含当归中成药的DNA提取及其分子鉴定

目的:优化含当归中成药的DNA提取方法,并利用叶绿体trn L-F基因及当归特异分子标记对当归中成药进行鉴定。方法:采用传统十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法,十二烷基磺酸钠(SDS)法,磁珠法以及改良CTAB法对10种含有当归成分的中成药进行DNA提取,利用微量紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳检测所得总DNA的完整性、纯度和浓度。对10份当归中成药的trn L-F序列进行扩增、测序,对序列进行比对分析并构建系统发育树。利用当归特异鉴别分子标记对10种当归中成药中的当归成分进行分子鉴别。结果:利用改良CTAB法获得了纯度较高,质量较好的DNA。10种中成药中当归的trn L-F序列与正品当归序列相似度为99.88%~100%,系统发育树显示10份中成药中的当归与正品当归聚为一类。利用当归特异性鉴别分子标记进行验证,10种中成药DNA样品均能得到明亮的扩增条带。结论:改良CTAB法可以有效提取当归中成药中的基因组DNA。利用trn L-F序列和当归特异性鉴别分子标记,成功对10份市售当归中成药进行了分子鉴别,为当归类中成药的分子鉴定奠定了基础。     

沉香DNA的提取及其ITS2-PCR体系的优化

目的:建立沉香的总DNA提取方法及r DNA第二内转录间隔区序列(ITS2)聚合酶链式反应(PCR)扩增体系。方法:分别采用改良的CTAB法、改良的CTAB法联合DNA提取试剂盒法及DNA提取试剂盒法提取沉香总DNA,利用通用引物ITS2P1/ITS2P2扩增r DNA ITS2目的片段,通过正交试验优选沉香的PCR扩增条件并对目的片段进行测序。结果:改良的CTAB法联合DNA提取试剂盒法提取总DNA的A260 nm/A280 nm1.79,质量浓度350 mg·L-1,PCR扩增目的片段产率最高。不同因素水平对沉香ITS2-PCR反应的影响顺序为模板DNA引物Taq DNA聚合酶d NTP。最佳反应体系为20μL体系,DNA模板40 ng,引物0.2 mmol·L-1,d NTP 0.5 mmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.5 U。测序获得的目前片段长度230 bp,与Gen Bank中瑞香科沉香属白木香序列相似性100%。结论:CTAB法联合DNA试剂盒法可简单、快速获得高质量沉香总DNA,正交试验可快速获得ITS2目的片段,为沉香的分子鉴定和系统发育分析提供参考。     

基于DNA条形码的三种沉香属物种鉴定研究

目的:利用5个DNA条形码(ITS、matK、rbcL、psbA-trnH和trnL-trnF)对3个沉香属物种白木香、马来沉香和Aquilaria crassna Pierre进行分子鉴定,为沉香属药材的种类鉴定和种间分类地位提供分子生物学依据。方法:使用改良CTAB法提取沉香属植物的总DNA,分别对5个条形码序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增与测序。序列经DNAStar软件拼接,MEGA 7.0软件比对分析及计算相关数据,基于K2P模型构建系统发育树。结果:各条形码序列均被成功扩增与测序,其中trnL-trnF由于含有寡核苷酸重复序列而导致测序序列质量低。ITS及matK均能提供较多遗传信息,但在系统发育树中无法准确区分白木香、马来沉香和Aquilaria crassna Pierre这3个物种,而ITS+matK的组合能准确分辨上述物种。结论:ITS+matK组合序列可以用来鉴别沉香属物种,为沉香属药材的种类鉴定和种间分类地位提供分子生物学依据。     

何首乌及其常见混淆品的matK基因序列分析及鉴别

目的:比较何首乌与其常见混淆品的matK基因序列,从分子水平对中药材何首乌进行鉴定。方法:改良的CTAB法提取基因组DNA,用一对matK通用引物进行PCR扩增,TA克隆后进行测序和序列分析。结果:除毛脉蓼之外,其他混淆品与正品何首乌间的matK基因序列差异较大,不论是核苷酸替代数还是遗传距离,都远远大于不同居群的何首乌之间;进一步比对分析,发现了可以快速鉴别何首乌及其同属混淆品的鉴别位点;运用matK序列分析成功地对3种市售何首乌药材进行了真伪鉴定。结论:根据matK序列特征,能有效区分何首乌及其常见混淆品,matK序列可以作为何首乌药材鉴定的分子标记。     

