观察细胞超微结构改变;荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）及流式细胞技术检测Fas配体（Fasligand,FasL）在基因和蛋白水平的表达情况。结果：单纯PSO、单纯UVA照射及PUVA均可诱导HL-60细胞发生凋亡,PUVA的作用显著强于前两者。电镜下观察经PUVA处理后的HL-60细胞超微结构,可见明显的凋亡形态学改变。PSO、UVA照射及PUVA均可下调FasL在基因、蛋白水平的表达,PUVA的作用显著强于前两者。结论：PUVA可诱导白血病细胞HL-60发生凋亡,作用强于PSO及UVA照射。HL-60被PUVA诱导凋亡后FasL基因表达水平下调。     

树突状细胞对肿瘤特异性CTL体外激发、扩增及功能的作用研究

目的:研究凋亡肿瘤细胞负载的DCs联合细胞因子对T细胞体外激发、扩增及功能的诱导作用。方法:人B淋巴瘤细胞株Raji经顺铂(DDP)诱导凋亡，体外共育法负载DCS，DCs和T细胞体外共培养观察DC5对T细胞的效应，采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析T细胞表型：ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-10的含量；溶血实验检测细胞毒性T细胞(CTL)产生穿孔素的能力；体外肿瘤杀伤实验分析CTL的特异性肿瘤杀伤作用。结果：凋亡肿瘤细胞负载联合CD40激发的DCs能有效地激发自体T细胞的体外扩增并诱导具有较特异杀伤肿瘤细胞作用的CTL。结论：凋亡肿瘤细胞负载的DCS在CD40信号的作用下对自体T细胞具有较强的激发和扩增效应．所获得的CTL对肿瘤细胞具有较特异的杀伤作用。     

低剂量照射对树突状细胞表型及功能的影响

目的研究低剂量照射对未成熟树突状细胞（DCs）大肠癌抗原吞噬能力、未成熟DC表型及体外刺激T细胞能力的影响。方法取健康人外周血,密度梯度离心获取单个核细胞。铺板贴壁法分离淋巴细胞,贴壁细胞在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和白细胞介素4（rhIL-4）的作用下体外诱导5d后收获,并分别以0.1、0.2、0.5和1.0Gy的X射线照射24h。检测照射后未成熟DCs的表型、抗原吞噬能力及负载大肠癌肿瘤抗原信息的DCs在体外刺激T细胞的能力。结果流式细胞仪检测结果显示,0.2Gy照射组成熟DCs的CD40、CD80、CD83、CD86表型及抗原吞噬能力均明显高于对照组（未照射）及其他照射组（均P〈0.05）;体外刺激T细胞的能力随照射剂量的增加而减弱。结论低剂量照射能促进DCs抗原的吞噬能力和成熟,但会减弱体外刺激T细胞的能力。     

卵巢癌细胞诱导的CD8+T细胞凋亡与Caspase-3活性及细胞内钙的关系

目的 探讨卵巢癌细胞诱导CD8^＋T细胞发生凋亡，及Caspase-3与细胞内游离钙离子在CD8^＋T细胞凋亡过程中的作用。方法分别采用透射电镜、流式细胞术观察3株卵巢癌细胞（OVCAR3、CAOV3和SKOV3）的培养上清液诱导的CD8^＋T细胞凋亡和细胞周期变化；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法和比色法检测CD8^＋T细胞Caspase-3mRNA的表达和Caspase-3活性；Fura-2荧光负荷技术检测细胞内游离钙离子浓度（[Ca^2＋]i）。结果 经3株卵巢癌细胞的培养上清液分别作用后，CD8^＋T细胞被阻滞在G1／G0期，电镜下出现典型的凋亡改变，流式细胞仪检测见凋亡峰，细胞凋亡率增高；CD8^＋T细胞凋亡过程中Caspase-3mRNA的表达水平、Caspase-3的活性和[Ca^2＋]，均明显升高。结论 卵巢癌细胞能诱导CD8^＋T细胞凋亡，CasDase-3激活及细胞内钙超载在此过程中起雷要作用。     

