半夏曲炮制过程中优势微生物的鉴定

研究半夏曲不同发酵时间点的微生物种类、数量变化以及优势菌种的分离鉴定,为探讨半夏曲炮制机制奠定基础。用选择性培养基对半夏曲发酵过程中5个时间点(0,18,36,54,72 h)样品中的细菌、霉菌、酵母菌分别进行培养、菌落计数、分离纯化优势菌种;采用16S rDNA,26S rDNA序列分别对优势细菌、优势真菌进行鉴定。结果表明,半夏曲发酵过程中细菌数量少、变化平缓,而酵母菌和霉菌数量发酵至54 h时迅速增加,至发酵结束时达1×10~7CFU·mL~(-1)以上;通过NCBI同源性比对及构建系统发育树,鉴定出半夏曲炮制过程中的优势细菌为Streptomyces sp.,Bacillus pumilus,B.subtilis,B.aryabhattai,Bacillus sp.;优势酵母菌为Meyerozyma guilliermondii;优势霉菌为Paecilomyces variotii,Byssochlamys spectabilis,Aspergillus niger。提示半夏曲的发酵过程涉及多种微生物共同参与,其中以酵母菌和霉菌为主。M.guilliermondii,P.variotii,P.variotii,A.niger和Bacillus sp.等优势菌种可能在半夏曲炮制中起重要作用。     

甘肃乌拉尔甘草野生与栽培品内生菌的分离及鉴定

目的：通过对甘肃乌拉尔甘草野生与栽培品内生菌的分离,对甘草同属不同品种内生菌的优势菌种进行初步鉴定,比较二者的生理活性差异。方法：采用NA、PDA培养基对甘草野生与栽培品内生菌进行分离和纯化,并以分离频率比较判断各自优势菌种。结果：野生甘草分离到内生细菌65株,内生真菌7株,优势菌种为青霉菌属和曲霉属;栽培甘草分离到内生细菌54株,内生真菌6株,优势菌种为青霉菌属;野生与栽培甘草的内生真菌分属于6个属,相同的有5个属,不同的2个属为丝核菌属和木霉属。结论：野生与栽培甘草具有相趋同数量和种类的内生细菌与内生真菌,但二者内生真菌的菌属及优势菌种存在明显差异。     

乌蒙山区小菇属萌发菌的分离鉴定及其菌种生产优化

目的:分离鉴定小菇属菌,扩展萌发菌种质资源和优化萌发菌培养条件,为天麻萌发菌菌种的生产提供资料和指导。方法:采用米麻组织块分离法和转接纯化培养技术进行菌株的分离纯化,运用传统形态学、显微技术对分离菌株的菌落、菌丝、孢子等形态特征进行鉴定,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增rDNA(Ribosomal DNA)内转录间隔区(ITS)进行测序分析,进一步与美国国家生物信息中心(NCBI)数据库进行同源性检索比对,利用MEGA6软件采用最大似然法(Maximum Likelihood,M-L)构建系统进化树,对分离菌株进行分类鉴定;同时,采用正交试验优化萌发菌生长条件。结果:分离获得86株菌株,分别属于12个属的21个物种,其中WMMFJ,SHXG,WMM-21和MFJ8103菌株鉴定为Mycena purpureofusca,ZT01-6和ZT01-8菌株鉴定为M. cf. purpureofusca。萌发菌在麦麸培养基上的生长速率显著快于PDA培养基,且萌发菌生长的最佳培养基组成为土豆100 g,麦麸150 g,玉米粉100 g,葡萄糖20 g;间苯三酚的2种浓度对WMMFJ菌株有显著促进生长作用,对WMM-21和ZT01-6菌株有促进作用;2-甲氧基酚的2种浓度对WMMFJ菌株也具有促进作用。结论:新分离鉴定6株萌发菌菌种,其中4株为M. purpureofusca,2株为M. cf. Purpureofusca,采用的分离方法提高了萌发菌菌株的分离效果。     

