PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究

目的：利用聚合酶链反应（PCR）技术对Wilson病（WD）基因进行体外定点突变的研究。方法：采用PCR定点突变技术，首先设计两对引物，将突变位点设计在引物上，通过重叠延伸法两次PCR扩增，扩增片段上含有所需要的突变位点，最后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中。结果：DNA测序表明在预期位点已经发生突变，WD基因第778位密码子由精氨酸（Arg)残基突变为亮氨酸残基（Leu),用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体。结论：PCR技术诱导定点突变准确，高效。Wilson病基因突变体的构建成功，为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究

【目的】利用聚合酶链反应 (PCR)技术对Wilson病 (WD)基因进行体外定点突变的研究。【方法】采用PCR定点突变技术 ,首先设计两对引物 ,将突变位点设计在引物上 ,通过重叠延伸法两次PCR扩增 ,扩增片段上含有所需要的突变位点 ,最后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中。【结果】DNA测序表明在预期位点已经发生突变 ,WD基因第 778位密码子由精氨酸 (Arg)残基突变为亮氨酸残基 (Leu) ,用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体。【结论】PCR技术诱导定点突变准确、高效。Wilson病基因突变体的构建成功 ,为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

中国人Brugada综合征SCN5A基因突变K317N的定点诱变及其载体构建

目的对我们发现的中国人Brugada综合征新的SCN5A基因突变K317N进行体外定点诱变研究,并构建携带有基因突变K317N的pRc/CMV-hH1的表达载体。方法采用PCR定点突变技术,根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点AgeI/Sse8387I设计一对定点诱变引物,将突变位点设计在引物上,通过PCR扩增,使扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pRc/CMV-hH1载体中。结果DNA测序表明,在预期位点巳经发生突变,SCN5A基因在第317密码子由赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N),成功实现定点诱变。结论PCR技术诱导定点突变,准确、高效。pRc/CMV-hH1(K317N)的成功构建,为进一步进行该突变的结构与功能研究奠定了基础。     

中国人Brugada综合征SCN5A基因突变K317N的定点诱变及其载体构建

目的 对我们发现的中国人Brugada综合征新的SCN5A基因突变K317N进行体外定点诱变研究，并构建携带有基因突变K317N的pRc／CMV-hH1的表达载体。方法 采用PCR定点突变技术，根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点AgeI／Sse83871设计一对定点诱变引物，将突变位点设计在引物上，通过PCR扩增，使扩增片段上含有所需要的突变位点，最后将扩增片段克隆人pRc／CMV-hH1载体中。结果 DNA测序表明，在预期位点巳经发生突变，SCN5A基因在第317密码子由赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，成功实现定点诱变。结论 PCR技术诱导定点突变，准确、高效。pRc／CMV-hH1(K31714)的成功构建，为进一步进行该突变的结构与功能研究奠定了基础。     

p53基因突变子175 H、248 W和273 H的定点突变及表达载体的构建

目的：定点诱变合成p53基因突变子进而构建表达载体。 方法：以野生型p53基因为模板,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,将突变位点设 计在引物上,通过重叠延伸法2次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩 增片段克隆入pcDNA3.1载体中。 结果：在预期位点已经发生突变,p53基因第175位密码子由精氨酸（cgc）突变为组氨酸（cac）,第248位密码子由精氨酸（cgg）突变为色氨酸（tgg）,第273位密码子由精氨酸（cgt）突变为组氨酸（cat）。p53基因突变子表达载体成功构建。 结论：PCR技术诱导定点突变准确、高效。基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位 点奠定了基础。     

利用PCR技术构建GM-CSF/Fc_(γ2)~-融合蛋白真核表达载体

目的　对融合基因GM -CSF Fcγ2 进行定点突变 ,去除其补体结合位点 ,构建GM -CSF Fcγ2-融合蛋白真核表达载体。方法　通过设计突变引物 ,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM -CSF Fcγ2-。并通过T -A克隆策略 ,把突变后的融合基因GM -CSF Fcγ2-重组到真核表达载体pRc CMV2中 ,构建真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-并经过酶切和测序确证。结果　成功对融合基因GM -CSF Fcγ2-进行了突变 ,构建了真核表达载体pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-。结论　利用该PCR方法进行基因定点突变可行     

重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

目的 基于重叠延伸PCR（SOE PCR）技术构建转录因子EB（TFEB）丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。 方法 根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_n和R_n进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌（E.coli）中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。 结果 第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸（TCT）成功突变为丙氨酸（GCT）。在0.5?mmol·L^－1 IPTG、16?℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。 结论 利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。     

利用PCR技术构建GM-CSF/Fcγ2-融合蛋白真核表达载体

目的对融合基因GM-CSF/Fcγ2进行定点突变,去除其补体结合位点,构建GM-CSF/Fcγ2-融合蛋白真核表达载体.方法通过设计突变引物,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM-CSF/Fcγ2-.并通过T-A克隆策略,把突变后的融合基因GM-CSF/Fcγ2-重组到真核表达载体pRc/CMV2中,构建真核表达质粒pRc/CMV2/GM-CSF/Fcγ2-并经过酶切和测序确证.结果成功对融合基因GM-CSF/Fcγ2-进行了突变,构建了真核表达载体pRc/CMV.2/GM-CSF/Fcγ2-.结论利用该PCR方法进行基因定点突变可行.     