rAAV2载体介导GFP基因转染树突状细胞

目的:在诱导人骨髓CD34 细胞分化成树突状细胞(dendritic cells,DCs)的基础上,探讨2型重组腺相关病毒(Type 2 recombinant adeno-associated virus,rAAV2)载体介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因转染DCs的条件.方法:采用免疫磁珠法分离纯化人骨髓来源的CD34 细胞.在含有IL-4和GM-CSF的培养体系中体外诱导CD34 细胞生成DCs,于第5天加入TNF-α诱导DCs成熟,在不同时间用rAAV2载体介导GFP基因转染未成熟和成熟的DCs.通过电子显微镜和流式细胞仪鉴定树突状细胞,荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达.结果:人骨髓CD34 细胞经诱导分化后,在光镜及透射电镜下均可观察到DCs的形态特征,流式细胞仪检测到DCs表型;荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞培养第3天、第5天和加入TNF-α后的rAAV2-GFP转染率分别为0.45%,13.54%和0.25%.结论:本实验中所采用的培养体系可成功将人骨髓CD34 细胞诱导分化成DCs,rAAV2/GFP转染DCs效率随细胞诱导分化时间的延长而增高,且转染未成熟DCs的效率高于转染成熟DCs.     

姜黄素对人实体瘤细胞和白血病细胞作用的比较

目的探讨姜黄素对人急性髓系白血病HL-60细胞及肝癌细胞(QGY)增殖、细胞周期的调控及细胞凋亡的影响,并比较它对HL-60、QGY的作用效果.方法采用MTT法测定姜黄素在不同浓度、不同时间对HL-60、QGY的抑制作用,流式细胞仪分析细胞周期分布,透射电镜观察细胞的超微结构变化.结果姜黄素可抑制HL-60、QGY细胞的生长,其抑瘤率与药物浓度和作用时间呈依赖关系,72 h的中效浓度(IC50)分别为24.8μmol/L、49.5μmol/L;流式细胞仪分析证实姜黄素能使HL-60细胞聚积在S期、G2/M期,凋亡峰为8.65%,使QGY细胞聚积在S期,凋亡峰为10.84%;电镜观察发现姜黄素可导致HL-60细胞胞浆内有明显脂肪变性,导致QGY细胞变性、坏死,诱导细胞凋亡.结论姜黄素对HL-60的抑瘤效果更明显,它主要通过抗增殖作用,抑制HL-60细胞的生长;对QGY细胞,主要通过诱导肿瘤细胞凋亡,达到抑瘤作用.     

穿山甲煎液诱导HL—60细胞凋亡的研究

目的：探讨中药穿山甲对急性髓细胞性白血病细胞株HL-60的作用。方法：以人白血病细胞株HL-60为研究对象。采用形态学观察。流式细胞仪、Caspase-3酶活性测定、免疫组化等方法。结果：穿山甲浓度在2.5-10mg/ml范围内可抑制HL-60细胞生长,并诱导其发生凋亡;并激活Caspase-3酶活性。下降bcl-2基因表达。结论：穿山甲对HL-60细胞有诱导凋亡作用。     

双氢青蒿素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡

目的：探讨双氢青蒿素诱导人急性髓系白血病HL-60细胞的凋亡作用和机制。方法：用二甲氧唑黄（XTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测双氢青蒿素对HL-60细胞生长的抑制作用,AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞内线粒体膜电位变化,分光光度法检测细胞Caspase3活性变化。结果：双氢青蒿素对HL-60细胞生长有抑制作用,呈剂量依赖性,并能诱导HL-60细胞凋亡,使线粒体膜去极化,增强Caspase3活性。结论：双氢青蒿素能抑制人急性髓系白血病HL-60细胞生长,并诱导细胞凋亡,可能和线粒体凋亡通路有关。     

CD154反义RNA诱导Jurkat细胞的凋亡

目的 探讨CD154反义RNA诱导Jurkat细胞凋亡的作用。方法 应用RT－PCR扩增人CD154膜外段基因，以及T－A克隆技术和亚克隆技术构建CD154反义RNA的真核表达载体，并将其转染入Jurkat细胞中。应用电镜及流式细胞仪（FCM）检测观察Jurkat细胞的凋亡指标。结果 电镜观察CD154反义RNA转染的Jurkat细胞内可见凋亡小体，并且FCM检测显示一明显的凋亡峰。结论 CD154反义RNA可诱导Jurkat细胞凋亡。     

