缺血延迟预适应对心肌缺血再灌注所致细胞凋亡的保护

目的：分析心肌缺血延迟预适应能否抑制心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的发生及其发生的可能原因。 方法：①实验于2003-08／2004-12在中山大学中西医研究所完成。选用出生两三个月的SD大鼠32只，雌雄不拘。②随机将大鼠分为4组：正常对照组（不做任何处理），假手术组（只穿线，不结扎），缺血再灌注组（采用经典大鼠冠状动脉结扎，缺血1h，再灌注1h），延迟缺血预处理组（采用经典大鼠冠状动脉结扎，缺血5min再灌注5min，重复3个缺血预处理，24h后，缺血1h，再灌注1h。③采用流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率，反转录聚合酶链法检测Bcl-xl mRNA/Bcl-xs mRNA的表达情况，进行Bcl-xl的蛋白免疫印迹分析并利用免疫组织化学染色法检测大鼠心肌核因子KB亚单位P65蛋白的表达。 结果：大鼠32只均进入结果分析。①大鼠心肌细胞凋亡率：心肌缺血再灌注组明显升高（P〈0.01），延迟缺血预处理组明显低于缺血再灌注组（P〈0．01）。②大鼠心肌Bcl-xl mRNA与Bcl-xs mRNA表达的比值：缺血再灌注组明显低于正常对照组（P〈0．01），延迟缺血预处理组明显高于缺血再灌注组（P〈0．01）。③大鼠心肌Bcl-xl蛋白表达：缺血再灌注组明显减少（P〈0．01），延迟缺血预处理组明显高于缺血再灌注组（P〈0．01）。④大鼠心肌核因子κB P65蛋白表达：延迟缺血预处理组核因子κB P65发生核转位且明显高于与缺血再灌注组（P〈0．01）。 结论：心肌缺血延迟预适应可以减少心肌缺血再灌注造成的细胞凋亡，此种作用发生可能与核因子KB括化后促进Bcl-xl的表达，保护线粒体功能有关。     

环磷腺苷葡胺对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡和NF-κB表达的影响

目的 观察环磷腺苷葡胺对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡及NF-κB表达的影响.方法 30只SD大鼠随机等分为3组:对照组为假手术组仅进行开胸手术;缺血再灌注组心肌缺血30 min,再灌注100 min;环磷腺苷葡胺注射组在心肌缺血前静脉输注环磷腺苷葡胺2 mg/kg.心肌细胞凋亡和NF-κB表达分别采用TUNEL法和免疫组织化学方法检测.结果 环磷腺苷葡胺注射组大鼠心肌细胞凋亡指数及心肌组织中NF-κB表达明显低于缺血再灌注组(P<0.01),但高于对照组(P<0.01).结论 应用环磷腺苷葡胺注射液可明显降低缺血再灌注损伤大鼠的心肌细胞凋亡和NF-κB表达.     

细胞凋亡的线粒体信号通路在大鼠缺血延迟预适应抗心肌细胞凋亡机制中的作用

目的：以细胞凋亡的线粒体途径为切入点,探讨心肌缺血延迟预适应抑制心缺血再灌注（MI/R）后细胞凋亡的可能机制.方法：SD大鼠分为正常对照组、假手术组、缺血再灌注组、延迟缺血预处理组.缺血再灌注组采用经典大鼠冠脉结扎,缺血1h,再灌1h.延迟缺血预处理组采用缺血5min,再灌5min,反复循环3次,24h后缺血1h,再灌1h.流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率,进行细胞色素C（CytC）和凋亡诱导因子（AIF）的Western blotting分析及Caspase-3活性测定,并利用免疫组织化学染色法检测大鼠心肌HSP70的表达.结果：与缺血再灌注组相比较,心肌缺血预处理24h后可以减少MI/R后心肌细胞凋亡率,抑制CytC和AIF自线粒体向胞浆的释放及caspase-3的活化,上调HSP70蛋白表达.结论：心肌缺血延迟预适应可以减少MI/R造成的细胞凋亡,机制与其诱导HSP70的生成,抑制细胞凋亡的线粒体信号转导途径有关.     

