揭示α-突触核蛋白与帕金森病的关系:α-突触核蛋白单克隆抗体的研究

目的:α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是与帕金森病的发病密切相关的蛋白质。关于这种蛋白质在脑内神经元的亚细胞分布迄今尚无定论。制备α-Syn抗体探讨α-Syn在亚细胞的定位。方法:实验于2004-01/05在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。采用重组的人α-Syn免疫小鼠,并将其脾细胞与骨髓瘤融合制备出杂交瘤,利用免疫组化和Westernblot法筛选阳性克隆,获得一特异性抗α-Syn单克隆抗体。结果:噬菌体多肽展示分析表明,该抗体识别人α-SynC-末端的一段特异序列,但该序列与大鼠和小鼠的相应序列差一个氨基酸。免疫印记分析表明,该抗体能够检测人、大鼠与小鼠脑组织中的α-Syn。用该抗体进行免疫组化染色结果显示,α-Syn免疫阳性物质主要存在于神经元末梢与核中。结论:所制备的单克隆抗体对α-Syn具有特异性,可用于人、大鼠和小鼠的α-Syn研究。     

α-突触核蛋白寡聚体经氧化应激途径致帕金森病小鼠模型多巴胺能神经元损伤

目的:通过鱼藤酮持续灌胃构建的帕金森病小鼠模型研究α-突触核蛋白寡聚体(α-Syn)的毒性作用机制。方法:48只老年雄性C57小鼠随机分为鱼藤酮组和对照组,每组24只,鱼藤酮组灌注0.01 mL/g鱼藤酮氯仿溶液,对照组灌注0.01 m L/g氯仿溶液,均连续灌胃12周。于灌胃后取脑,行蛋白质印迹实验检测α-Syn表达水平、透射电镜观察中脑黑质神经元超微结构;于灌胃前、后取脑,免疫组化染色观察黑质部位酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞密度,并检测脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)水平。结果:灌胃12周后,Western blot显示鱼藤酮组中脑α-Syn的表达较对照组明显增多(P0.05)。免疫组化染色显示鱼藤酮组中TH阳性细胞数量较对照组明显减少(P0.05)。透射电镜显示鱼藤酮组小鼠黑质部可见线粒体、高尔基体不规则肿胀。鱼藤酮组SOD、GSH-PX水平较对照组明显下降(P0.05),MDA水平较对照组显著增多(P0.05)。结论:鱼藤酮小剂量持续灌胃可在脑内诱发形成α-Syn寡聚体,α-Syn寡聚体可能经氧化应激途径导致多巴胺神经元损伤。     

抗人脑钠肽单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：制备抗人脑钠肽单克隆抗体并对其进行初步鉴定。 方法：实验于2004-12／2006-02在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所进行。利用碳化二亚胺法将合成的人脑钠肽与牛血清白蛋白偶联制备完全抗原，反复免疫Balb／c小鼠，应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与Balb／c小鼠骨髓瘤细胞（SP2／0）在PEG下融合，HAT选择性培养，间接酶联免疫吸附方法对细胞培养上清检测、筛选，选择筛选结果脑钠肽抗体阳性的细胞株连续进行3次亚克隆，建立稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株。扩大培养阳性单克隆细胞株后，腹腔注射小鼠，制备腹水。对腹水亲和层析纯化，所得的单克隆抗体行初步鉴定。 结果：免疫小鼠血清呈脑钠肽抗体阳性，经筛选得到3株稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株，纯化的单克隆抗体经鉴定为IgG型，蛋白质印迹分析证实单克隆抗体可特异识别脑钠肽，具备较高的特异性及敏感性。 结论：成功制备了3株抗脑钠肽特异性的单克隆抗体，可用于脑钠肽免疫检测方法的建立。     

