星形神经胶质细胞对PC12神经元突起生长发育的影响

背景星形细胞对神经元有提供营养、支持及调节突触活性作用,但它对神经元发育的影响还尚不清楚.目的探讨体外培养的Sprague Dawley大鼠大脑皮质星形细胞对PC12神经元突起生长发育的作用.设计完全随机设计,对照实验研究.方法以培养的星形细胞与PC12神经元按不同细胞数目比例(501～11)共同培养,并用其制备的条件培养液培养PG12细胞.主要观察指标用快速灵敏的MTT'比色法测定PC12神经元的细胞活力,用光学相差显微镜观察PC12细胞形态学变化.结果①星形细胞条件培养液可增强PG12细胞活力(MTT测定的A值由0.255±0.012提高到0.510±0.036,P＜0.001),却不能促使PC12神经元突起的生出.②当将星形细胞与PC12细胞按301～11的比例共同培养时,既可提高PC12细胞折光性和光晕又可促使其突起的生长;但按501～401的比例共同培养时,只观察到提高PC12细胞折光性和光晕,而无促使其突起生长发育的作用.结论PC12神经元细胞活力的提高与星形细胞分泌到条件培养液中的可溶性因子有关,而PC12神经元突起生长发育可能是和与星形细胞的直接接触以及二者的细胞数目比有关.     

原代神经元及PC12细胞用于药物体外急性毒性评价的实验研究

【目的】研究原代神经元及PC12细胞用以评价药物或化合物的急性毒性，以判断是否可以替代动物实验，为建立稳定的体外高通量筛选化合物和药物的急性毒性评价体系奠定基础。【方法】原代分离培养大鼠皮质神经元，传代培养大鼠类神经元细胞——PC12细胞，取17种药物和化合物，分别稀释不同浓度，与上述两种细胞分别孵育24h，与空白对照组比较，以MTT法检测药物／化合物对细胞的抑制率，据此量效曲线计算出IC50，与大鼠口服LD50进行相关性分析。【结果】体外神经元的IC50与体内LD50相关性为：R^2=0．7253，PC12细胞毒性检测结果的IC50与动物体内急性毒性LD50相关性为：R^2=0．6441，二者均有明显相关性。【结论】利用体外分离培养的原代神经元以及PC12细胞，在短时间（24h）内可以评价药物或化合物的急性毒性，并可以预测化合物对人及动物的毒性，基本可以替代或减少动物实验。     

星形神经胶质细胞对PC12神经元突起生长发育的影响

背景：星形细胞对神经元有提供营养、支持及调节突触活性作用，但它对神经元发育的影响还尚不清楚。目的：探讨体外培养的Sprague Dawley大鼠大脑皮质星形细胞对：PC12神经元突起生长发育的作用。设计：完全随机设计，对照实验研究。方法：以培养的星形细胞与PC12神经元按不同细胞数目比例(50：1～1：1)共同培养，并用其制备的条件培养液培养PC12细胞。主要观察指标：用快速灵敏的MTT比色法测定PC12神经元的细胞活力，用光学相差显微镜观察PC12细胞形态学变化。结果：①星形细胞条件培养液可增强PC12细胞活力(MTT测定的A值由0．255&;#177;0．012提高到0．510&;#177;0．036，P&;lt;0．001)，却不能促使：PC12神经元突起的生出。②当将星形细胞与PC12细胞按30：1～1：1的比例共同培养时，既可提高PC12细胞折光性和光晕又可促使其突起的生长；但按50：1～40：1的比例共同培养时，只观察到提高PC12细胞折光性和光晕，而无促使其突起生长发育的作用。结论：PC12神经元细胞活力的提高与星形细胞分泌到条件培养液中的可溶性因子有关，而PC12神经元突起生长发育可能是和与星形细胞的直接接触以及二者的细胞数目比有关。     

神经生长因子撤退诱导神经元样PC12细胞凋亡及HRK/MCL-1基因表达变化

目的:探讨神经生长因子(NGF)撤退对已分化神经元样PC12细胞的影响.方法:建立NGF诱导PC12细胞交感神经元样分化模型,观察NGF撤退后,神经元样PC12细胞形态学及超微结构的变化情况,检测凋亡相关基因HRK/MCL-1的表达变化情况.结果:神经元样PC12细胞在NGF撤退后,可观察到显著的细胞凋亡样特征性改变,并随着NGF撒退时间的延长,凋亡率不断增加,同时随着NGF撤退时间的延长,促凋亡基因HRK的表达不断增高.而抑凋亡基因MCL-1在撤退24 h内表达水平下降明显,撤退24 h后变化不显著.结论:NGF撒退确实能诱导已分化的神经元样PC12细胞出现典型的神经元细胞凋亡现象,该现象与凋亡相关基因HRK/MCL-1的表达变化有密切关系.     