血塞通预处理对心肌缺血再灌注损伤的早期保护作用

目的观察血塞通预处理对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤的早期保护作用,并研究其可能机制.方法采用开胸冠状动脉结扎建立缺血再灌注模型,25只雄性SD大鼠随机分为假手术组,缺血再灌注组(I/R组),缺血预处理组(IPC组),血塞通预处理组(PNS预处理组).再灌注后2 h测定各组血清肌酸磷酸激酶-MB(CK-MB)含量以及心肌细胞凋亡情况和心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达,并观察心肌超微结构变化.结果IPC组及PNS预处理组血清CK-MB均明显低于I/R组(P＜0.05).IPC组及PNS预处理组TUNEL阳性细胞数,Bax阳性细胞数均明显低于I/R组(P＜0.05).和I/R组相比,IPC组及PNS预处理组心肌超微结构损伤减轻.结论PNS预处理后心肌细胞凋亡减少,心肌细胞损伤减轻,对I/R损伤产生有和缺血预处理类似的早期保护作用.     

腺苷预处理对缺血/再灌注心肌细胞凋亡和凋亡蛋白Bcl-2/Bax的影响

目的 研究腺苷预处理对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡和凋亡蛋白Bcl-2/Bax的影响.方法 制备缺血/再灌注损伤(I/R)和腺苷预处理的大鼠模型,采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率和凋亡蛋白Bcl-2和Bax.结果 ①缺血/再灌注组和腺苷组心肌细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.01),而腺苷组凋亡率显著低于缺血/再灌注组(P<0.01).②缺血/再灌注组抗凋亡蛋白Bcl-2表达与对照组比较无明显差别,而腺苷组Bcl-2显著高于缺血/再灌注组和对照组(P<0.01);缺血/再灌注组和腺苷组促凋亡蛋白Bax表达显著高于对照组(P<0.01),而腺苷组Bax低于缺血/再灌注组(P<0.01);缺血/再灌注组和腺苷组Bcl-2/Bax比值显著低于对照组(P<0.01),而腺苷组Bcl-2/Bax比值显著高于缺血/再灌注组(P<0.01).结论 腺苷预处理明显抑制大鼠缺血/再灌注后心肌细胞的凋亡,并使Bcl-2/Bax比值增加.     

缺血后处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

目的:观察缺血后处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响。方法:实验于2006-02/05在首都医科大学附属朝阳医院心脏中心实验室完成。选择健康SD大鼠48只,随机数字表法分为3组:假手术组、缺血再灌注组和缺血后处理组,每组16只。制备大鼠心肌缺血再灌注模型。缺血再灌注组,收紧结扎线缺血40min,放松结扎线再灌注240min;缺血后处理组,缺血40min后,再灌注10s,缺血10s,连续3个循环,然后再灌注239min;假手术组,开胸后穿线做套环,但不收紧结扎线。采用TUNEL技术检测心肌细胞凋亡率,同时测定血清肌酸激酶活性和心肌梗死范围。结果:纳入动物48只,均进入结果分析。①血清中肌酸激酶活性的测定:再灌注结束后缺血后处理组和缺血再灌注组肌酸激酶活性明显高于假手术组[分别为(13.54±1.50),(20.72±1.58),(2.90±0.28)μkat/L,P<0.01],缺血后处理组明显低于缺血再灌注组(P<0.01)。②心肌梗死范围:再灌注结束后缺血后处理组和缺血再灌注组心肌缺血区与左室面积比值无明显差异,缺血后处理组心肌坏死区与缺血区比值显著低于缺血再灌注组(分别为26.1±6.7,40.2±7.2,P<0.01)。③心肌凋亡细胞计数:再灌注结束后假手术组未见明显细胞凋亡(<5%),缺血后处理组心肌细胞凋亡率明显低于缺血再灌注组[分别为(12.5±2.9)%,(21.3±3.8)%,P<0.01]。结论:缺血后处理可减轻缺血再灌注损伤、其机制可能与减少心肌细胞凋亡有关。     

