重组质粒转染293细胞及表达

目的:探究通过脂质体转染技术介导重组质粒pSecTag2HygroC/CD13-1/RFP转染293细胞的方法。方法:采用Lipofectamine 2000方法将包含目的基因pSecTag2HygroC/CD13-1/RFP的质粒转染293细胞。在转染24 h后于荧光显微镜下观察红色荧光出现情况。收集并浓缩稳定转染后293细胞的上清液,提取细胞膜蛋白和胞浆蛋白,采用Western blot方式判断转染细胞是否表达目的蛋白。结果:①荧光显微镜下可观察到红色荧光蛋白(RFP)发出红色荧光。②Western blot鉴定结果:提取稳定转染的293细胞胞浆蛋白Western blot鉴定可见到大小为62 kD左右的条带。浓缩的上清蛋白与提取的胞膜蛋白West-ern blot鉴定未见到目的蛋白表达。结论:应用脂质体转染技术,成功介导目的基因pSecTag2HygroC/CD13-1/RFP转染到293细胞中,为进一步研究重组CD13单链抗体对血液肿瘤的靶向杀伤作用打下了实验基础。     

人脑胶质瘤特异抗原肽白介素-13 α 2受体重组表达质粒的构建

目的：构建白介素-13α2受体（IL-13Rα2）重组表达质粒,为检测IL-13Rα2抗原肽的表达奠定实验基础。方法：利用RT-PCR法从U251胶质瘤细胞株中获得IL-13Rα2目的基因,并与克隆质粒pMD19SimpleT载体连接转入DH5α菌克隆,用XhoI和HindIII将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒pET-28a连接,转入BL21（DE3）菌,提取重组质粒进行酶切及测序鉴定。结果：目的基因IL-13Rα2与表达质粒pET-28a连接,成功构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒。结论：IL-13Rα2目的基因能经RT-PCR法获得,并能成功与表达质粒连接,构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒,为今后检测IL-13Rα2抗原肽的表达以及利用其来免疫治疗胶质瘤提供了良好的实验基础及理论依据。     

大鼠Ngn2基因真核表达质粒的构建

目的：构建大鼠Neurogenin2（Ngn2）基因的真核表达质粒。方法：从大鼠海马组织提取海马总mRNA ,RT-PCR获得Ngn2基因cDNA,构建重组质粒pSecTag2／HygroB-Ngn2, XhoⅠ和HindⅢ双酶切、测序鉴定重组质粒。结果：RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pSecTag2／HygroB-Ngn2重组质粒构建成功。结论：成功构建了大鼠Ngn2基因的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步Ngn2基因对神经损伤修复作用的研究奠定基础。     

亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。 方法：以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序。以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号（NSL）加入PTEN序列。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒。真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定。结果：重组质粒PUM-PTEN酶切在1　200　bp处见目的片段,与预期结果符合。测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1　200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切在1　200 bp处见目的片段,与预期结果一致。测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列。结论：成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN。     

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

唾液富组蛋白5表达载体的构建

目的将唾液富组蛋白5cDNA克隆至表达载体pGEX-4T-1。方法EcoR I＋Sal I双酶切克隆载体pMD19-T-hrp5及pGEX-4T-1，回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX-4T-1，将二者连接后转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX-4T-1，无突变。结论重组载体pGEX-4T-1-hrp5构建成功。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

【目的】构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达，为开展对resistin的研究打下实验基础。【方法】酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA，RT-PCR法扩增出resistin基因cDNA，经测序后，PCR产物亚克隆入 T载体，用EcoR I和Kpn I分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS，然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接，用核酸内切酶EcoR I、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒。重组表达质粒转化大肠杆菌JM109，经1mmol／LIPTG在32℃诱导表达2h，裂解细菌，进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达。【结果】RT-PCR扩增产物分子大小为327bp，序列分析表明为人resistin基因完整编码区。PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后，从细菌质粒中酶切回收了目的片段。重组表达质粒经EcoR I和Kpn I双酶切后能产生出327bp、4980bp大小的两个片段，序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区，基因编码无移位，PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39．5kD的融合蛋白。【结论】成功构建了人resistin基因原核表达载体，且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白，为下一步研究打下了实验基础。     

基因Ⅳ型HEV ORF3真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建基因Ⅳ型HEV ORF3的真核表达栽体.方法 从患者血清中提取HEW RNA,利用RT-PCK技术扩增HEV ORF3基因,EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFPC2真核表达载体,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPC2-OPF3.将重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞,Western blot分析鉴定EGFP-ORF3融合蛋白的表达.结果 真核表达质粒转染HepG2细胞,Western blot在39.8kD左右有一条强的棕色条带.结论 成功构建pEGFPC2-ORF3真核表达质粒,在HepG2细胞表达融合蛋白,为进一步研究该蛋白生物学功能奠定了基础.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值

目的 探讨降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值.方法 选取住院治疗的细菌性肺炎患者72例,根据治疗效果分为治疗有效组(有效组)47例和治疗无效组(无效组)25例,对治疗有效组和无效组中的降钙素酶原变化及影响肺炎治疗效果的危险因素进行分析.结果 有效组治疗后3天及治疗后7天的降钙素酶原显著低于无效组的患者(P＜0.05);年龄＞65岁、心功能≥3级、COPD、糖尿病、肺部双侧受累(X线示)、菌血症、感染性休克和3天内降钙素酶原变化率＜30％是影响细菌性肺炎治疗效果的危险因素;感染性休克、肺部双侧受累、3天内降钙素酶原变化率＜30％及心功能≥3级是影响细菌性肺炎治疗效果的独立危险因素.结论 测定降钙素原变化率对细菌性肺炎的疗效评估具有重要临床意义,可在临床推广应用.     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。