金蝉花菌种的分离和培养

目的:探讨金蝉花真菌分离及液体发酵培养。方法:从孢子分离真菌,并采用液体培养基观察菌丝生长状况。结果:分离得到的菌种为拟青霉属蝉拟青霉,液体培养基表面覆盖菌丝,且出现了白色菌落带。结论:从金蝉花孢子分离得到蝉拟青霉,可以用液体培养基培养。     

恒山黄芪内生真菌Rhizopus sp.次生代谢产物的分离和鉴定

目的:研究恒山黄芪内生真菌Rhizopus sp.的次生代谢产物的类别。方法:通过组织学的方法从恒山黄芪中分离到AR02,真菌的鉴定采用形态学法结合分子生物学法,内生真菌大量发酵采用固体培养的方法,次生代谢产物的分离采用硅胶柱色谱法,Sephadex LH-20凝胶色谱法结合HPLC进行分离纯化,分离到的代谢产物的化学结构通过理化分析测定结合光谱分析进行鉴定。结果:从黄芪根部分离到的内生真菌AR02被鉴定为根霉属Rhizopus sp.,从该菌株的固体发酵产物中分离得到7个化合物,经结构鉴定,分别为色胺酮(1),lawsaritol A(2),曲菌酸(3),trypacidin(4),monomethylsulochrin(5),emodin 8-Omethylether(6)和cannabifolactone A(7)。结论:化合物1~3,6和7均为首次从恒山黄芪内生真菌中分离得到,且黄芪内生真菌Rhizopus sp.的次生代谢产物呈现出多个类别,可以作为活性物质的新来源。     

铁皮石斛内生真菌的分离及其体外抑菌和抗肿瘤活性初步研究

目的分离铁皮石斛Dendrobium officinale内生真菌,研究内生真菌的分布并初步探讨和筛选具有抑菌和抗肿瘤活性的特异菌株。方法利用组织分离法和分子生物学方法分离、鉴定内生真菌;以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌作为受试对象,采用对峙法和管碟法分别对内生真菌及其发酵代谢产物的醋酸乙酯萃取相进行抑菌实验;采用MTT法对内生真菌代谢产物醋酸乙酯萃取相进行体外抗肿瘤活性检测。结果从铁皮石斛中分离得到28株内生真菌,分子鉴定结果显示,分离的内生真菌归属于10个属,其中镰刀菌属为优势属。抑菌实验结果显示28株内生真菌中,有7株至少能对1种指示菌有抑菌作用,其代谢产物的醋酸乙酯萃取相对3种指示菌和Hep G2细胞具有不同程度的抑制作用。结论铁皮石斛内生真菌种群丰富,从中分离得到的内生真菌具有潜在的抑菌和抗肿瘤活性,为进一步开发抑菌、抗肿瘤候选药物奠定基础。     

见血封喉内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究

目的 分离和鉴定见血封喉Antiaristoxicaria根韧皮部中的内生真菌,并检测其抑菌活性.方法 以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistant Staphylococcus gtureus (MRSA)和白色念珠菌Candida albicans作为指示菌,采用杯碟法对内生真菌发酵上清液进行抑菌试验.结果 从见血封喉根的韧皮部中分离出6株内生真菌,经形态鉴定分属于聚端孢霉属(Trichothecium LK.ex Fr.)、枝顶孢霉属(Acremonium LK.ex Fr.)和丝核菌属(Rhizoctonia DC.ex Fr.).其中内生真菌J6的发酵上清液对MRSA有抑菌活性,抑菌圈直径为18 mm.结论 首次对见血封喉内生真菌进行了研究,内生真菌J6对MRSA有明显的抑菌活性,其抑菌活性成分值得进一步研究.     