顿抑心肌中腺嘌呤核苷酸转运体基因的动态表达

目的:通过观察大鼠心肌缺血再灌注模型中腺嘌呤核苷酸转运体(adeninenucleotidetranslocator,ANT)的动态表达情况,初步探讨顿抑心肌中ANT各单体的表达变化对心肌能量代谢的影响及其与心肌细胞凋亡的联系。方法:实验于2003-11/2004-04在解放军南京军区南京总医院心脏内科实验室和动物实验中心完成。将60只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=8)和手术组(n=52)。将手术组大鼠冠状动脉左前降支结扎闭塞20min,然后剪断结扎线再灌注。按缺血后再灌注4h、1,3,7d4个时相分4组进行观察(n=13)。用反转录-聚合酶链反应计算机凝胶成像分析系统测定心肌中ANT1,ANT2mRNA相对含量。对照组大鼠不干预。结果:60只大鼠进入结果分析。①ANT1mRNA含量在缺血后再灌注4h达高峰(P<0.05)。在再灌注1d开始降低,再灌注3d时明显下降(P<0.05),逐渐恢复到对照水平(P>0.05),再灌注7d的结果与再灌注3d相似。②ANT2mRNA含量在再灌注4h时无明显增加,在再灌注1d开始升高并达峰值(P<0.01),从再灌注3d开始明显下降(P<0.01),并恢复到对照水平(P>0.05)。再灌注7d结果与再灌注3d相似。结论:①顿抑心肌中ANT的含量增加,顿抑心肌中能量短缺的现象可在缺血后再灌注3d内得以纠正。②心肌缺血可以导致细胞凋亡,心肌细胞凋亡主要发生在缺血再灌注早期(24h内),而且在体内存在时间短暂(缺血后再灌注3d内恢复)。     

粉防己碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

目的:建立大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型,观察粉防己碱对缺血再灌注损伤过程中心肌细胞凋亡的干预,初步探讨其保护缺血再灌注损伤心肌的作用机制。方法:实验于2005-03/2006-04在华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科及心血管病研究所完成。①选择健康雄性SD大鼠48只,随机数字表法分为假手术组、缺血/再灌注损伤组、粉防己碱组,各16只。粉防己碱由华中科技大学同济医学院药理学系提供,纯度>98%。②造模前20min,粉防己碱组腹腔注射粉防己碱3mg/kg(约1.2mL),缺血/再灌注损伤组、假手术组均腹腔注入生理盐水1.2mL。③缺血/再灌注损伤组、粉防己碱组大鼠建立缺血/再灌注损伤模型。当结扎点远端心前壁变紫、心电图显示ST段抬高为冠状动脉结扎成功,松扎后抬高的ST段回落1/2以上为再灌注成功的标志。实施30min缺血,再灌注24h。假手术组不造模,在肺动脉圆锥与左心耳间穿线,不结扎,30min关胸,24h后处死。④再灌注结束后检测血清中乳酸脱氢酶活性、心肌组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和心肌梗死范围,并应用DNA琼脂糖凝胶电泳及原位末端标记法检测各组凋亡细胞及凋亡指数。结果:48只大鼠全部进入结果分析。粉防己碱对大鼠缺血/再灌注损伤的心肌保护作用:①生化指标测定值:心肌细胞受损后,与缺血/再灌注损伤组比较,粉防己碱组乳酸脱氢酶活性、丙二醛含量均显著降低(t=4.337～10.810,P<0.01),超氧化物歧化酶活性显著增高(t=4.352,P<0.01)。②梗死范围:粉防己碱组可明显减少心肌梗死范围,与缺血/再灌注损伤组比较差异有显著性意义[(23.28±4.38)%,(43.76±6.30)%,t=7.552,P<0.01]。粉防己碱对大鼠心肌缺血/再灌注损伤细胞凋亡的影响:①琼脂糖凝胶电泳:假手术组心肌细胞DNA电泳呈一条大分子DNA片段,为正常DNA带型;缺血/再灌注损伤组DNA电泳呈“梯形结构”,可见形似云梯状的DNA片段,为凋亡的典型表现;粉防己碱组的DNA琼脂糖凝胶电泳显示DNA梯形条带明显减弱。②原位末端标记:假手术组偶见凋亡心肌细胞;缺血/再灌注损伤组可见大量胞核呈深浅不一棕褐色的凋亡心肌细胞;粉防己碱组凋亡心肌细胞较缺血/再灌注损伤组明显减少,但较假手术组有所增加。③凋亡指数:与假手术组比较,缺血/再灌注损伤组、粉防己碱组凋亡指数均显著增高[(0.65±0.39)%,(19.36±5.28)%,(8.62±2.45)%,t=9.096～10.006,P<0.01];但粉防己碱组凋亡指数明显低于缺血/再灌注损伤组(t=5.224,P<0.01)。结论:粉防己碱预处理可明显减轻心肌再灌注损伤、抑制细胞凋亡及抗氧自由基,为保护濒死心肌提供了机会窗口。     