滇产糙苏属3种药用植物的ITS及matK分子鉴别

目的:分析滇产糙苏属3种药用植物丽江糙苏、黑花糙苏和假秦艽野生居群的ITS区和matK基因片段碱基序列,为丽江糙苏、黑花糙苏和假秦艽野生资源的鉴别及保护提供分子依据。方法:采用ITS区特异引物ITS4/ITS5和matK基因特异引物matKXF/matK5R进行PCR扩增并测序。结果:在ITS1、ITS2和matK基因片段上,丽江糙苏、黑花糙苏和假秦艽的种间K2P最小遗传距离均大于种内K2P最大遗传距离,NJ系统发育树也显示这3种药用植物均可与Gen Bank数据库中糙苏属外源种植物鉴别开,其中丽江糙苏、黑花糙苏和假秦艽的ITS2序列上分别具有3个、2个和1个有效鉴别位点,ITS1序列上分别具有3个、3个和3个有效鉴别位点,假秦艽的matK序列具有3个有效鉴别位点,丽江糙苏和黑花糙苏的matK序列需多个变异位点结合方可进行有效鉴别。结论:本研究表明ITS1、ITS2和matK片段可用于丽江糙苏、黑花糙苏和假秦艽的分子鉴别。     

中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究

目的：建立一种直接从药材中提取DNA的方法以满足中药材DNA条形码研究的需要。方法: 以麦冬药材为实验对象,对比5种常用植物DNA提取方法,筛选出最优方法后,对不同部位入药的10种中药材进行DNA提取,采用琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增效果进行检测。结果：改良的CTAB法较适合药材DNA提取,虽然所有样品DNA都出现降解,但基于ITS2序列引物PCR扩增成功率为90%。结论：通过增加药材的预处理、核分离液等步骤,并改良CTAB浓度等措施,CTAB法能够用于上述不同药用部位入药的9种药材DNA提取,可以为中药DNA条形码鉴定中的DNA提取提供参考。     

一种钩藤属植物的分子鉴定

目的:以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记,对1种钩藤属植物归类到种提供分子证据.方法:改良CTAB法提取钩藤植物材料总DNA,通过引物对rDNA ITS区序列进行PCR扩增,经过克隆、测序后,与GenBank中已有的钩藤属植物rDNA ITS区序列进行比对,并应用Clustal X,BioEdit等软件计算分析,用PAUP软件构建系统发育树.结果:测序得到该钩膝植物的rDNA ITS区序列长度为719bp,序列分析结果显示该钩藤植物与Genbank中已有的华钩藤Uncaria sinensis rDNA ITS区序列之间相似性达99.7%,并且在系统发育树中并排聚类成一支.结论:基于rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对该钩藤属植物进行准确的分子鉴定,为钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据.     

适用于SSR分析的广西莪术DNA提取方法考察

目的:获取适用于广西莪术简单序列重复(SSR)分析的高质量DNA,为该品种的遗传多样性研究提供参考。方法:选择广西莪术嫩叶为材料,采用经典十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和改良CTAB法提取广西莪术总DNA,考察手工和机器研磨的差异性,采用UV检测DNA浓度和纯度,DNA作为模板进行聚合酶链反应(PCR)扩增,引物选择clest SSR-01,clest SSR-03,clest SSR-06,clest SSR-08,clest SSR-14,clest SSR-15,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA扩增效果。结果:改良CTAB法所提DNA的A260 nm/A280 nm1.8~2.0,蛋白质、多糖、RNA等物质去除较彻底,DNA符合PCR扩增结果要求,使用姜黄属通用引物能扩增出清晰条带。经典CTAB法所提DNA的A260 nm/A280 nm1.50~1.60,含较多杂质,无法用于PCR扩增等分子生物学研究。结论:改良CTAB法提取所得DNA质量较好,可有效去除次生代谢产物对DNA的干扰,适用于广西莪术SSR分子标记和遗传多样性分析。     

