CVB3-VP1 siRNA对CVB3复制的抑制作用

目的：观察柯萨奇B组病毒3型衣壳蛋白1（CVB3-VP1）特征性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对CVB3复制及VP1蛋白表达的抑制作用.方法：根据CVB3VP1基因的序列及其结构特征,设计并用化学方法合成小于扰RNA（siRNA）.以CVB3感染HeLa细胞,通过脂质体介导以siRNA转染HeLa细胞.48 h后,观察细胞病变的程度,用TCID5o法测定病毒滴度,免疫荧光法测定CVB3-VP1蛋白的表达,RT-PCR法检测CVB3-RNA的水平.结果：化学合成的4对针对CVB3-VP1的siRNA,发现其中有两对（VP1-1、VP1-2）对CVB3的复制具有明显的抑制作用,同时VP1蛋白的表达明显减少;细胞病变的程度也明显减轻.结论：CVB3-VP1siRNA可有效地抑制CVB3在HeLa细胞中的复制及表达VP1.     

短双链RNA对CVB3病毒细胞内清除作用的可行性研究及其机制探讨

目的 通过观察短双链RNA(Short interfering RNA,siRNA)体外转染HeLa细胞评价siRNA抗CVB3病毒感染的可行性和抑制作用机制.方法 通过细胞病变作用保护实验,选择合适的siRNA剂量.Western Blot、RT-PCR等方法在体外检测siRNA抗CVB3病毒复制作用及作用途径.结果siRNA-3753通过脂质体转染试剂能高效转入HeLa细胞,转染效率可达98.77%,在细胞内可稳定长达48 h.siRNA-3753的浓度为0.6 μmol/L对病毒抑制率高同时对细胞不会产生毒性作用,该浓度作为本次研究的实验剂量.siRNA-3753抗CVB3病毒感染作用是通过siRNA直接降解病毒基因得到的,而不是通过激活PKR或干扰素等其他未知因素起效的.结论 siRNA可以高效、较长时间的转染入HeLa细胞内,在低剂量时即产生较好的抗病毒感染作用,通过直接降解病毒基因组的途径特异性抑制CVB3病毒的复制及感染.     

RNA干扰对宫颈癌细胞中E6AP基因的影响及其意义

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对宫颈癌细胞系HeLa细胞E6AP基因表达及细胞增殖和凋亡的影响.方法 实验分为3组:空白对照组(未经转染的HeLa细胞)、转染阴性对照的小干扰RNA(siRNA)组及转染特异性E6AP siRNA组.采用半定量RT-PCR技术、Western blot方法 检测E6AP mRNA、蛋白表达水平,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖状况,用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 转染E6AP siRNA 24、48、72 h后,E6AP siRNA组E6AP mRNA表达水平与对照siRNA组比较下降33%、72%、70%.Western blot结果 显示,在转染48及72 h,E6AP蛋白表达下降38%、59%.MTT法检测显示,转染HeLa细胞24、48、72、96 h后细胞生长速度明显降低,E6AP siRNA组与空白对照组(F=101.38,P＜0.05)、对照siRNA组(F=38.64,P＜0.05)比较,差异均有统计学意义.E6AP siRNA作用24、48、72 h后E6AP siRNA组凋亡率明显高于对照siRNA组(F=41.48,P＜0.05)和空白对照组(F=86.36,P＜0.05),差异有统计学意义.结论 体外合成的siRNA能有效封闭宫颈癌细胞中E6AP基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供理论依据.     

小分子干扰RNA(siRNA)表达载体沉默靶基因的研究

目的研究siRNA表达载体在体外培养细胞中对目的基因的干扰作用，建立利用RNA干扰技术研究基因功能的平台。方法构建针对β-actin基因的表达siRNA载体，转染HeLa细胞，然后在mRNA水平、蛋白水平和细胞形态水平评价siRNA表达载体对β-actin基因表达的抑制作用。结果siRNA表达载体可以有效的抑制体外培养细胞β-actin基因的表达，使β-actin基因的mRNA和蛋白表达量显著下降，细胞形态发生显著变化。结论siRNA表达载体可以在体外培养细胞中有效的沉默β-actin基因，为研究基因功能提供了一个快速、有效的系统。     

