粪肠球菌溶血素cylL基因的原核表达

目的克隆表达粪肠球菌溶血素cylL基因,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增溶血素cylL基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET42a中,构建pET-cylL重组质粒。将pET-cylL质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经KpnI、XhoI酶切及测序鉴定,以IPTG诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot进行分析。结果PCR体外扩增cylL基因产物约206bp,成功构建了重组表达质粒pET-cylL;SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为39.6kD。结论成功构建粪肠球菌溶血素cylL基因的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。     

粪肠球菌心内膜抗原efaA基因转化株的构建及其对生物膜形成的影响

目的构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株,探讨efaA基因在肠球菌生物膜形成及感染性心内膜炎致病中的作用。方法PCR扩增粪肠球菌efaA基因,构建pAT28-efaA重组子,经PCR、双酶切及测序鉴定,将重组子转化到eraA野生株S14做为转化株（S14-pAT28-efaA）;同时将空质粒pAT28转化到野生株作为对照株（S14-pAT28）;IPTG诱导efaA表达,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。微量滴定板法测定生物膜形成能力。将s14、S14-pAT28、S14-pAT28-efaA分别接种到96孔板,37℃培养24h形成生物膜,结晶紫染色,测定孔板底部在595nm的0D值,比较efaA基因转化前后的生物膜形成能力。结果成功构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株;转化株的OD595值大于野生株及空质粒转化株,P〈0．05,空质粒转化株的OD595值与野生株比较差异无统计学意义,P〉0．05。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因有利于肠球菌生物膜的形成。     

刚地弓形虫peroxiredoxin基因的克隆表达与免疫原性分析

目的对刚地弓形虫peroxiredoxin(TgPrx)基因进行克隆、表达和免疫原性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入EcoRI和XhoI酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPrx的基因片段克隆到原核质粒pET30a(+)中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定,重组蛋白用Western blotting分析其免疫原性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出591bp的TgPrx基因片段,并成功构建重组质粒pET30a(+)/TgPrx;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中高效表达。重组蛋白的相对分子量约32kDa,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结论RH株刚地弓形虫peroxiredoxin可在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的表达及抗原性分析

目的在原核系统表达并初步鉴定细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)基因重组蛋白的抗原性。方法对已构建的重组质粒pMD-18T-EgTPx进行限制性酶切,获取目的基因片段后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-EgTPx,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,对表达产物纯化后用Western-blot方法和ELISA鉴定重组EgTPx蛋白的抗原性。结果构建的重组表达质粒pET30a-EgTPx阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定无基因突变,开放阅读框正确;含有pET30a-EgTPx重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为27 kDa,而且主要以包涵体形式存在;Western-blot和ELISA结果表明EgTPx重组抗原可以被棘球蚴感染羊阳性血清特异性识别。结论成功构建了pET30a-EgTPx表达质粒,EgTPx重组蛋白得到了高效表达,表达产物具有良好的抗原性。     

HIV-1 Vif的克隆、表达与活性检测

目的克隆HIV-1Vif基因,构建原核表达质粒,进行蛋白的表达及其生物学活性的检测。方法 PCR扩增Vif基因,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建原核表达质粒pET28a(+)/Vif,进行双酶切及测序鉴定。获得的阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,利用亲和层析方法纯化Vif蛋白。利用Pull-Down方法检测HIV-1Vif与SH3(HCK)特异性结合活性。结果通过酶切和测序,结果表明重组质粒pET28a(+)/Vif构建正确。SDS-PAGE和Western blot结果鉴定了原核表达的Vif重组蛋白大小正确。纯化了蛋白Vif、SH3和GST。GST pull-down试验说明Vif和SH3蛋白具有体外特异性结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了Vif蛋白,Vif与SH3蛋白具有结合活性,为进一步研究针对Vif与SH3结合的药物筛选提供实验依据。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因;将该基因克隆至原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj32并转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为42ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

重组人神经肽Y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-NPY转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析NPY蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a-NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白.重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了NPY的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-NPY在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对NPY蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化

目的克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列，构建原核重组表达质粒pET23a-M，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达、纯化。表达产物用Western Blot检测其抗原性。方法RT-PCR扩增M编码基因目的片段，胶回收纯化，插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DHSa。序列测定后亚克隆至表达质粒载体pET23a，构建重组体pET23a-M，转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，以限制性酶切分析鉴定后，转化大肠杆菌BL21（DE3）以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达。用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物。结果PCR扩增出约675bp的特异性片段，与预期片段大小相符，测序鉴定无有义突变；所构建的pET23α-M重组体阳性克隆经PCR与双酶切鉴定，与预期结果一致；SDS-PAGE显示表达产物约27kD；表达产物经金属螯和层析纯化；免疫印迹表明表达产物能被混合的SARS病人恢复期血清识别。结论成功克隆了SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列，构建了pET23α-M表达质粒，诱导表达并纯化出了SARS冠状病毒M蛋白，并以免疫印迹鉴定。本研究的成功为进一步进行SARS病毒诊断试剂与疫苗的开发奠定了基础。     

肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白的克隆表达及纯化

目的克隆肝螺杆菌（H.hepaticus）甲基基团接受趋化信号转导蛋白（MCP）基因,制备MCP重组蛋白,为以后检测我国人群肝螺杆菌感染率提供实验基础。方法利用PCR方法扩增目的基因片段,连接至原核表达载体pET22b（＋）,构建MCP的原核表达质粒pET22b＋/MCP。将质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组蛋白。结果构建了原核表达质粒pET22b＋/MCP,含有该质粒的大肠杆菌经1 mmol/L IPTG诱导4 h后表达一相对分子质量约14 kD的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析系统纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP。结论获得了肝螺杆菌MCP的纯化重组蛋白,为进一步利用血清学方法调查我国人群肝螺杆菌感染率提供可能。     

衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的克隆、表达及纯化

目的 构建含衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的原核表达载体,经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白,研究其生物学功能.方法 从病料中克隆得到CPAF的原始基因,将PCR产物经纯化连接到pMD18-T,将重组质粒pMD-CPAF经NdeI和BamHI双酶切,与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接,建立pET42b(+)-CPAF表达载体,阳性克隆经鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经亲和纯化、离子交换纯化、分子筛纯化融合蛋白,进行SDS-PAGE分析,Western印迹检测.结果 经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确.SDS-PAGE和Western印迹结果显示在70 kD处呈现单一蛋白条带,pET42b(+)-CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了CPAF天然蛋白,目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右,采用镍柱的亲和纯化后,可达70%左右.结论 经DNA测序、SDS-PAGE、Western印迹检测表明成功构建了能够稳定表达可溶性CPAF的菌株,并获得纯化CPAF的方法,为今后CPAF的研究及应用奠定了基础.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体Ns5atp4a基因原核表达载体的构建和表达

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体（NS5ATP4A）的原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增NS5ATP4A基因,克隆入pET32a（＋）质粒,构建pET32a（＋）-NS5ATP4A表达重组体,转化DH5α和BL21菌,经IPTG诱导。SDS-PAGE分析,Western Blot验证蛋白带。结果成功构建大肠杆菌原核表达载体。经IPTG诱导,得到了目的蛋白分子量为35kD,用Western Blot证实其具有良好的抗原性。结论构建原核表达载体pET32a（＋）-NS5ATP4A,为抗原的制备及临床检测奠定了基础。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M．tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MTBrv3873基因，并克隆入pGEM～TEasy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5a和BL21（DE3）菌后，经0．4mmol／L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出相对分子质量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni-NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得重组Rv3873蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达质粒的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌glcB基因原核表达工程株,并进行表达、纯化。方法用PCR 扩增结核分枝杆菌glcB基因, 并克隆入pTA2质粒。测序正确后, 再亚克隆入pET30a(+)质粒, 构建pET30a(+):glcB重组体,转化宿主菌大肠埃希菌BL21 (DE3)。结果结核分枝杆菌glcB基因工程株经0.4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,表达出相对分子质量为92kD重组蛋白。SDS-PAGE 分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中, 表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA 柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌glcB基因工程表达株,并获得GlcB重组蛋白, 为研究新型血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

猪链球菌2型中国强毒株CovR重组蛋白及其抗体的制备

目的通过构建pET32a-covR原核表达质粒,表达并提纯CovR重组蛋白,制备其多克隆抗体。方法采用PCR法,从四川资阳病人分离株05ZYH33基因组扩增CovR的编码基因covR,构建重组表达质粒pET32a-covR,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE鉴定后,His亲和层析柱纯化CovR重组蛋白;免疫新西兰兔制备特异性抗体,Western blot检测兔多抗血清的特异性,间接ELISA检测其滴度。结果covR基因在原核细胞中得到高效表达,重组蛋白免疫新西兰兔后血清效价高达1∶204800,且重组蛋白能够与之发生特异性的反应。结论成功构建了表达载体pET32a-covR,可在E.coliBL21中高效表达,制备了特异性抗体,为进一步研究CovR的调控机理奠定了基础。     

细粒棘球绦虫AgB8／1-AgB8／2重组嵌合抗原表达系统的构建

目的构建pET32a—AgBS／1-AgBS／2原核表达载体,并对其重组蛋自进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgBS／1和EgAgBS／2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人2r-合成EgAgBS／1-EgAgBS／2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm—T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm—T／AgBS／1-AgBS／2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8／1-AgBS／Z嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段E-确后,转化至E.coli BL21（DE3）Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgBS／1-AgBS／2重组嵌合蛋白。用SDS—PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgBS／1-AgBS／2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38kD处有表达条带。结论成功构建了pET32a—AgBS／1-AgBS／2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgBS／1-AgBS／2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶重组质粒的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)重组质粒pET32α-Sj26GST,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建pET32α-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot 对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET32α(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为49×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了pET32α-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.