蝉花真菌的分离及液体发酵培养

目的:探讨蝉花真菌分离及液体发酵培养。方法:从蝉花僵虫体、子座芽、孢子分离真菌,并采用三种液体培养基考察菌丝收率。结果:分离得到的蝉花真菌经鉴定为拟青霉属的蝉拟青霉。在含蚕蛹粉、鸡蛋等动物性成分的液体培养基中培养4天,菌丝收率135 g/L。结论:从蝉花分离得到的蝉拟青霉,可用液体发酵培养。     

六神曲中真菌的分离与鉴定

目的：对传统工艺发酵六神曲中真菌进行分离与鉴定研究。方法：采用平板划线法和菌丝顶端纯化法从传统发酵六神曲分离真菌,使用生物显微镜进行显微形态学鉴定,DNA测序进行分子生物学鉴定。结果：从传统发酵六神曲分离并确定3株真菌分别为曲霉属真菌黄曲霉菌,青霉属真菌产黄青霉菌以及枝孢属真菌枝孢霉菌。黄曲霉菌和产黄青霉菌发酵六神曲气味纯香,表面遍布白衣略有黄衣出现与传统发酵相似;枝孢霉菌发酵六神曲产生霉腐气味,曲块表面暗灰褐色与传统发酵差别大,推测枝孢霉菌为六神曲发酵中产生的杂菌。结论：从传统方法发酵的六神曲分离得到3株真菌,经形态学鉴定及分子生物学鉴定,确定3株真菌分别为曲霉属真菌黄曲霉菌,青霉属真菌产黄青霉菌以及枝孢属真菌枝孢霉菌,为六神曲有效菌群的筛选提供了重要的物质基础研究。     

高山红景天内生真菌的分离及产红景天苷菌株的筛选

目的分离和鉴定珍贵药用植物高山红景天根及根茎中的内生真菌,并从中筛选出可产红景天苷的菌株。方法用PDA培养基,通过组织分离法从高山红景天根及根茎中分离内生真菌,并采用传统的鉴定方法对纯化后的菌株进行分类鉴定。通过薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)对分离得到的内生真菌发酵产物进行检测来获得产红景天苷的菌株。结果分离获得内生真菌20株,初步鉴定为3目、5科、9属。其中镰孢霉属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)为优势种群。经TLC和HPLC法筛选得到一株可代谢产生活性物质红景天苷的内生真菌G5。结论高山红景天内生真菌在数量和种类上存在极其丰富的多样性;而且其内生真菌具有产生与其宿主相同或相似生理活性成分的能力。     

淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定淡豆豉炮制过程中产纤溶酶的优势菌株。方法 按《中国药典》2020年版制备淡豆豉；采用酪蛋白平板法和纤维蛋白平板法分别对淡豆豉炮制不同时间点样本中产纤溶酶的微生物进行初筛和复筛；将产纤溶酶微生物分别接种在特定的液体培养基中培养，获得纯种发酵液，用纤维蛋白平板法测定发酵液的纤溶酶活力；应用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对产纤溶酶细菌和真菌进行PCR扩增、对扩增产物进行测序，测序结果通过NCBI同源性比对、MEGA 4.1软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定。结果 筛选获得3种产纤溶酶细菌，分别为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、微球菌Micrococcus。纤维蛋白平板法测定纯种发酵液纤溶酶活力的结果显示，嗜麦芽窄食单胞菌所产纤溶酶活力最高，达527.49 IU/mL。结论 淡豆豉炮制过程中存在高产纤溶酶的优势菌株，淡豆豉的溶栓作用值得进一步研究。为揭示淡豆豉炮制中纤溶酶形成机制奠定基础。     

桃儿七茎部产鬼臼毒素类成分的内生真菌筛选及鉴定

目的:筛选和鉴定濒危藏族药桃儿七茎部产鬼臼毒素类成分的内生真菌,为保护桃儿七植物资源和发现新的天然活性菌株提供参考。方法:采用组织块法对桃儿七茎部的内生真菌进行分离,利用TLC和HPLC检测其代谢产物中的鬼臼毒素类成分,检测波长254 nm,流动相乙腈-水(40∶60)。采用形态学和分子生物学相结合的方法对产鬼臼毒素类成分的内生真菌进行鉴定。结果:共分离得到9株内生真菌,其中菌株J-1,J-2,J-3的发酵液中含有鬼臼毒素类成分,分别鉴定为Chaetomium globosum strain MF564,C.sp.4RF3和Pseudallescheria sp.T55。结论:从桃儿七茎中分离到3株产鬼臼毒素类成分的内生真菌,分别来源于2个新属的不同种菌株,为开发新绿色生物能源和实现内生真菌工业发酵生产鬼臼毒素类成分奠定了理论基础。     