利用PCR技术构建GM—CSF／Feγ2^—融合蛋白真核表达载体

目的 对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行定点突变,去除其补体结合位点,构建GM－CSF／Feγ2^-融合蛋白真核表达载体。方法 通过设计突变引物,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM－CSF／Feγ2^-。并通过T－A克隆策略,把突变后的融合基因GM－CSF／Feγ2^-重组到真核表达载体pRc/CMV2中,构建真核表达质粒pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-并经过酶切和测序确证。结果 成功对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行突变,构建了真核表达载体pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-。结论 利用该PCR方法进行基因定点突变可行。     

人肝刺激因子对实验性急性肝损伤的保护作用及其机制的研究

从健康孕妇水囊引产4～6月龄的胎儿取肝,按 LaBrecque 法提取人肝刺激因子(hHSS)。将 hHSS 注入切除34%肝的 SD 大鼠腹腔,用~3H—胸腺嘧啶掺入肝 DNA 法,证实所提取 hHSS 具有生物学活性。用半乳糖胺(D—Gal)给昆明种小鼠造成急性肝损害。观察 hHSS 对这种急性肝损伤动物的保护作用及其机制。结果如下:(1)hHSS 明显降低 D—Gal 中毒小鼠的死亡率。(2)hHSS 显著降低 D—Gal 引起的血清 CPT 和 GOT 升高的幅度。(3)预先给 hHSS,则 D—Gal 引起的肝组织形态变化均减弱或不出现。(4)电子显微镜检查,hHSS 处理后由 D—Gal 引起的一些细胞器的变化均减轻或不出现。(5)hHSS 明显降低 D—Gal 所引起肝组织丙二醛的含量,说明 hHSS 有抗脂质过氧化作用。(6)hHSS 能保证膜流动性正常和脆性正常。根据上述实验资料,肯定了人肝刺激因子的存在,hHSS 具有保肝作用,其保肝机制为 hHSS 可抗膜脂质过氧化,保护肝细胞质膜、线粒体膜和微粒体膜的流动性和正常脆性。人胎肝产生 hHSS,hHSS 又可以保护肝细胞,这一肝细胞自我保护物质及其机制的阐明,对肝炎的防治可能具有应用价值。     

人胎肝刺激因子对大鼠实验性肝纤维化影响的研究

本工作从健康孕妇水囊引产４～６个月龄的胎儿取肝，采用ＬａＢｒｅｃｑｕｅ方法提取肝刺激因子，称人肝刺激因子（ｈｕｍａｎＨｅｐａｔｉｃＳｔｉｍｕｌａｔｏｒＳｕｂｓｔａｎｃｅ，ｈＨＳＳ）。将ｈＨＳＳ注入肝部分切除之大白鼠体内，用３Ｈ－胸腺嘧啶核苷掺入肝ＤＮＡ法测定其生物活性。结果表明，我们提取的ｈＨＳＳ刺激肝细胞ＤＮＡ合成较对照组增加６倍。采用皮下注射６０％ＣＣｌ４豆油溶液和饮用低浓度的乙醇制备慢性肝损伤动物模型，以观察ｋＨＳＳ对大鼠实验性慢性肝纤维化的影响。实验结果表明，（１）ｈＨＳＳ可以明显降低ＣＣｌ４－乙醇所致慢性肝损伤时肝组织羟脯氨酸含量的升高，在实验第２８、４２天差异具显著性（Ｐ＜０．０５，０．０１）。（２）病理组织学观察表明，ｈＨＳＳ可以明显降低ＣＣｌ４－乙致慢性肝损伤时肝组织纤维化的程度。在实验的第４２天差异具显著性（Ｐ＜０．０１）。本工作结果提示，肝再生刺激因子可能是一种有希望应用于临床治疗慢性肝病的生物制剂。     

人肝刺激因子的提取及其保肝作用的初步观察

采用水囊引产眙儿(胎龄4～6个月),提取肝刺激因子(hHSS),用~3H—胸腺嘧啶核苷测其活性,观察到 hHSS 可使34%肝切除的大鼠对~3H—胸腺嘧啶核苷掺入再生肝 DNA 率明显增加。将 hHSS 预先注入半乳糖胺损伤的小鼠体内,结果观察到:hHSS 极明显地降低半乳糖胺中毒的死亡率(P<0.01),明显地抑制半乳糖胺所致的血清 GPT 和 GOT 的高水平。电镜检查表明,hHSS 可保护肝细胞的超微结构(线拉体、内质网等)免受半乳糖胺的损伤。这些结果证明,从人胎肝中可提取 hHSS,而 hHSS 具有保护肝脏免受肝毒剂—半乳糖胺的毒害作用。     