柴胡及其常见伪品的DNA指纹鉴定

目的:建立柴胡及其伪品DNA指纹鉴别方法.方法:采用改良的CTAB法提取柴胡及常见伪品的干根基因组DNA,设计鉴别正品柴胡及其伪品的特异性引物,利用PCR扩增技术对正品柴胡及其伪品进行DNA指纹鉴定.结果:改良的CTAB法提取出大小为23 kb的基因组DNA条带,纯度在(1.71±0.11),且经特异引物PCR扩增,只有正品柴胡能扩增出173bp大小的片段,而伪品未能扩增出目的片段.结论:柴胡DNA具有特异性指纹特征,可作为市售柴胡的真伪鉴定依据.     

夹竹桃科DNA条形码的初步筛选

DNA条形码(DNA barcoding)是一种新的物种鉴定技术,COI序列已成功应用于动物的鉴定,但目前国际上还没有找到一个通用序列能鉴定所有植物物种。为探索适合于夹竹桃科植物DNA条形码序列,拟用matK、ITS2、ITS 3个常规引物序列对夹竹桃科5个属的部分植物进行基因序列对比分析,并运用MEGA 7.0构建系统进化树进行系统发育分析、鉴定其亲缘关系。结果显示在ITS2、ITS、matK 3个引物序列中,只有matK引物序列能正常扩增目的基因,扩增成功率达到100%,并且该引物序列对比分析和系统发育树的聚类结果与传统分类学的鉴定结果一致。建议将matK序列作为夹竹桃科DNA条形码鉴定候选序列之一。     

云南草果种质资源DNA条形码序列分析

目的 筛选与评价适用于云南草果居群的DNA条形码。方法 以云南省草果种质资源为样本对ITS、psbA-trnH、matK、rbcL和ycf1 5条DNA条形码常用序列进行筛选与评价,并对草果居群进行扩增,测序,测序序列用Genestar进行拼接,然后用Mega进行数据处理,并对草果多样性及其鉴定进行分析。结果 引物ITS5和ITS4对草果的扩增片段长度大约为520 bp;rbcLa-F和rbcLa-R对草果的扩增片段长度大约为498 bp;引物ycf1-bF和ycf1-bR对草果的扩增片段长度大约为800 bp;引物psbA-trnH-1F和psbA-trnH-1R对草果的扩增片段长度大约为400 bp;引物matK-2F和matK-2R对草果的扩增片段长度大约为470 bp。扩增及测序的成功率均较高,结果大多可用。通过对草果ITS、psbA-trnH、matK和ycf1序列的扩增结果进行分析,草果与其他豆蔻属植物都可以被清晰地区分开;ITS序列所有样本分为MG5白花草果居群和其他居群;psbA-trnH序列所有样本分为MG5白花草果居群,MG6黄花草果居群和其他居群;matK序列所有样本分为MG6黄花草果居群和其他居群,MG5白花草果样本扩增失败;ycf1序列所有样本分为MG6黄花草果居群和其他居群,MG5白花草果居群与其他22个草果居群聚为一支;rbcL序列对所有样本的扩增均一致。结论 ITS、matK、psbA-trnH及ycf1序列均能将草果与其他同属植物进行准确区分;MG6的matK、psbA-trnH及ycf1序列发现了序列位点的变异,为草果品种的选育做出贡献。ITS和psbA-trnH序列可将黄花和白花草果序列区分开;草果白花黄花所有样本rbcL序列无任何变异,且用rbcL序列无法鉴别草果与其他同属植物,可将其舍去。     

不同栽培品种橘皮中主要活性成分的动态积累

目的：利用不同方法对白及基因组DNA进行提取,比较提取质量的差异,找到一种最适于白及基因组的DNA提取方法,以满足白及DNA条形码研究的需要。方法：采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、十二烷基硫酸钠（SDS）法、碱裂解法和经本文改良的CTAB法提取白及叶片基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法及PCR扩增效果检测所提DNA的质量。结果：CTAB法、SDS法和改良CTAB法均能从白及中提取到基因组DNA,而碱裂解法几乎提取不到。其中改良CTAB法提取的DNA纯度和完整度均高于其他方法,PCR扩增效率达到100 %,且扩增条带明亮清晰。结论：经本文改良的CTAB法是提取白及基因组DNA的最佳方法,该方法提取的基因组DNA适用于DNA条形码研究。     

