存活蛋白反义寡核苷酸对XWLC-05细胞的影响

目的 研究存活蛋白反义寡核苷酸对宣威肺腺癌细胞株(XWLC)-05增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法 通过设计合成XWLC-05靶向存活蛋白反义寡核苷酸.将其分为对照组、单纯脂质体组(Lip组)、正义寡核苷酸转染组(Lip-SODN组)、反义寡核苷酸转染组(Lip-ASODN组).转染48 h后,蛋白质印迹法检测各细胞组中存活蛋白表达情况,流式细胞仪检测各细胞组凋亡率.结果 转染后的XWLC-05 存活蛋白表达明显下降.Lip-ASODN组细胞在12、24、48 h凋亡率分别为3.01±0.26、7.89±2.63、17.24±3.92,明显高于其他组(P<0.05).结论 存活蛋白反义寡核苷酸转染能下调宣威肺腺癌细胞株XWLC-05存活蛋白表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖.     

Survivin反义核酸影响A549肺癌细胞增殖和凋亡的研究

目的 研究Survivin反义寡核苷酸对A549细胞增殖和凋亡的影响.方法 针对Survivin mRNA序列设计了反义寡核甘酸,转染A549细胞,PT-PCR检测细胞中survivin基因的mRNA含量;Western印迹显示Survivin蛋白水平;以MTT法检测细胞增殖,TUNEL法检测细胞凋亡.结果 Survivin反义寡核苷酸可明显降低A549细胞中survivin的mRNA和蛋白水平.MTT比色法结果说明人Survivin反义寡核苷酸抑制A549细胞增殖,抑制率远高于无义寡核苷酸组和空白对照组.TUNEL法检测结果显示,反义寡核苷酸还显著增强A549细胞对抗肿瘤药高三尖杉酯碱的敏感性,在较低高三尖杉酯碱浓度下,反义寡核苷酸转染细胞的凋亡率明显高于其它对照组.结论 sur-vivin反义寡核苷酸有望应用于肿瘤的辅助治疗之中.     

反义核酸对人结肠癌SW480细胞存活素表达和增殖的抑制

目的:研究存活素(Survivin)反义寡核苷酸对人结肠癌SW480细胞增殖的影响.方法:针对Survivin mRNA 序列设计了反义寡核甘酸,转染SW480细胞;RT-PCR检测细胞中Survivin 基因的mRNA 的表达,Western blot显示Survivin蛋白水平,以MTT法检测细胞增殖.结果:Survivin 反义寡核苷酸可明显降低SW480细胞中Survivin 的mRNA 和蛋白水平;MTT比色法结果说明人Survivin 反义寡核苷酸抑制SW480细胞增殖,抑制率远高于反义寡核苷酸组和空白对照组.结论:Survivin反义寡核苷酸能有效的下调SW480细胞Survivin的表达,同时抑制细胞增殖,有望应用于人结肠癌辅助治疗之中.     

Rb反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞凋亡及化疗药敏的影响

目的:观察Rb反义寡核苷酸(AS—ODN)对人成骨肉瘤(MG-63)细胞凋亡及化疗药物敏感性的影响。方法:人工合成RbAS—ODN、S—ODN(正义寡核苷酸)经脂质体(Lip)包裹转染MG-63细胞。采用Westem Blot检测转染前后Rb蛋白表达状况，流式细胞术测定MG-63细胞转染前后阿霉素(Adriamycin，ADM)诱导细胞凋亡程度，MTT法观察化疗药敏的变化。结果:经Rb AS—ODN处理的MG-63细胞Rb蛋白表达量明显下降，RbAS—ODN处理的MG-63细胞加ADM作用后与对照组比较，细胞凋亡率明显下降，化疗药物敏感性降低。结论:RbAS—ODN阳离子脂质体转染具有抑制化疗药诱导骨肉癌MG-63细胞凋亡的作用及降低化疗药物敏威性作用。     