miR-26抑制帕金森患者泛素-蛋白酶体系统对含α突触核蛋白降解作用研究

目的探讨miR-26抑制帕金森患者泛素-蛋白酶体系统(UPS)对含α突触核蛋白(α-Syn)降解作用。方法将120只成年雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组与模型组,每组各60只。通过1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)法建立帕金森病小鼠模型,采用反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)检测模型组小鼠中脑黑质区miR-26和α-Syn的mRNA水平,并分析二者的相关性。通过1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)法建立帕金森病细胞模型,RT-PCR检测miR-26的表达水平,并转染miR-26模拟物或miR-26抑制物或加入MG132,RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测α-Syn表达水平。结果RT-PCR检测结果显示,模型组小鼠中脑黑质区组织中miR-26、α-Syn水平均显著高于对照组,两组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组小鼠脑黑质区组织中miR-26水平与α-Syn的mRNA水平呈正相关(r=0.7622,P<0.05)。蛋白免疫印迹法和RT-PCR检测结果显示,SH-SY5Y细胞在转染miR-26模拟物后,α-Syn的蛋白水平升高;转染miR-26抑制物后,α-Syn的蛋白水平降低;而转染miR-26模拟物或miR-26抑制物后,α-Syn的mRNA水平均无显著变化;加入MG132后,α-Syn蛋白水平升高,α-Syn的mRNA水平无显著变化。结论miR-26水平在帕金森病小鼠模型中上调,其不能直接调节α-Syn的表达,但能抑制UPS对α-Syn蛋白的降解。     

慢传输型便秘患者α-突触核蛋白硝基化的意义

目的探讨α-突触核蛋白(α-Syn)在结肠慢传输型便秘(STC)中的变化及病理学意义。方法应用免疫荧光双染技术和病理显微分析图像系统,在中倍光镜下比较22例STC患者(STC组)和20例健康志愿者(对照组)结肠黏膜α-Syn及硝基化α-Syn。结果两组结肠黏膜神经元及胶质细胞均有α-Syn及硝基化α-Syn表达。STC组结肠黏膜α-Syn及硝基化α-Syn较对照组明显增加,α-Syn黏膜层1101.1±26.34 vs.1431.3±30.36;黏膜下1023.1±31.42vs.1332.7±26.3;硝基化α-Syn(黏膜层396±14.16 vs.688.5±28.34;黏膜下129.7±3.78 vs.220.9±8.55),差异有显著性(P<0.05)。结论结肠黏膜神经α-Syn的硝基化参与STC的发病。     

抗人脑钠肽单克隆抗体的制备及其鉴定

目的:制备抗人脑钠肽单克隆抗体并对其进行初步鉴定。方法:实验于2004-12/2006-02在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所进行。利用碳化二亚胺法将合成的人脑钠肽与牛血清白蛋白偶联制备完全抗原,反复免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与Balb/c小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)在PEG下融合,HAT选择性培养,间接酶联免疫吸附方法对细胞培养上清检测、筛选,选择筛选结果脑钠肽抗体阳性的细胞株连续进行3次亚克隆,建立稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株。扩大培养阳性单克隆细胞株后,腹腔注射小鼠,制备腹水。对腹水亲和层析纯化,所得的单克隆抗体行初步鉴定。结果:免疫小鼠血清呈脑钠肽抗体阳性,经筛选得到3株稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化的单克隆抗体经鉴定为IgG型,蛋白质印迹分析证实单克隆抗体可特异识别脑钠肽,具备较高的特异性及敏感性。结论:成功制备了3株抗脑钠肽特异性的单克隆抗体,可用于脑钠肽免疫检测方法的建立。     

肝癌特异性GGT同工酶单克隆抗体的制备

[目的]制备肝癌特异性GGT同工酶（HS-GGT）的单克隆抗体。[方法]以纯化的HS-GGT作为抗原免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤（SP2/0）细胞融合，经免疫酶斑点检测法（Dot-ELISA)筛选和有限稀释法获得分泌单克隆抗体的细胞株。[结果]获得2株识别HS-GGT的单克隆抗体细胞株Ⅲ7B、Ⅻ2C。该抗体能特异性识别HS-GGT；Dot-ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清及体内成瘤后产生的脾水的抗体效价为1：60、1：800；杂交瘤细胞染色体数平均为90-108；亚类鉴定单抗为小鼠IgGl。[结论]成功制备了2株HS-GGT单克隆抗体杂交瘤细胞系。     

α-突触核蛋白对小鼠BV2细胞凋亡的影响及司来吉兰的干预作用

目的观察α-突触核蛋白对小鼠BV2细胞凋亡的影响及司来吉兰的干预作用,并探讨其可能机制。方法采用体外培养小鼠BV2细胞,将α-突触核蛋白及司来吉兰与小鼠BV2细胞共培养后,采用MTT法检测细胞活性,采用TUNLE法检测细胞凋亡率,并通过免疫细胞化学染色,检测各组凋亡基因bcl-2,bax,caspase-3,caspase-9蛋白表达水平。结果α-Syn通过调节凋亡蛋白的表达诱导细胞凋亡,司来吉兰可以减少α-Syn导致的凋亡,提高BV2细胞存活率,减少BV2细胞的凋亡。结论司来吉兰可抑制α-突触核蛋白寡聚体诱导的小鼠BV2细胞凋亡,其作用可能与bcl-2、bax、caspase-3、caspase-9调节有关。     