siRNA沉默P21表达对细胞周期解偶联和细胞凋亡的影响

目的： 利用RNAi技术探讨P21蛋白表达对HeLa 细胞周期解耦联和细胞凋亡的影响。方法： 丝裂霉素刺激HeLa细胞后可诱导P21蛋白高表达，采用脂质体转染技术将p21 siRNA 载体转染至HeLa细胞48 h后给予MMC刺激，利用流式细胞术检测HeLa细胞的P21蛋白表达、 细胞倍体的形成和细胞凋亡的改变。结果： p21 siRNA 载体可有效干扰经MMC诱导的HeLa细胞中P21蛋白表达, MMC刺激后24 h和48 h细胞2倍体百分数明显少于对照组(P<0.01)，4倍体和8倍体细胞百分数明显多于对照组(P<0.01)。p21 siRNA沉默HeLa细胞p21后，凋亡细胞百分率明显高于空质粒对照组(P<0.01)。结论： p21 siRNA可有效沉默HeLa细胞P21蛋白表达，在P21蛋白低表达的情况下，HeLa细胞可通过p53非依赖途径诱导细胞死亡，可能与细胞周期解偶联和p53非依赖的细胞凋亡有关。     

Galecin-3在膜联蛋白A7表达抑制的HeLa细胞中的表达变化

目的探讨膜联蛋白A7(ANXA7)表达抑制的HeLa细胞galectin-3(gal-3)的表达改变。方法将细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组。采用RNA干扰技术将靶向ANXA7的siRNA和阴性对照siRNA脂质体2000转染法分别转染宫颈癌细胞系HeLa细胞,空白对照组不予任何处理。转染48h后采用Western blotting法和RT-PCR法分别在蛋白水平和mRNA水平进行抑制效果的鉴定。Western blotting和实时定量PCR法分别检测ANXA7表达抑制的HeLa细胞中galectin-3的表达改变。结果靶向ANXA7的siRNA可显著抑制ANXA7的表达;当ANXA7表达受抑后,galectin-3在HeLa细胞中的表达显著下降,与阴性对照组和空白对照组相比,差异有显著性(P0.05)。结论 ANXA7表达抑制的宫颈癌细胞系HeLa细胞中galectin-3的表达显著下调,这可能是ANXA7表达受抑的细胞行为学发生改变的机制之一。     

RICTOR对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞活力的影响

 目的：通过siRNA介导的RNA干扰技术沉默类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）mTORC2的特异组成蛋白RICTOR的表达,观察其对细胞活力的影响。方法：组织块法培养RA-FLS。应用阳离子脂质体转染的方法,把化学合成的特异性RICTOR siRNA转染RA-FLS,并以转染非特异性siRNA作为阴性对照。利用荧光定量PCR法分析转染24 h后细胞RICTOR mRNA表达水平的变化;Western blotting法分析转染48和72 h后细胞RICTOR蛋白表达水平的变化;以噻唑蓝（MTT）比色法检测转染成纤维样滑膜细胞不同时间（24、48和72 h）RICTOR siRNA对细胞活力的影响。结果：荧光定量PCR结果显示特异性RICTOR siRNA转染组与对照组相比,细胞中RICTOR的mRNA表达水平显著下调,24 h干扰效率达78.3%±63.71%（P<0.01）。Western blotting结果显示与对照组相比,RICTOR siRNA转染组48 h和72 h后RICTOR蛋白表达水平明显降低,沉默效率分别为92.48%±6.14%和98.57%±1.40%（均P<0.01）。MTT结果显示,早期（24和48 h）RICTOR siRNA转染组与阴性对照组细胞存活率比较无显著差异;72 h后,RICTOR siRNA转染组与阴性对照相比,细胞活力明显降低,抑制率为90.14%±1.90%（P<0.01）。结论：转染特异性RICTOR siRNA可降低RA-FLS的活力,提示mTORC2可能与RA-FLS的生长有关。     

RNA干扰CREB对缓激肽作用的胶质瘤细胞IL-1β分泌的影响

目的探讨转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的磷酸化是否介导了缓激肽刺激大鼠C6胶质瘤细胞内白细胞介素-1β(IL-1β)的表达。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,以CREB为靶基因,将体外化学合成的CREB序列特异性双链小干扰RNA(siRNA)和无关序列的siRNA分别与Lipofectamine2000结合后转染细胞,用Western blot分析CREB蛋白的表达水平。利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量技术和放射免疫法分别检测CREB siRNA转染前后,缓激肽诱导C6胶质瘤细胞IL-1βmRNA及细胞培养上清液中IL-1β的表达水平。结果CREB序列特异性siRNA转染细胞72h后,可较强的抑制CREB蛋白的表达,而无关序列的siRNA对CREB蛋白表达水平无明显的抑制作用。RT-PCR和放射免疫法结果均显示CREBsiRNA干预C6细胞后,并未改变缓激肽刺激IL-1β表达的能力。结论化学合成的siRNA可有效抑制C6胶质瘤细胞中CREB的表达,CREB可能未参与缓激肽刺激C6细胞IL-1β表达的信号转导过程。     