反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞组织蛋白酶L表达的影响

目的　观察合成人组织蛋白酶L(CATL)基因的反义脱氧寡核苷酸转染后对人骨肉瘤MG 63 细胞系中CATL表达的影响。方法　人工合成正义、反义及无意义CATL基因片段,转染人骨肉瘤细胞MG 63,免疫细胞染色观察CATL的表达,RT PCR和Western blot检测CATL的mRNA和蛋白质表达水平的变化。结果　CATL反义寡核苷酸对MG 63 细胞的CATL的表达有明显的抑制作用,与正义链组、无意义链组和空白对照组相比有显著差异(P<0.05)。结论　反义寡核苷酸的转染可阻遏骨肉瘤细胞中CATL的表达。     

survivin反义寡核苷酸对K562细胞增殖的抑制作用

目的:采用反义寡核苷酸技术研究凋亡抑制基因survivin对白血病细胞增殖的影响.方法:1.细胞抑制率实验分5组:111nmol/L反义寡核苷酸组、333nmol/L反义寡核苷酸组、555nmol/L反义寡核苷酸组、777nmol/L反义寡核苷酸组、空白组.转染后24、48、72h收集细胞进行检测:用台盼蓝染色进行活细胞计数,计算细胞抑制率.2.细胞周期及survivin蛋白表达实验分4组:555 nmol/L寡核苷酸组、544nmol/L无义组、脂质体组、空白组,转染后24、48h流式细胞仪检测细胞周期;免疫组织化学方法检测survivin蛋白水平.结果:不同浓度的反义寡核苷酸对K562细胞的细胞抑制率均高于空白组(P<0.05),并随反义寡核苷酸的浓度增大抑制率增加;随作用时间延长,抑制作用越明显,抑制率与浓度及时间呈正相关;555nmol/L反义寡核苷酸作用后,K562细胞被阻滞在G0/G1期,细胞周期进程受到明显阻滞,而无义、脂质体、空白组细胞周期进程无明显变化(P<0.05);反义寡核苷酸作用48h后survivin蛋白表达水平明显降低,与各对照组比较有显著性差异(P<0.05).结论:survivin反义寡核苷酸能抑制K562细胞的增殖.     

反义PCNA基因片断抑制胶质瘤U251细胞增殖

目的 研究反义PCNA基因片断对胶质瘤细胞株U251的细胞增殖的抑制作用。方法 用脂质体介导寡核苷酸转染培养的U251胶质瘤细胞，以MTT法检测细胞增殖活性，RT-PCR、原位杂交和免疫组织化学方法分别检测相关基因和蛋白的表达，通过流式细胞仪检测细胞周期和TUNEL法检测细胞凋亡。结果 不同浓度的反义寡核苷酸对肿瘤细胞的增殖活性均有抑制作用，且有一定的剂量依赖性。PCNA反义寡核苷酸能够诱导胶质瘤细胞凋亡，且与反义寡核苷酸浓度和作用时间有关。结论 反义PCNA寡核苷酸片断能有效地抑制胶质瘤细胞的体外增殖，且能够诱导胶质瘤细胞的凋亡。     

反义EGFR寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ促VSMC增殖的影响

目的探讨脂质体介导的反义表皮生长因子受体寡核苷酸基因转染对血管紧张素Ⅱ促大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．方法用反义表皮生长因子受体寡核苷酸脂质体复合物转染Sprague—Dawley大鼠血管平滑肌细胞，通过RT—PCR、Western—Bloting分别检测转染后EGFRmRNA及蛋白的表达情况，用^3H—Tdr掺入率实验检测经反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染再用血管紧张素Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞的增殖情况，结果反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染大鼠血管平滑肌细胞后，EGFRmRNA及蛋白的表达较正义组及对照组明显减少（P〈0．05）；用血管紧张素Ⅱ刺激后，反义组细胞的^3H—Tdr掺入较正义组及对照组明显降低，经方差分析两者有显著差异（P〈0．05），结论脂质体介导的反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染减弱了血管紧张素Ⅱ的促血管平滑肌细胞增殖效应，证明了表皮生长因子受体在血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖中起重要作用．     

环氧合酶-2反义寡核苷酸对宫颈癌Hela细胞顺铂敏感性的影响

目的研究COX-2反义寡核苷酸(AS-ODNs)对宫颈癌Hela细胞顺铂敏感性的影响。方法体外设计、合成针对COX-2的反义寡核苷酸,并转染宫颈癌Hela细胞,应用细胞蛋白印记法(West-blot)测定转染COX-2反义寡核苷酸后Hela细胞COX-2基因蛋白的表达变化,应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测(MTT)COX-2反义寡核苷酸转染后Hela细胞对顺铂敏感性的变化。结果转染针对COX-2的反义寡核苷酸后,在24、48和72h,Hela细胞COX-2蛋白的表达水平下降;在转染48h后,Hela细胞对顺铂的半数抑制量从(10.475±1.713)μg/ml提高到(0.194±0.021)μg/ml,Hela细胞对顺铂的敏感性增加了53.88倍。结论COX-2反义寡核苷酸能增加宫颈癌Hela细胞对顺铂的敏感性。     