重组α-突触核蛋白对SD大鼠黑质多巴胺能神经元的作用

目的：研究重组人全长α-突触核蛋白对大鼠黑质多巴胺能神经元的霉性作用。方法：原核表达、鉴定α-突触核蛋白；雄性SD大鼠30只，随机分为α-突触核蛋白注射组、六羟多巴注射组及α-突触核蛋白和六羟多巴联合注射组。用立体定位的方法分别右侧黑质注射α-突触核蛋白，六羟多巴及α-突触核蛋白 六羟多巴，左侧黑质注射等量的生理盐水，测定大鼠纹状体多巴胺含量和黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元数目。结果：六羟多巴和α-突触核蛋白 六羟多巴注射使注射侧多巴胺分别减少到对照侧的36．98％和21．79％，多巴胺能神经元数减少到30．81％和28．05％。而α-突触核蛋白注射对纹状体多巴胺和黑质多巴胺能神经元数目无显著影响。结论：没有发现重组α-突触核蛋白对大鼠黑质多巴胺能神经元有明显的毒性作用。     

红细胞来源α-突触核蛋白作为早发型帕金森病生物标记物的研究

目的:研究早发型(发病年龄<50岁)帕金森病(PD)患者红细胞中是否存在α-突触核蛋白(α-Syn)异常沉积,以及红细胞来源α-Syn能否作为早发型PD的生物标志物。方法:早发型PD患者26例纳入早发型PD组,30例年龄、性别匹配的健康对照受试者纳入对照组;收集所有入组受试者的人口学及临床资料。对早发型PD组的患者进行国际运动障碍协会统一帕金森病评价量表(MDS-UPDRS)和Hoehn&Yahr(H-Y)量表、简易精神状态检查量表(MMSE)、蒙特利尔认知评估量表(MoCA)测评。应用电化学发光免疫测定法检测2组红细胞中的α-Syn单体和α-Syn聚集体浓度,并分析早发型PD患者红细胞来源α-Syn单体和α-Syn聚集体浓度与临床指标的相关性。结果:早发型PD患者的α-Syn单体和α-Syn聚集体的水平显著高于健康对照(P=0.009、P<0.0001)。在诊断效力方面,红细胞α-Syn聚集体优于α-Syn单体,红细胞α-Syn聚集体诊断早发型PD的AUC为0.887(95%CI 0.794-0.981),敏感度为73.3%,特异度为96.2%。早发型PD组红细胞来源α-Syn单体和α-Syn聚集体浓度与患者年龄、病程、H-Y分期、MDS-UPDRS-Ⅲ评分、MMSE评分、MOCA评分等指标均无显著相关性(P>0.05)。结论:早发型PD患者红细胞中存在α-Syn异常沉积,红细胞来源α-Syn特别是α-Syn聚集体可作为早发型PD的生物标志物。     

制备与鉴定导致家族性帕金森病突变蛋白质的α-突触核蛋白聚合体

目的：制备和鉴定与家族性帕金森病发病有关的α-突触核蛋白突变体A53T与A30P的聚合体，为帕金森病患者的治疗乃至康复干预提供重要理论基础及靶点。方法：实验于2004—01／05在首都医科大学宣武医院北京老年医学研究所神经生物研究室完成。设计含适当酶切位点的聚合酶链反应引物，用聚合酶链反应法从质粒pBS-α-突触核蛋白(A53T)和pBS-α-突触核蛋白(A30P)合成α-突触核蛋白突变DNA，并将其亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体pGEX-4T-1。转化大肠杆菌B121，以异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导，使其表达融合蛋白GST-α-突触核蛋白(A53T)和GST-α-突触核蛋白(A30P)。用凝血酶定点分解融合蛋白，并用亲和层析法纯化突变的基因重组型人α-突触核蛋白。将重组蛋白在37℃下孵育2h制备蛋白聚合体。所制备聚合体用Westem blot分析法和透射电镜鉴定。结果：DNA测序结果证明构建载体插入正确α-突触核蛋白突变体A53T与A30P基因。基因表达产物在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带，分子量约为18ku，与所报道的该蛋白的分子量一致。Westem blot分析表明，所表达蛋白可被α-突触核蛋白特异性抗体识别，证明表达的重组蛋白为α-突触核蛋白，聚合后的α-突触核蛋白在108ku左右，相当于六聚体。聚合体在电镜下呈短的丝状结构。结论：制备出人重组α-突触核蛋白突变体A53T与A30P并建立其聚合体模型，这为帕金森病的病因研究提供重要的物质基础从而为帕金森病患者的康复提供新的靶点。     