半夏及其炮制品化学成分及功效的差异研究

目的研究半夏及其不同炮制品化学成分及功效的差异。方法采用HPLC法测定半夏及其炮制品清半夏、姜半夏、法半夏水提取物中8种有效成分肌苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸、盐酸麻黄碱、甘草苷、甘草酸铵、6-姜辣素含量;通过小鼠气管段酚红法和浓氨水刺激小鼠引咳法对半夏传统功效祛痰、止咳进行药效学研究。结果半夏炮制品中肌苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸、盐酸麻黄碱含量较半夏生品明显下降,法半夏中未检出肌苷。3种炮制品相比,清半夏中肌苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸含量最高,姜半夏最低,与祛痰作用强弱一致,该4种成分是祛痰作用的活性成分,清半夏炮制时加入白矾,也增强其化痰功效;法半夏止咳作用最强,其次为半夏、清半夏,姜半夏作用最弱,法半夏经甘草、石灰水制后,辅料甘草(引入甘草苷、甘草酸铵)的加入增强了法半夏止咳作用。姜半夏经生姜、白矾制后,生姜(引入6-姜辣素)增强姜半夏止呕作用,减弱化痰、止咳作用。结论半夏炮制后化学成分及功效均发生一定变化,不同炮制方法对其化学成分和功效的影响不同。     

40株银杏内生真菌抗菌活性比较及其活性成分研究

目的比较银杏内生真菌的抗菌活性,并对其抗菌活性成分进行分析。方法采用组织分离法从健康银杏叶、枝条、果实等组织中分离、纯化内生真菌;以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、酿酒酵母、黑曲霉和根霉为抑菌指示菌,采用滤纸片和平板孔阱扩散法,对40株银杏内生真菌发酵液抗菌活性进行初筛和复筛;利用硅胶柱色谱、凝胶Sephadex LH-20柱色谱、制备型HPLC、薄层色谱(TLC)和HPLC-MS等方法,对抗菌活性较高的草酸青霉菌Penicillium oxalicum YXY009菌株的抗菌成分进行分析。结果 40株银杏内生真菌中,18株为不产孢真菌;产孢真菌中,青霉属和曲霉属为优势菌属,分别占总菌数的17.5%和15.0%;YXY009菌株发酵液的抑菌活性明显高于其他菌株,对酿酒酵母和根霉抑菌圈直径分别达到(22.35±1.32)和(23.60±0.83)mm;从YXY009菌株发酵液中分离得到抑菌活性有效成分,初步鉴定为毛果杨苷。结论首次从银杏内生真菌代谢产物中分离出具有广谱抗菌活性的化合物毛果杨苷。     

植物内生真菌Periconia sp. F-31中的一个新内酯类化合物

对一株番荔枝内生真菌Periconia sp. F-31中的次生代谢产物进行研究。通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备HPLC等方法分离纯化得到了2个化合物,根据波谱学方法分别鉴定为5-(1-羟己基)-6-甲基-2H-吡喃-2-酮(1)、2-(3-羟基-4-甲基苯)-丙酸(2)。化合物 1 为新化合物,化合物 2 为新的天然产物,首次对化合物 2 的NMR数据进行了报道。     

川芎内生真菌次级代谢产物中1个新的内酯化合物

目的研究川芎内生真菌Alternaria sp. IS275代谢产物的化学成分。方法采用硅胶和葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱、反相中压液相色谱、制备薄层色谱以及半制备高效液相色谱等分离技术,对川芎内生真菌发酵液的醋酸乙酯提取部位进行分离纯化,利用现代波谱学手段对分离的化学成分进行结构鉴定。结果从川芎内生真菌Alternaria sp. IS275代谢产物的醋酸乙酯提取部位分离得到1个新的内酯类化合物,鉴定为(+)-4,11-二羟基-2-十二烯-5-内酯。结论化合物1为首次从川芎内真菌中分离得到的新内酯化合物,命名为芎孢内酯A。     