STAT3siRNA对肺腺癌A549细胞STAT3表达和细胞生物学行为的影响

目的:观察经RNA干扰沉默STAT3基因对人肺腺癌细胞A549生长和凋亡的影响。方法:设计并经化学合成了针对STAT3基因不同位点的3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列(STAT3siRNA1、STAT3siRNA2、STAT3siRNA3),在脂质体(LipofectamineTM2000)介导下转染人肺腺癌细胞株A549,采用RT-PCR法检测STAT3mRNA表达变化,筛选出抑制作用最强的STAT3-siRNA。免疫印迹法检测细胞STAT3、Cyclin D1、BAX、Bcl-2、Caspase-9蛋白表达。AM-BLUE法测定A549细胞体外增殖情况。流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:经RNA干扰能有效降低A549细胞STAT3mRNA表达水平(P0.05),转染STAT3siRNA后,A549细胞STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低(P0.05),而BAX、Caspase-9蛋白的表达水平升高(P0.05)。STAT3蛋白表达分别与CyclinD1、Bcl-2蛋白表达呈正相关(r=0.854,0.910,P0.05);与BAX蛋白表达呈负相关性(r=-0.848,P0.05);与Caspase-9蛋白表达呈无相关性(r=-0.787,P0.05)。RNA干扰法沉默STAT3基因表达后,A549细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加。结论:STAT3siRNA可有效抑制A549细胞STAT3表达,抑制A549细胞生长并促进其凋亡。     

鸟苷结合蛋白1对柯萨奇病毒B3及乙型肝炎病毒体外介导的不同作用

目的构建人鸟苷结合蛋白1（hGBP-1）真核表达质粒，观察hGBP-1体外对柯萨奇病毒B3（CVB3）和乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用。方法长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因，克隆到pCR2．1TA克隆载体，再亚克隆到pcDNA3．1（-）真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞，Western blot检测hGBP-1的表达。然后分别观察转染细胞中hGBP-1对HBV体外复制子pHBV1．3和CVB3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养L清HBsAg、HBeAg水平；Southern blot检测细胞HBVDNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞培养物中CVB3感染量。结果成功构建hGBP-1真核表达质粒，能在HepG2细胞和HeLa细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞，不能抑制HBV复制，HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。转染质粒在HeLa细胞上对CVB3复制有明显的抑制作用，CVB3感染量显著降低，尤其在低剂量病毒攻击时能完全抑制CVB3复制。结论hGBP-1可能在IFN介导的抗CVB3中起重要作用，但不能抑制HBV的复制。     

CVB3-VP1基因免疫诱导特异性抗病毒免疫应答及保护作用

目的 :构建表达柯萨奇病毒B3(CVB3)主要包膜蛋白VP1的基因疫苗 ,并研究该疫苗诱导CVB3特异性免疫应答及免疫保护的作用。方法 :抽提CVB3RNA ,以RT PCR扩增VP1基因 ,克隆于真核表达载体 pcDNA3中 ,构建质粒pcDNA3 VP1。将该质粒转染Hela细胞 ,观察其表达情况 ;以 5 0 μgpcDNA3 VP1质粒DNA肌注免疫BALB/c小鼠 3次 ,检测CVB3特异性体液和细胞免疫应答。间隔 4wk以 5×LD50 的CVB3攻击小鼠 ,观察攻击后小鼠的存活情况。结果 :构建了重组质粒 pcDNA3 VP1,并在体外获得有效表达。以该质粒肌肉免疫BALB/c小鼠 ,可诱生高水平的IgM和IgG ,VP1多肽特异性淋巴细胞增殖反应及CTL活性均显著高于 pcDNA3免疫的对照组。病毒攻击试验表明 ,pcDNA3 VP1免疫组33.3%小鼠可长期存活 ,其心肌组织未见明显的病理学改变 ;而对照小鼠平均仅存活 6 .7d ,心肌显示大量的局灶性坏死和炎性细胞浸润。结论 :pcDNA3 VP1免疫可诱生CVB3特异性体液及细胞免疫应答 ,保护免疫小鼠抵抗CVB3的致死性攻击     