灯盏花MYB基因克隆及其荧光表达载体的构建

目的克隆灯盏花MYB基因的全长序列,为解析灯盏花MYB基因的功能奠定基础。方法根据灯盏花转录组的相关信息,利用RACE方法从灯盏花中克隆到一个可能参与灯盏花乙素合成的MYB基因,在对其cDNA序列、核苷酸序列的相似性、理化性质、疏水性、跨膜结构、二级结构及三级结构进行分析预测的基础上,对其进行多序列比对并构建系统树。同时,还构建了该基因与绿色荧光蛋白的融合表达载体,并进行了初步转化研究。结果克隆获得灯盏花MYB基因,命名为ebMYB06,其开放阅读框为783 bp,编码260个氨基酸残基,相对分子质量为63 800,理论等电点(p I)为5.18,属稳定蛋白。其蛋白二级结构主要由无规卷曲、α-螺旋和β-折叠构成。根据灯盏花MYB与拟南芥MYB(AtMYB)的系统树比对分析结果,发现ebMYB基因与拟南芥中的AtMYB4、7、32、6、8和AtMYB11、12、111 2亚群的基因聚类,推测所克隆基因在结构或功能上,可能与这两组具有共同性。实验还表明所构建的表达可用于灯盏花的高效转化。结论首次从灯盏花中克隆到可能参与其苯丙烷代谢或环境响应调控的MYB基因。     

AFLP标记对灯盏花遗传多样性及选育品系群体一致性的分析

目的: 对灯盏花群体种质资源进行分析,为灯盏花的品种选育提供依据。 方法: 用筛选出来的11对引物对采自云南泸西、昆明、大理、丘北、石林的6份灯盏花种质资源进行AFLP遗传多样性分析。 结果: ①11个引物在6份种质资源中共产生636条DNA片段,其中604条带为多态性条带,约占82.40%。 ②在相似系数为0.706时,6份不同地区的灯盏花可聚为3类,第1类包括千山1号和千山2号大部分样品及大理、石林、昆明3个地区的野生居群;第2类为丘北的野生居群;第3类主要为部分千山2号及其他地区样品。千山1号和千山2号灯盏花平均遗传相似系数大,遗传相似系数变幅小,品系内遗传分化较小,遗传性状较稳定; ③对6份灯盏花样品的分子系统聚类分析表明:地理来源相同的部分有相对聚合现象或少部分品系出现交差聚类,与其亲缘关系较近有关;丘北居群自行一类,与其特异的遗传基础差异较大有关。 结论: AFLP对灯盏花的遗传多样性分析具有可靠性;系统选育对灯盏花的育种具有可行性。     

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。     

灯盏花转录组中SSR位点信息分析及其多态性研究

目的： 通过对灯盏花转录组中SSR位点信息的分析,设计SSR引物,为开发新的SSR标记奠定了基础。方法：利用MISA工具筛选灯盏花转录组测序获得的52 060条unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;Primer3设计SSR引物,随机选取36对引物对13株采自不同地方的灯盏花进行多态性扩增分析。结果：灯盏花转录组搜索到3 639个SSR位点,分布于3 260条unigenes上,SSR位点出现频率是6.99%。其中,二核苷酸重复是主要的类型,占总SSR的34.41%,其次是单核苷酸和三核苷酸重复基元,分别占总SSR的31.41%,30.04%。二核苷酸重复基元中以AT/AT和AC/GT为优势重复基元,占总SSRs的28.71%,三核苷酸重复基元以AAT/ATT为主,占7.94%。随机选取36对引物进行PCR扩增,其中34对（94.44%）扩增出清晰、可重复的条带,19对（52.78%）表现出多态性差异。利用UPGMA作图,将13个材料分为2类。结论：灯盏花转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