抗人FcεRIα单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备鼠抗人IgE高亲和力受体FceRIa的单克隆抗体并对其进行初步鉴定,为过敏性疾病的相关研究提供条件。方法用人FceRIα重组蛋白作为抗原免疫BALB／C小鼠,常规方法进行融合,经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗人FceRIαmAb的杂交瘤细胞株,用ELISA、免疫荧光标记、荧光显微镜和流式细胞仪分析以及Western—Blot方法进行抗体的初步鉴定。结果筛选到2株可稳定分泌抗人FcεRIα单克隆抗体的细胞株,流式细胞术分析此2株抗体与CHO3D10细胞的结合率均大于95％,免疫荧光显示2株抗体均能与FcεRIα发生特异性反应。Western-Blot结果显示抗体轻重链分别约28Kd与50Kd。结论制备的两株FcεRIα的单克隆抗体可特异性与细胞表面FcεRI结合,可用于肥大细胞功能以及变态反应病临床治疗的进一步研究。     

铜绿假单胞菌VgrG1a蛋白的原核表达及其人鼠嵌合型单抗的制备与鉴定

目的：探究铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统VgrG1a蛋白的原核表达方法，并制备鼠源性和人鼠嵌合型单克隆抗体为抗铜绿假单胞菌感染提供了研究基础。方法：根据NCBI网站上查找到的VgrG1a序列合成重组质粒pET-21a-VgrG1a，转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）plysS进行诱导。通过免疫沉淀法和酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对诱导得到的重组蛋白进行表达、纯化和鉴定。用纯化后的VgrG1a重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠源多克隆抗体，并利用ELISA方法测定小鼠血清抗体的效价和特异性。通过P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞，再通过有限稀释法获得单克隆细胞。经多次ELISA筛选出能够稳定产出特异性抗体的细胞株。在公司测序后获得单克隆抗体的序列信息，并设计出含有此抗体的质粒，转染Expi293细胞，制备人源化单克隆抗体。结果：结果显示，实验成功构建了VgrG1a重组质粒，经探索在最佳表达诱导条件下（温度16℃，IPTG浓度0.5mM，诱导时间16小时），表达得到了重组蛋白VgrG1a，SDS-PAGE显示72kDa处重组蛋白浓度最高。检测制备的鼠源抗体在稀释到1/640000后效价仍较高，并且与目的蛋白能够能特异性的识别并结合。人鼠嵌合型单克隆抗体8A4F5对抗原VgrG1a亲和力高于鼠源单克隆抗体。结论：以上结果表明，该原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性，利用表达的重组蛋白制备的单克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性，为进一步研究蛋白的结构与功能、研制相关的诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

激动样活性抗α1-肾上腺素受体胞外第二肽段抗体的制备

目的：制备提纯抗α1-肾上腺素受体抗体，并对其生物学活性进行鉴定。 方法：实验于2003-02／12在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。①选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只，取4只用于抗α1-肾上腺素受体抗体的制备。将合成肽用戊二醛与牛血清白蛋白偶联，透析除去未结合的多肽，与等体积的弗氏佐剂混匀后于0，2，4，6，8周对大鼠进行免疫处理，4只／次。另2只作为未免疫对照。免疫前后鼠尾采血并用ELISA法检测抗体的滴度，α1-肾上腺素受体抗原的包被浓度50mg／L，血清稀释度从1：40开始倍比稀释，辣根过氧化物酶酶标抗体稀释度为1：2000。用阳性血清与阴性血清的吸光度之比来判定，比值≥2．1为阳性。免疫结束后采血，离心取上清，与等体积的生理盐水混合后逐滴加入饱和硫酸铵至浓度达50％，于磷酸盐缓冲液中透析。②以合成的α1-肾上腺素受体胞外第二肽段多肽为抗原，采用免疫亲和层析的方法．纯化用合成肽免疫大鼠产生的抗α1-肾上腺素受体多克隆抗体，用Bradford对抗体进行定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳检测抗体纯度，以ELISA法、免疫组化、免疫印迹方法进行抗体免疫活性分析，用激光共聚焦测量细胞内游离钙浓度变化以检测抗体的激动样活性。 结果：实验选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只，全部进入结果分析。①抗α1-肾上腺素受体抗体的产生和纯度：抗α1-肾上腺素受体抗体在大鼠免疫后2周开始产生，8周后达到很高滴度。提纯的抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定有较高的纯度。②纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的免疫学活性：抗体浓度为0．1g／L时滴度约1：2560，并可结合培养平滑肌细胞及心肌组织上的α1-肾上腺素受体，具有较好的反应原性。（3）纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的生物学活性：抗α1-肾上腺素受体抗体可显著升高分离的成年大鼠心肌细胞游离钙离子浓度，高达（139．6&;#177;15．5）％。该抗体的作用可被Prazosin阻断，降至（28．9&;#177;12．64）％，具有特异性及激动样活性。 结论：采用自制的免疫亲和层析柱可将合成肽免疫产生的具有激动样活性的抗α1-肾上腺素受体抗体纯化。     