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

Inhibitory effects of PIN1 antisense gene on the proliferation of human osteosarcoma cells

INTRODUCTION Phosphorylationofproteinsonserineorthreonineresiducesprecedingproline(Ser Thr pro)isama jorintracellularsignalingmechanism.Recentworkindi catesasthefirststep,thephosphorylatedSer Thr pro motifsmustbeisomerizedspecificallybythepeptidyl prolylcis transisomerasePIN1.Thispost phosphoryla tionisomerizationcanleadtocomformationalchangesin thesubstrateproteinsandmodulatetheirfunctions[13].PIN1interactswithmorethan20mitoticphosphoproteins andplaysacriticalroleinoncogenesissuchascy…     

Construction of Antisense Transforming Growth Factorβ_1 Gene and Its Effect on the Proliferation by Expression in Osteosarcoma Cells

Summary:To construct the antisense transforming growth factorβ1(TGFβ1)gene and investigatethe effect of TGFβ1 autocrine loop blockage on the proliferation of osteosarcoma cells.TGFβ1 cDNAwas cloned by RT-PCR from human osteosarcoma cells(MG-63)and inserted into pcDNA_3 to con-struct an antisense expression vector,which was dubbed pcDNA_3-TGFβ1(-).MTT was used to de-tect the proliferation of osteosarcoma cells transfected by antisense TGFβ1 gene.Our results showedthat the proliferation of the transfected osteosarcoma cells was suppressed markedly.It is concludedthat TGFβ1 autocrine loop blockage in osteosarcoma cells could inhibit cell proliferation,which mightbe helpful for gene therapy of osteosarcoma.     

血管内皮生长因子反义核苷酸对口腔鳞癌细胞的影响

目的探讨VEGF反义核酸对口腔鳞癌细胞的影响。方法利用脂质体将VEGF反义核酸导入口腔鳞癌KB细胞，采用ELISA法检测其培养上清液中的VEGF表达水平，用MTT检测肿瘤细胞生长状况，过氧化物酶的抗荧光素抗体法检测肿瘤细胞凋亡指数。结果经VEGF反义核酸处理后，肿瘤细胞的VEGF蛋白表达水平和细胞生长受到明显抑制，肿瘤细胞凋亡率显著增加。结论VEGF反义核酸通过阻止VEGF蛋白表达和促进细胞凋亡，对口腔鳞癌细胞有明显的抑制作用。     

Construction of antisense transforming growth factorβ<Subscript>1</Subscript> gene and its effect on the proliferation by expression in osteosarcoma cells

Summary To construct the antisense transforming growth factorβ1 (TGFβ1) gene and investigate the effect of TGFβ1 autocrine loop blockage on the proliferation of osteosarcoma cells. TGFβ1 cDNA was cloned by RT-PCR from human osteosarcoma cells (MG-63) and inserted into pcDNA₃ to construct an antisense expression vector, which was dubbed pcDNA₃-TGFβ1(−). MTT was used to detect the proliferation of osteosarcoma cells transfected by antisense TGFβ1 gene. Our results showed that the proliferation of the transfected osteosarcoma cells was suppressed markedly. It is concluded that TGFβ1 autocrine loop blockage in osteosarcoma cells could inhibit cell proliferation, which might be helpful for gene therapy of osteosarcoma. LIU Yong, male, born in 1971, Doctor in Charge This work was supported by a grant from Chenguang Project of Wuhan (Serial No. 20025001028).     