基于DNA条形码的芦荟属6种植物的分子鉴定

目的筛选出适合芦荟属6种植物的DNA条形码序列。方法采用试剂盒法提取芦荟属6个品种基原植物的18份样本基因组DNA,应用通用引物扩增其核基因ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK基因序列并进行双向测序,采用Sequencher 4.1.4软件对测序峰图进行校对拼接,应用MEGA 5.0软件分析不同候选序列的特征,计算物种的种内、种间Kimura 2-Parameter(K2P)遗传距离,比较其种内、种间变异的大小,评估序列的条形码间距(barcoding gap),采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统聚类树。结果共获得72条序列,ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK基因序列各18条,测序成功率均为100%。比对后序列长度为255~723 bp,GC量范围为30.6%~68.2%。psbA-trnH基因序列的最大种内遗传距离均小于最小种间遗传距离,有明显的barcoding gap,ITS2、rbcL、matK序列的种内变异和种间变异有一些重叠,没有明显的barcoding gap。基于psbA-trnH序列的发育树能将芦荟属6个品种完全区分,而其他3个序列在区分这些芦荟属品种时存在模糊鉴定。结论 DNA条形码技术可以准确鉴别芦荟属植物,psbA-trnH序列可以作为鉴别芦荟属植物的优选序列。     

快速PCR法鉴别鱼腥草与百部还魂的方法研究

目的 建立鉴别鱼腥草Houttuynia cordata与百部还魂Gymnotheca chinensis的特异性PCR方法。方法 采集不同产地的鱼腥草与百部还魂样品各8份,所有样品提取总DNA。通过对其mat K片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异鉴别引物,建立特异PCR鉴别方法,并通过加入SYBR Green I染料法对2种中药进行快速检测。另外,构建多重PCR体系,只经一个PCR反应,就能对鱼腥草与百部还魂进行快速分子鉴定。结果 所构建特异PCR与多重PCR体系均能产生鱼腥草185 bp的特异鉴别条带,百部还魂389 bp的特异鉴别条带,SYBR Green I染料可进行快速检测方法。结论 建立的鱼腥草与百部还魂2种中药的快速PCR鉴别方法简便、可靠。     

基因枪介导灯盏花遗传转化及几个影响因素的研究

目的获得具有较强抗虫抗真菌的转基因灯盏花植株。方法通过PCR聚合酶链式反应得到目的基因RBB I2-3,通过中间载体PBS及植物载体YY 46,得到带有目的基因的质粒,用基因枪轰击法进行遗传转化。对基因枪轰击受体、轰击压力、抗生素庆大霉素(G en t.)的敏感性进行对照实验。结果用灯盏花的真叶作为基因枪轰击受体效果最好,其次为型愈伤组织,灯盏花的根、茎,型愈伤组织作为基因枪轰击受体效果较差;8.96×106Pa的轰击压力诱导灯盏花的真叶形成转基因不定芽效果最好,型愈伤组织效果次于真叶;使用50μg/mL Gent.作选择压力筛选Gent.标记的阳性转基因灯盏花植株效果最好。结论用基因枪轰击法将水稻RBBI2-3基因转移到灯盏花中具有较好效果,成功获得转基因灯盏花植株。     

不同产地温莪术遗传多样性及亲缘关系的ISSR分析＊

目的 采用简单序列重复区间（ISSR）分子标记技术分析不同产地温莪术的遗传多样性和亲缘关系。方法 以3个产地8个温莪术居群的42个样品为材料，从20条ISSR引物中筛选出6条进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用PopGene 32软件对不同居群ISSR标记结果进行多态性分析，通过UPGMA方法聚类并构建亲缘关系树。结果 6条引物共扩增出 42 个多态性位点，居群水平多态位点平均百分率为29.17%。居群间遗传分化系数Gst为0.3886，居群间每代个体的基因流系数（Nm）为 0.7868。8个居群遗传一致性范围为 0.8481-0.9736，遗传距离范围为 0.0268-0.1647。结论 供试8个温莪术居群之间的遗传多样性水平偏低，遗传变异较少，基因流动性水平较低。本研究的开展为温莪术的引种栽培及育种提供了一定的分子生物学依据。