Chitosan-pcDNA3-VP1 DNA疫苗预防病毒性心肌炎的实验研究

为研究新型chitosan DNA疫苗预防CVB3病毒性心肌炎的效果 ,以天然生物多糖chitosan包裹含CVB3主要结构蛋白VP1编码基因的质粒pcDNA3 VP1,制备新型chitosan pcDNA3 VP1疫苗。以含 5 0 μgDNA的该疫苗于 0、 7、 14、 2 1d滴鼻免疫小鼠 4次 ,末次免疫后 3周以 3×LD50 剂量CVB3经腹腔感染小鼠 ,称量小鼠体重、心脏重 ,并行心脏HE染色。结果 :chi tosan pcDNA3 VP1疫苗滴鼻免疫诱生了高水平的血清特异IgG和肠粘膜IgA ;同时诱生了较高强度的特异性CTL活性。以致病毒性心肌炎剂量CVB3感染小鼠 7d后发现 :pcDNA3组小鼠 10 0 %出现病毒性心肌炎 ,其心室壁呈现严重灶性坏死和炎性浸润 ;而chitosan pcDNA3 VP1组仅 16 7%小鼠产生心肌炎 ,坏死灶少且程度轻。其它病毒性心肌炎体征显示 :pcDNA3组体重降幅为 4 5 0 % ;而chitosan pcDNA3 VP1组类似正常小鼠 ,体重略增 1 75 % ;pcDNA3免疫组体重 /心脏重比为 171 75 ;chi tosan pcDNA3 VP1免疫组为 186 36。提示chitosan pcDNA3 VP1疫苗滴鼻可诱生全身及粘膜特异免疫 ,并可有效预防病毒性心肌炎的发生 ,可能成为CVB3及病毒性心肌炎预防性候选疫苗     

C家族趋化因子XCL1增强CVB3基因疫苗的抗病毒免疫应答及保护作用

为提高以往构建的基因疫苗pcDNA3.1-VP1的抗B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染的免疫效果,以编码C家族趋化因子XCL1的质粒pcDNA3.1-XCL1共注射,观察诱导的CVB3特异性免疫应答及CVB3病毒性心肌炎预防效果。将两种质粒各50μg混合后分别于0、2、4、6周肌注免疫小鼠4次,末次免疫后4周分别以5×LD50剂量CVB3攻击小鼠观察保护率,或以3×LD50剂量CVB3感染小鼠观察病毒性心肌炎的诱生。结果显示,与单纯pcDNA3.1-VP1质粒相比,XCL1质粒共注射可增强血清CVB3特异性IgG以及特异性CTL应答。5×LD50病毒攻击后,共注射组体重降低7.28%,而pcDNA3.1-VP1组体重降低10.97%;共注射组28 d保护率达40%,高于pcDNA3.1-VP1组的30%。3×LD50病毒感染后心肌组织病理显示,共注射组心外膜下仅有轻微炎症,心肌内未见炎症细胞浸润,而pcDNA3.1-VP1组除心外膜下有较多淋巴细胞聚集外,心肌内有少量炎症浸润和坏死灶。提示XCL1质粒共注射可增强CVB3特异性体液和细胞免疫应答及抗病毒保护,可有效预防病毒性心肌炎的发生。     

Properties of coxsackievirus B3 variants which are amyocarditic or myocarditic for mice.

Inoculation of adolescent CD-1 mice with one variant of coxsackievirus B3 (CVB3m) results in induction of readily observable myocardial lesions, whereas inoculation of siblings with a second variant (CVB3o) results in little or no myocarditis. These variants could not be distinquished from each other on the basis of replication properties in HeLa cells or cardiac tissues in vivo, sensitivity to human interferon in HeLa cells, induction of interferon in the mouse, generation of detectable levels of defective-interfering particles in HeLa cells or in cardiac tissue in vivo, stimulation of serum-neutralizing antibody titers, nor in their rate of clearance by the spleen. Infectivity of CVB3o was slightly more heat labile at 34 degrees C than CVB3m. Little if any replication of either CVB3o or CVB3m occurred in either adherent or nonadherent populations of normal murine lymphoid cells. Cardiac tissues from mice inoculated with CVB3m but not CVBo contain new antigens that can inhibit migration of sensitized lymphocytes from CVB3m-immunized mice in an in vitro cell-migration-inhibition assay. However, the CVB3o variant was shown to have the genetic capability of inducing myocarditis if the mice were treated with cyclophosphamide prior to virus inoculation. These results suggest, in agreement with our previously published work, that induction of myocarditis by CVB3 requires destruction of myocytes by virus and subsequent stimulation of cell-mediated responses to new antigens produced in the myocardium during virus replication.     