反义hTERT在体外对HL-60细胞的抑制作用

[目的 ]探讨反义hTERT表达质粒是否能够抑制HL - 6 0细胞增殖能力及端粒酶活性。 [方法 ]通过脂质体法将反义hTERT表达质粒导入HL - 6 0细胞中 ;以G4 18进行筛选得到阳性克隆 ;以MTT法和体外集落形成实验检测反义hTERT表达质粒对HL - 6 0细胞增殖的抑制作用 ;以TRAP -PCRELISA法来研究反义hTERT对HL - 6 0细胞的端粒酶活性的抑制作用。 [结果 ]转染反义hTERT表达质粒组与空白对照及空质粒组相比 ,细胞增生速度明显较慢 ,克隆形成能力明显下降 (P <0 .0 1) ;反义hTERT对HL - 6 0细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。 [结论 ]本研究构建的端粒酶反义hTERT表达质粒能够抑制HL - 6 0细胞的体外增殖能力及其端粒酶活性。     

EFFECTS OF TGF β1 AUTOCRINE BLOCKAGE ON OSTEOSARCOMA CELLS

Objective To evaluate the effects of transforming growth factor β1 (TGF β1) autocrine blockage on proliferation activity and drug sensitivity of osteosarcoma.Methods Northern blot, MTT determination, and 3H thymidine incorporation were used to investigate the effects of antisense TGF β1 gene on osteosarcoma.Results The proliferation of osteosarcoma cells transfected by antisense TGF β1 gene was suppressed markedly, and adriamycin sensitivity was significantly increased.Conclusion Blockage ofosteosarcoma cells TGF β1 autocrine loop inhibits cell proliferation and enhances chemotherapy sensitivity.     

EFFECTS OF TGF β1 AUTOCRINE BLOCKAGE ON OSTEOSARCOMA CELLS

Objective To evaluate the effects of transforming growth factor β1 (TGF β1) autocrine blockage on proliferation activity and drug sensitivity of osteosarcoma. Methods Northern blot, MTT determination, and ^3H thymidine incorporation were used to investigate the effects of antisense TGF β1 gene on osteosarcoma. Results The proliferation of osteosarcoma cells transfected by antisense TGF β1 gene was suppressed markedly, and adriamycin sensitivity was significantly increased. Conclusion Blockage of osteosarcoma cells TGF β1 autocrine loop inhibits cell proliferation and enhances chemother apy sensitivity.     

抑癌基因联合转染对膀胱癌细胞的生长抑制作用研究

目的　探讨抑癌基因 p5 3和 Rb对膀胱癌细胞的生长抑制作用。方法　利用逆转录病毒和电穿孔法将 p5 3、Rb单独或联合导入膀胱癌细胞株 T2 4中 ,Northern杂交等证实外源目的基因的表达后 ,观测并比较不同转染后细胞的生长、增殖水平和成瘤性等。结果　获得 p5 3、Rb单独和联合转染的 T2 4细胞 ,Northern杂交等证实 T2 4细胞中 p5 3失活而 Rb正常 ,转入的外源野生型 p5 3基因和 Rb基因均被表达。与未转染的对照组 T2 4细胞相比 ,转入 p5 3的细胞其生长速率明显降低 ,细胞增殖受抑制 ,软琼脂克隆形成能力丧失 ;而只转染 Rb的细胞除软琼脂克隆形成能力有所降低外 ,细胞生长和增殖未受明显抑制。结论　外源野生型 p5 3能抑制 T2 4生长并降低其成瘤性 ,增加 Rb的表达对细胞生长无明显抑制作用。p5 3对 T2 4细胞的生长抑制作用与外源 Rb基因导入与否无明显关系 ,Rb表达水平正常的膀胱癌细胞其异常增殖可能与 Rb蛋白磷酸化状态的关系更为密切。     

稳定转染维生素D受体反义cDNA的人骨肉瘤细胞系的建立

目的：建立稳定转染维生素D受体（VDR）反义cDNA的人骨肉瘤细胞系,方法：构建VDR反义cDNA的真核表达载体,用Lipofectamine法转染人骨肉瘤细胞系HOS－8603,经G418筛选后获得稳定转染细胞株,并用免疫组化技术检测内源性VDR蛋白折表达情况,采用瞬时转染报告基因技术从靶基因水平检测VDRas3细胞内VDR的转录激活功能,结果“筛选出6株抗G418细胞克隆（VDRas1-6),其中VDRas3细胞内源性VDR蛋白的表达量低于对照细胞,激素作用72h后,对照组细胞的报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）转录活性增加约3．5倍,而VDRas3细胞CAT的转录基本不受激素诱导。结论：获得了稳定转染VDR反义cDNA的细胞系,为今后进一步研究1,25（OH）2D3及其类似物调节细胞增殖分化的分子机制提供了一个良的细胞模型。