产冬凌草甲素菌株筛选鉴定及其抗肿瘤活性研究

目的对冬凌草内生真菌进行筛选鉴定,并研究其体外抗肿瘤活性,以期得到冬凌草甲素高产抗肿瘤活性菌株。方法采用TLC法和HPLC法对前期从冬凌草中分离出的256株内生真菌进行筛选,HPLC-MS测定菌株发酵液中的冬凌草甲素。结合形态学特征、ITS序列对筛选出的菌株进行鉴定。MTT法测定筛选菌株的体外抗肿瘤活性。结果从冬凌草中分离出的256株内生真菌经筛选,获得1株冬凌草甲素高产菌株M-J-5,鉴定为青霉属草酸青霉菌Penicillium oxalicum Currie et Thom,其对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞活性具有一定抑制作用。结论从冬凌草内生真菌中筛选得到产冬凌草甲素且具抗肿瘤活性的菌株M-J-5。     

不同发酵时间对西瓜霜抗菌活性的影响及其有效部位筛选

目的考察不同发酵时间对西瓜霜抗菌活性的影响,并对最佳发酵时间制得的西瓜霜进行有效部位筛选。方法选择常见致病菌(多为口腔、上呼吸道致病菌),采用体外试管法抑菌实验和平板法杀菌实验,对发酵7、15、22、30、50 d的西瓜霜进行抗菌活性比较;以甲醇提取发酵15 d的西瓜霜制得西瓜霜甲醇提取物,进一步以AB-8大孔吸附树脂对西瓜霜甲醇提取物进行分离,得到甲醇提取物的水洗脱部位和95%乙醇洗脱部位,比较西瓜霜甲醇提取物与其水洗脱部位和95%乙醇洗脱部位的抗菌活性,筛选有效部位。结果发酵15 d制备的西瓜霜抗菌活性最强;西瓜霜甲醇提取物的大孔吸附树脂95%乙醇洗脱部位对福氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、柠檬葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型溶血性链球菌、乙型副伤寒杆菌和大肠杆菌具有明显抗菌作用。结论发酵时间对西瓜霜的抗菌活性具有显著影响,西瓜霜抗菌作用的有效部位为其甲醇提取物的大孔吸附树脂95%乙醇洗脱部位。     

水仙内生真菌的分离及抑菌和抗肿瘤活性研究

目的 分离纯化水仙根茎中的内生真菌,并对分离得到的真菌进行抑菌和抗肿瘤活性筛选。方法 用组织分离法分离纯化水仙内生真菌后,以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli、绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae和人肝癌细胞HepG2作为受试对象,采用滤纸片法和MTT法对内生真菌菌株发酵液的醋酸乙酯提取物进行抑菌和抗肿瘤活性检测。结果 从水仙根茎共分离到18株内生真菌,各菌株发酵液的醋酸乙酯提取物对4种供试细菌和HepG2细胞都有抑制作用。在质量浓度10 mg/mL时,SX-R202和SX-S102对大肠杆菌和绿脓杆菌抑菌圈直径分别达到18 mm和20 mm;在质量浓度1 mg/mL时,SX-R201、SX-R202、SX-R203和SX-R204对HepG2细胞增殖抑制率分别为（86.0±1.1）%、（89.8±1.3）%、（62.9±0.9）%和（90.6±1.0）%。结合形态学特征和分子生物学鉴定确定SX-R201为尖孢镰刀菌属Fusarium sp. 菌株、SX-R202和SX-R203为青霉属Penicillium sp. 菌株、SX-R204和SX-S102为曲霉属Aspergillus sp. 菌株。结论 水仙内生真菌的抑菌和抗肿瘤效果明显,值得进一步研究。