Galectin-9 administration ameliorates CVB3 induced myocarditis by promoting the proliferation of regulatory T cells and alternatively activated Th2 cells

In this study we explored the effects of galectin-9 on CVB3 induced myocarditis and its possible mechanisms involved. We demonstrated that galectin-9 expression was significantly up-regulated in the myocardium following CVB3 infection and was correlated with the severity of viral myocarditis. To explore whether galectin-9 may have therapeutic effect on the CVB3 induced myocarditis, galectin-9 was administered daily to mice following CVB3 infection. Significantly reduced CD4(+) T cells and remarkably increased regulatory T cells frequency in the heart tissue were found as compared to the non-treated mice. It was accompanied by a significant decreased level of Th1 cytokines as TNF-α and IFN-γ both in the myocardium and serum, and an increased level of Th2 cytokines such as IL-4 and IL-10. Galectin-9 was further found to promote the proliferation of regulatory T cells and elevated IL-4-secreting Th2 cells. It may represent as a novel therapeutic strategy in treating Th1-mediated inflammatory cardiac disease.     

Amelioration of coxsackievirus B3-mediated myocarditis by inhibition of tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-1

Coxsackievirus B3 (CVB3) is a major cause of acute myocarditis, a serious condition that is refractory to treatment. Myocardial damage results in tissue remodeling that, if too extensive, may contribute to disease. Remodeling is achieved by extracellular proteolysis mediated by the matrix metalloproteinases (MMPs), and MMP activity is counterbalanced by tissue inhibitors of MMPs (TIMPs). We show herein that TIMP-1 expression is induced in the myocardium by CVB3 infection. Surprisingly, TIMP-1 knockout mice exhibited a profound attenuation of myocarditis, with increased survival. The amelioration of disease in TIMP-1 knockout mice was not attributable to either an altered T-cell response to the virus or to reduced viral replication. These data led us to propose a novel function for TIMP-1: its highly localized up-regulation might arrest the MMP-dependent migration of inflammatory cells at sites of infection, thereby anatomically focusing the adaptive immune response. The benefits of TIMP-1 blockade in treating viral myocarditis were confirmed by administering, to wild-type animals, TIMP-1-specific siRNA or polyclonal antisera, both of which diminished CVB3-induced myocarditis. These unexpected findings indicate that increased TIMP-1 expression exacerbates, rather than ameliorates, CVB3-induced myocarditis and, thus, that TIMP-1 may represent a target for the treatment of virus-induced heart disease.     

柯萨奇病毒B3通过caspase依赖途径诱导HeLa细胞凋亡

目的 评价柯萨奇病毒B3（CVB3）致HeLa细胞死亡的方式及分子机制。方法 用CVB3作用于HeLa细胞,在不同时间收集细胞,通过相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪以及分子生物学手段,HeLa细胞的病变及caspase-3基因mRNA和蛋白质的表达。结果 CVB3作用于HeLa细胞后,细胞很快发生变性和坏死,24h后较多细胞凋亡;caspase基因在病毒作用早期即被活化,表现在caspase-3 mRNA在病毒作用后6h内,迅速增高达峰值。在24h内,又降至接近病毒作用前的水平。caspase-3蛋白表达在42h内逐渐增高。结论CVB3可诱导HeLa细胞发生坏死和凋亡两种反应,坏死早于凋亡,细胞凋亡与caspase-3的表达密切相关。     

siRNA阻断NF-κB信号通路抑制宫颈癌HeLa229细胞的增殖及侵袭

 目的 通过RNA干扰阻断宫颈癌HeLa229细胞中NF-κB信号通路，研究其与肿瘤细胞增殖、耐药和侵袭力的关系。方法 利用RNAi技术,将HeLa229分为转染组和对照组， MTT法检测细胞增殖， Boyden chamber体外侵袭实验检测细胞体外侵袭力。结果 MTT实验表明，转染组细胞存活率比对照组明显下降，联合应用化疗药，转染组和对照组细胞的存活率均随着5-Fu浓度的增加而下降，但在同一浓度，siRNA与5-Fu联合应用可明显提高HeLa229细胞对化疗药的敏感性。体外侵袭实验结果表明，和对照组相比，转染p65siRNA组穿越Matrigel胶的细胞数明显减少（P<0.05）。结论 应用RNAi 技术可有效阻断NF-κB信号通路, 抑制宫颈癌细胞的增殖和体外侵袭力，增强对5-Fu的敏感性。因此，可将NF-κB信号通路作为宫颈癌基因治疗的靶点。