人脐血CD34+细胞和贴壁细胞体外诱导树突状细胞及其鉴定

目的 从人脐血中不同的前体细胞扩增树突状细胞(DCs)，并对其进行鉴定。方法 用免疫磁珠法分离人脐血CD34^ 细胞，以GM—CSF、TNF-α、FL、SCF和IL-4诱导生成DC；用Ficoll分离脐血单个核细胞，2h贴壁后的细胞，以GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导生成DC。观察细胞形态，流式细胞仪分析表面标志(CDla、CD80、HLA-DR)，并检测其刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果 人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞体外诱导生成的细胞均具有典型的DC形态特征，表达高水平的DC分化抗原CDla，MHCⅡ类抗原递呈分子HLA—DR和CD80共刺激分子，并具有刺激同种异体T细胞增殖的能力。前者扩增DC的效率更高。结论 从人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞均可诱生出功能性DC，是DC理想的组织来源。     

水溶性壳寡糖对人白血病细胞诱导分化的影响

目的:研究水溶性壳寡糖(WSC)抑制人白血病细胞(HL-60)增殖活性的作用。方法:将WSC与HL-60细胞共培养,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测WSC对HL-60细胞增殖的抑制作用;氮蓝四唑(NBT)法检测WSC对HL-60细胞分化促进作用;流式细胞仪定量检测细胞凋亡。结果:250～1000mg/L的WSC能抑制HL-60细胞增殖,并促进HL-60细胞分化,WSC作用48h后流式细胞仪分析图上出现凋亡峰。结论:WSC对诱导人白血病HL-60细胞凋亡及促进分化有一定作用     

当归多糖促进慢性粒细胞白血病细胞性树突状细胞的诱导生成

目的 探讨当归多糖(APS)对慢性粒细胞白血病细胞诱导生成树突状细胞(DCs)的影响。方法 取慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞，分别予粒-巨噬集落刺激因子(GM—CSF)／白介素-4(IL-4)培养或GM-CSF／IL-4联合各浓度APS(50，100，200mg／L)培养，普通光镜和电镜观察细胞形态，台盼蓝拒染法检测细胞成活率，流式细胞仪检测DCs的免疫表型(CD80，CD86，CD83)，自体或异体混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力。结果GM-GSF/TL-4或GM-CSF，IL-4／APS诱导培养的慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞均表现出典型的树突状形态而且表达高水平的免疫表型。GM-CSF／IL-4／APS培养的DCs的细胞成活率和增殖能力显著提高，CD83，CD80，CD86表达显著升高，APS组慢性粒细胞白血病细胞诱导的树突状细胞(CML-DCs)刺激T淋巴细胞的增殖能力更强。结论 GM-CSF/IL-4/APS培养的DCs的CD83，CD80、CD86表达率明显高于GM-CSF／IL-4组。GM-CSF／IL-4／APS诱生的CML-DCs刺激T淋巴细胞增殖能力强于GM-CSF／IL-4组。APS能促进IL-4和GM-CSF对CML-DCs的诱生与成熟。     

维生素K2对HL-60细胞生长及凋亡、分化的诱导作用

目的：观察维生素K2(VK2)对HL-60细胞生长及凋亡、分化的诱导作用。方法：通过四氮唑蓝比色,细胞形态,流式细胞仪测定细胞周期、凋亡率及CD14的表达,观察VK2对HL-60细胞的影响。结果：HL-60细胞经10／μmol/L以上浓度的VK2作用后增殖受到抑制,10μmol/L、20μmol/L VK2作用72h后,细胞形态呈现凋亡细胞的特征。5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L VK2作用于HL-60细胞72h凋亡率分别为7．16％、11．31％、20．36％,与对照组相比差异显著。G0/G1期细胞阻滞,CD14的表达与对照组相比无差异性。结论：VK2对HL-60细胞有生长抑制作用,能诱导HL-60细胞发生凋亡,具有一定的量效和时效关系,单独使用VK2的分化作用不显著。