重组人肝刺激因子非融合性蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的构建人肝刺激因子(human hepatic stimulator substance,hHSS)体外表达体系。方法hHSS基因片段经PstⅠ和NdeⅠ消化后,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pT7-7载体,通过限制性酶切图谱分析及DNA测序反应鉴定hHSS基因。再将pT7-7-hHSS表达载体转化到BL21(DE3)中表达,通过超滤膜及阴离子交换柱纯化,获得目的蛋白。结果表达产物在15 000处有一明显条带,蛋白质肽指纹图谱分析与预期结果相符,经Western blot杂交印证,该15 000蛋白质为hHSS。结论通过构建pT7-7-hHSS原核表达体系,能正确高效地表达hHSS。     

人胎肝细胞生长刺激物质与酪氨酸蛋白激酶的关系

利用从人胎肝提取的肝细胞生长刺激物质（ｈＨｓｓ），以小鼠肝细胞质膜蛋白作为受体及内源性底物，以Ｐｏｌｙ（ＧｌｕＮａ，Ｔｙｒ）４：１作为外源性底物，通过磷酸化实验，对ｈＨＳＳ的作用及其与酪氨酸蛋白激酶活性之间的关系进行了研究。利用抗酪氨酸磷酸酯抗体免疫沉淀法，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显形及液体闪烁计数等方法进行测定。结果证明：ｈＨＳＳ可刺激并增强肝细胞膜受体的酪氨酸蛋白激酶的活性，后者可使膜蛋白某些组分及外源性底物磷酸化增强；ｈＨＳＳ的作用与酪氨酸蛋白激酶的活性密切相关。     

人胎肝刺激因子对肝毒剂致小鼠亚细胞器的功能变化的影响

人胎肝刺激因子具有明显的保肝作用。本文采用Ｄ－半乳糖胺及ＣＣｌ４损伤小鼠肝脏，进一步观察人胎肝刺激因子（ｈＨＳＳ）对肝损伤引起的微粒体Ｃａ２＋－ＡＴＰ酶和混和功能氧化酶（Ｐ４５０）活性的保护作用，结果发现，肝损伤后，两种酶活性均明显降低，而预先经ｈＨＳＳ处理后，上述两种酶活性均有不同程度的恢复或增加。结果表明，ｈＨＳＳ的保肝作用，可能与保护肝细胞的钙稳定及加强肝细胞代谢酶活性有关。     

Hepatic stimulator substance from human fetal liver for treatment of experimental hepatic failure.

The authors previously reported the successful reversal of lethal D-Gal induced hepatic necrosis in rats by human hepatic stimulator substance (hHSS), a liver specific growth factor partially purified from human fetal liver cells, which promoted hepatocyte proliferation. In this study, they further investigated the mechanism of hHSS in improving survival of experimental acute hepatic failure. Our results demonstrated that the level of alanine transaminase and endotoxin in the plasma and lipid peroxides in the liver of chemically poisoned rats were reduced by hHSS to different extent at different periods of observation compared with the saline control group. The apparent recovery of liver function and the increase of 3H-TdR incorporation into hepatic DNA correlated with the morphologic changes observed under light and electron microscopes, showing that the damages inflicted on the cellular and subcellular structure in the liver of hHSS-treated rats were greatly alleviated and rapidly repaired. Therefore, hHSS, which can prevent liver deterioration and promote hepatocyte regeneration, may be a new hepatic stimulator factor readily available for clinical use.

     

人胎肝细胞生长刺激物质的分离纯化及活性测定

从人胎肝组织纯化肝细胞生长刺激物质（ｈＨＳＳ），经过匀浆、热处理、乙醇沉淀、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０离子交换层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５凝胶过滤，聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳及ＩＳＣＯＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ转移浓缩电泳等步骤，分离出具有ＨＳＳ活性的蛋白质。经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳显示５３ＫＤ与１８ＫＤ两条带。     

重组CHO细胞中不同启动子对含MAR表达载体转基因表达的影响

目的 分析在重组CHO细胞中不同启动子对含核基质结合区(MAR)表达载体转基因表达的影响.方法 PCR扩增CMV启动子及β-珠蛋白MAR,构建含β-珠蛋白MAR表达载体pCAT1,随后将CMV启动子替代pCAT1上SV40启动子构建CMV启动子驱动的表达载体pCAT2.pCAT1、pCAT2不含MAR的对照载体同时转染CHO细胞,G418筛选稳定转化的细胞株,酶联免疫吸附试验(ELISA)分析氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的表达水平.结果 含MAR表达载体转染的细胞CAT酶表达量比不合MAR的pCATG和pCAT3载体转染的细胞高,分别提高2.14倍和1.25倍(P＜0.05);而由SV40启动子驱动含MAR表达载体pCAT1转染的细胞CAT酶表达水平明显比由CMV启动子驱动的pCAT2载体高3.26倍(P＜0.05).结论 在稳定重组CHO细胞中MAR能够提高转基因的表达水平,SV40启动子与MAR组合其启动效率优于CMV启动子与MAR组合.