亲和层析-质谱法鉴定细胞膜保守分子

背景：在生物进化中高度保守的抗原往往具有重要的生物学功能，也是不同种属动物执行相同或相似生物学功能的需要。然而细胞膜保守蛋白质分子的分离与鉴定仍然是蛋白组学的一个瓶颈。目的：探索鉴定细胞膜表面保守蛋白质分子的方法。设计、时间及地点：单一样本观察，于2006—09／2007—12在解放军第四军医大学免疫教研室完成。材料：BALB／c小鼠。Hela、293T、ECV304、Raii、Colo205、PLA801、7901、Jurkat、L929、SP2／0和CHO等细胞均由解放军第四军医大学免疫教研室冻存。方法：将人寓颈癌细胞系Hela免疫BALB/c小鼠，B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，应用Hela、人结肠癌细胞系Colo205、小鼠成纤维细胞系L929、3T3和中国仓鼠卵母细胞系CHO等细胞进行花环形成系统筛选共阳性杂交瘤，并应用Colo205、人Burkitt淋巴瘤细胞系Raii、人肺癌细胞系PLA801、人胃癌细胞系7901、人T细胞白血病细胞系Jurkat等肿瘤细胞系、胚胎细胞系人胚肾上皮细胞系293T、人脐静脉内皮细胞系ECV304、健康人外周血单个核细胞、小鼠细胞系L929、SP2／0、中国仓鼠细胞系CHO等对所制备的单克隆抗体进行活细胞免疫荧光染色和流式细胞仪鉴定。超速离心法提取Hela、R矧和小鼠Sp2／0细胞膜蛋白，亲和层析法纯化保守蛋白，SDS电泳后切下的目的蛋白带，应用质谱仪（LC-ESI-MS／MS）对酶解的肽进行氨基酸序列分析。主要观察指标：①红细胞花环形成筛选方法的建立。②筛选保守抗原单克隆抗体。③单克隆抗体对细胞膜蛋白的免疫沉淀。④质谱分析。结果：制备了1株可同时识别人肿瘤和胚胎细胞系、小鼠和仓鼠细胞系保守抗原的单克隆抗体Cl，并应用该抗体通过亲和层析和质谱分析发现了1个保守蛋白候选分子，是一个目前尚未命名的、含1个V样结构域和3个C样结构域的IgSF成员。结论：亲和层析质谱法是一种鉴定细胞膜保守分子可行性较好的方法。     

抗人凋亡诱导因子单克隆抗体的制备与鉴定

背景：凋亡诱导因子不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用。目的：制备抗人凋亡诱导因子单克隆抗体并进行生物学特性鉴定。方法：利用Ensembl数据库及DNA star软件包对凋亡诱导因子氨基酸序列进行分析,获得优势表位多肽,采用碳化二亚胺法将多肽与载体蛋白偶联制备完全抗原免疫动物,采用杂交瘤技术制备凋亡诱导因子单克隆抗体并纯化。结果与结论：间接ELISA法检测显示,免疫鼠腹水中抗人凋亡诱导因子单克隆抗体效价达到1：252400。Western blot结果显示,存在与抗原带一致的相对分子质量67000的特异条带。免疫组化检测结果显示,在结肠癌组织细胞中有棕色阳性颗粒表达,说明此抗体也可用于免疫组识化学染色。提示实验获得了高活性、高纯度、高特异性抗人凋亡诱导因子单克隆抗体。     