生长激素对大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的作用

目的:研究生长激素对大鼠心肌缺血再灌注(myocardialischemiareper-fusion,MIR)后心肌细胞凋亡及其机制的影响。方法:24只大鼠随机分为3组,假手术组(仅手术24h)、MIR组、生长激素组,每组8只。后两组均缺血30min,再灌注24h,其中生长激素组的每只大鼠每天皮下肌注生长激素1U/kg,连续7d。前两组每只大鼠相应皮下肌注生理盐水0.5mL/d。以TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况,DAB免疫组化法检测心肌细胞核NF-κB蛋白、心肌细胞胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)的表达并进行心肌组织病理学检查。结果:大鼠MIR24h后心肌细胞凋亡指数明显上升犤MIR组(16.17±5.02)%,假手术组为0犦(t=9.111,P<0.05)。心肌细胞核NF-κB蛋白表达呈阳性染色指数(positiveindex,PI)明显升高犤MIR组(18.60±7.21)%,假手术组为0犦(t=7.297,P<0.05)。心肌病理检查见心肌缺血区呈大小不一的坏死孔灶,缺血心肌间有炎症细胞浸润,心肌排列不整齐(HE染色),而生长激素组心肌细胞凋亡率及心肌细胞核NF-κB蛋白PI明显好于MIR组(t=4.302,2.943,P<0.05)。生长激素组IGF-1着色强度明显高于另外两组(χ2=12.443,9.167,P<0.05),心肌细胞间炎症细胞也明显减少,坏死灶也少于MIR组。结论:生长激素可以减少MIR后心肌细胞凋亡及细胞核NF-κB     

L-精氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

目的:观察糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时血管紧张素Ⅱ、胰岛素样生长因子1、醛固酮、细胞间黏附分子1和自由基代谢的变化及L-精氨酸对其的影响。方法:实验于2005-02/2006-06在江苏大学医学院机能学实验室完成。①实验分组:腹腔注射链脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型,30只大鼠造模成功。按随机数字表法分为3组(n=10):心肌缺血再灌注组:开胸结扎冠脉,造成心肌缺血,60min后放松再灌注60min;L-精氨酸治疗组:于手术前4周灌胃L-精氨酸250mg/(kg·d),然后重复心肌缺血再灌注组操作;假手术组:完成操作后只穿线不结扎,观察2h作为对照。实验结束时心室取血6mL,摘取心脏,留取左心室心肌组织。②实验评估:检测大鼠血浆血管紧张素Ⅱ、醛固酮和血清胰岛素样生长因子1含量及心肌细胞间黏附分子1蛋白表达。检测大鼠血清、心肌组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-过氧化物酶活性、丙二醛含量及心肌线粒体Na ,K -ATP酶、Mg2 -ATP酶、Ca2 -ATP酶活性。结果:30只大鼠全部进入结果分析。①与假手术组相比,心肌缺血再灌注组血浆血管紧张素Ⅱ、醛固酮含量明显升高(P<0.05～0.01),血清胰岛素样生长因子1含量降低(P<0.05);L-精氨酸治疗4周后血浆血管紧张素Ⅱ、醛固酮含量低于心肌缺血再灌注组(P<0.05～0.01),血清胰岛素样生长因子1含量高于心肌缺血再灌注组(P<0.05)。②与假手术组相比,心肌缺血再灌注组血清、心肌丙二醛含量明显升高(P<0.05),血清、心肌超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-过氧化物酶活性明显降低(P<0.05￣0.01);用L-精氨酸治疗4周后血清、心肌丙二醛含量低于心肌缺血再灌注组(P<0.05￣0.01),血清、心肌超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-过氧化物酶活性高于心肌缺血再灌注组(P<0.05～0.01)。③与假手术组相比,心肌缺血再灌注组心肌线粒体Na ,K -ATP酶、Mg2 -ATP酶、Ca2 -ATP酶活性明显降低(P<0.05),心肌细胞间黏附分子1蛋白表达明显升高(P<0.01);用L-精氨酸治疗4周后心肌线粒体Na ,K -ATP酶、Mg2 -ATP酶、Ca2 -ATP酶活性明显高于心肌缺血再灌注组(P<0.05),心肌细胞间黏附分子1蛋白表达低于心肌缺血再灌注组(P<0.05)。结论:血管紧张素Ⅱ、醛固酮和胰岛素样生长因子1可能共同参与了糖尿病心肌缺血再灌注的发生,细胞间黏附分子1蛋白表达与糖尿病心肌损伤关系密切。L-精氨酸通过减少细胞间黏附分子1蛋白表达,起心肌保护作用。糖尿病心肌缺血再灌注时存在自由基代谢异常,补充L-精氨酸后,可通过提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-过氧化物酶和ATP酶活性,降低丙二醛水平,减轻自由基损伤,改善心肌组织功能。