靶向CD151-整合素α6β1结合域的多克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备CD151-整合素α6β1结合域的多克隆抗体,探讨其免疫学特性。方法:化学合成CD151-整合素α6β1结合域的多肽CGQRDHASNIYKVEG-KLH,以此多肽免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定该抗体的效价,采用Western blotting、细胞免疫荧光染色、免疫组织化学染色的方法鉴定抗体+++。结果:成功获得抗CD151-整合素α6β1结合域的多克隆抗体,ELISA试验显示该抗体效价为1:64000,Western blotting结果显示该抗体有较好的特异性,细胞免疫荧光染色和免疫组织化学染色显示阳性染色定位于肝癌细胞膜和细胞浆。结论:制备的抗CD151-整合素α6β1结合域的多克隆抗体具有较高的效价和特异性,可用于Western blotting、细胞免疫荧光染色和免疫组织化学染色等试验,该多克隆抗体对肝癌抗复发的治疗具有重要意义,值得进一步研究。     

重组α-突触核蛋白对 SD大鼠黑质多巴胺能神经元的作用

目的 研究重组人全长α-突触核蛋白对大鼠黑质多巴胺能神经元的毒性作用. 方法 原核表达、鉴定α-突触核蛋白;雄性 SD大鼠 30只,随机分为α-突触核蛋白注射组、六羟多巴注射组及α-突触核蛋白和六羟多巴联合注射组.用立体定位的方法分别右侧黑质注射α-突触核蛋白,六羟多巴及α-突触核蛋白+六羟多巴,左侧黑质注射等量的生理盐水,测定大鼠纹状体多巴胺含量和黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元数目. 结果 六羟多巴和α-突触核蛋白+六羟多巴注射使注射侧多巴胺分别减少到对照侧的 36.98%和 21.79%,多巴胺能神经元数减少到 30.81%和 28.05%.而α-突触核蛋白注射对纹状体多巴胺和黑质多巴胺能神经元数目无显著影响. 结论 没有发现重组α-突触核蛋白对大鼠黑质多巴胺能神经元有明显的毒性作用.     

白血病干细胞的新型标志蛋白IL1RAP杂交瘤细胞的制备及其分泌单克隆抗体的检测

本研究旨在制备针对白血病干细胞表面标志蛋白IL1RAP（IL-1receptoraccessoryprotein）的特异性单克隆抗体并对其进行鉴定。用重组人IL1RAP作为抗原免疫BALB／c小鼠,通过常规杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2／0细胞经PEG融合,筛选阳性杂交瘤细胞株。分别应用EusA和Westernblot法对杂交瘤细胞上清中分泌抗体进行抗体类型、滴度和敏感性检测。分离人外周单个核细胞,检测所得抗体对细胞内源性抗原的特异性。结果表明,获得了8株可稳定分泌IL1RAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为3H6E10、486A6、8G1185、9E9F2、10D8A7、1C7H7、1D7G11和2D3D3;抗体类型鉴定为IgG1／K型;分泌的单克隆抗体能特异性识别单个核细胞表达的IL1RAP。结论：本实验成功制备了可稳定分泌IL1RAP单克隆抗体的杂交瘤细胞及其特异性的IL1RAP单克隆抗体,为将来有效清除体内白血病干细胞提供了新途径。     

帕金森病病因蛋白质：α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性的影响

目的：α-突触核蛋白是帕金森病的病因蛋白质之一，α-突触核蛋白与酪氨酸羟化酶具有相互作用。制备一个基因重组酪氨酸羟化酶，探讨α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性的影响。方法：实验于2004-05／11在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。将携带人酪氨酸羟化酶cDNA的基因重组质粒pGEX-TH转化BL21(DE3)细菌使其表达谷胱甘肽S转移酶-TH为标签的融合蛋白质，用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲和层析法纯化基因重组酪氨酸羟化酶，用高压液相色谱(HPLC)法分析酪氨酸羟化酶活性，将α-突触核蛋白添加至酪氨酸羟化酶的酶促反应体系中。观察基因重组型酪氨酸羟化酶制备生成物特点，以及α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性的作用。结果：①基因重组酪氨酸羟化酶约占菌体可溶性蛋白组分的1％，纯化的酪氨酸羟化酶在SDS-PAGE上表现为单一条带，可催化L-酪氨酸发生羟化反应生成L-多巴。②随α-突触核蛋白浓度递增，酪氨酸羟化酶活性有不同程度的下降。结论：原核表达方法可制备纯化度较高的人基因酪氨酸羟化酶，α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性具有抑制作用。