戊四氮及NF-κB圈套结构对神经元样细胞GAP-43表达的影响

目的:观测戊四氮(PTZ)及NF-κB圈套寡核苷酸结构对神经元样PC12细胞生长相关蛋白-43(GAP-43)表达的影响。方法:应用免疫印迹检测PTZ干预前后神经元样PC12细胞GAP-43的表达情况,进而运用基因转染技术将NF-κB圈套寡核苷酸转入神经元样PC12细胞中,应用激光共聚焦成像技术(CLSM)检测转染前后NF-κB的活性变化,免疫印迹观察转染前后GAP-43的变化情况。结果:①PTZ干预后神经元样PC12细胞GAP-43的表达显著增高;②CLSM检测显示转染NF-κB圈套寡核苷酸后神经元样PC12细胞中NF-κB活性明显下降,但GAP-43表达水平未降低。结论:PTZ可促进GAP-43的表达,NF-κB对GAP-43的表达不具有调控作用。     

纳洛酮对缺氧大鼠皮层神经元细胞的保护作用

目的　观察缺氧对大鼠皮层神经元细胞的影响及纳洛酮的保护作用。方法　取体外培养 12d的Wistar大鼠皮层控经元细胞 ,随机分为正常对照组、缺氧组、纳洛酮组 (缺氧前 2 4h加纳洛酮预处理 ) ;缺氧 6h后在常氧下继续培养 2 4h。观察各种条件下神经元细胞的存活率和形态学的改变 ,测定培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)含量。结果　缺氧后可见神经元胞体肿胀、细胞死亡 ,LDH渗出量增多 ,细胞存活率减少 (P <0 0 1)。经纳洛酮预处理的神经元 ,缺氧后神经元胞体肿胀、细胞死亡程度轻于缺氧组 ,LDH渗出显著低于缺氧组 (P <0 0 1) ,而存活率明显高于缺氧组 (P <0 0 1)。结论　缺氧能诱导皮层神经元损伤 ,而纳洛酮对神经元的缺氧损伤具有明显的保护作用     

纳洛酮对体外培养的缺氧大鼠皮质神经元细胞凋亡的影响

目的 :观察缺氧对大鼠皮质神经元细胞凋亡的影响及纳洛酮的保护作用。方法 :取体外培养 12 d的Wistar大鼠皮质神经元细胞 ,随机分为正常对照组、缺氧组、缺氧加纳洛酮组。缺氧 6h后在常氧下继续培养2 4h,用原位末端标记 (TUNEL)法和流式细胞仪检测不同时间段神经元细胞凋亡率。结果 :缺氧能诱导神经元细胞凋亡显著增加 ,纳洛酮可以降低凋亡率 ,与缺氧组相比差异显著 (P<0 .0 1)。结论 :纳洛酮可抑制缺氧诱导的大鼠皮质神经元细胞凋亡 ,对神经元细胞具有保护作用     

同型半胱氨酸对PC12细胞的作用及其机制研究

目的:研究同型半胱氨酸能否通过内质网应激的途径诱导多巴胺能神经元凋亡。方法:用不同浓度的同型半胱氨酸作用于经神经生长因子诱导的PC12细胞,以及同一浓度不同时间点的同型半胱氨酸干预PC12细胞,用四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR分析caspase-12表达的变化。结果:PC12细胞经同型半胱氨酸处理后发生凋亡,24h检测凋亡率呈浓度依赖性增高,经5mmol/L同型半胱氨酸处理的PC12细胞活力呈时间依赖性下降。随PC12细胞凋亡率增高和活力的下降,caspase-12表达同步增强。结论:同型半胱氨酸可以通过内质网应激途径诱导体外多巴胺能神经元细胞凋亡。     

视网膜细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探索乳鼠视网膜细胞体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的可行性。方法以大鼠BMSCs为研究对象，利用分层共培养的乳鼠视网膜细胞作诱导剂，进行增殖培养、分化诱导；免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果加入乳鼠视网膜细胞共培养第7天有神经元样细胞形成，经nestin、NF鉴定为神经元样细胞。结论BMSCs在体外培养条件下，经过新生乳鼠视网膜细胞诱导，可以分化为神经元样细胞。     

咪唑安定对谷氨酸诱导大鼠PC12细胞凋亡的影响

目的:探讨咪唑安定对谷氨酸诱导大鼠神经元样PC12细胞凋亡的影响.方法:诱导分化4 d的神经元样PCI2细胞随机分成空白对照(C组),加入20 mM谷氨酸(G组),加人20 mM谷氨酸和10 uM咪唑安定(M组),各组细胞继续培养24 h后观察细胞的活力(MTY法)及细胞凋亡率(Hoechst33258核染色法联合Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术).结果:与C组比较,G组细胞活力度明显降低,而细胞凋亡率明显升高(P<0.01);与G组比较,M组细胞活力度明显升高,而细胞凋亡率明显降低(P<0.05).结论:咪唑安定可抑制谷氨酸诱导体外培养的大鼠神经元样PC12细胞凋亡,发挥保护作用.     

视网膜神经节细胞培养上清液对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的诱导作用

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)体外诱导分化成神经元样细胞的能力。方法用视网膜条件分化液诱导传代的rMSCs,待细胞分化后进行形态学观察,并用免疫细胞化学方法方法进行鉴定。结果诱导细胞2 d后即可见有神经元样细胞出现,7 d神经元样细胞占细胞总数的(27±1.0)%,Nestin染色阳性、MAP-2染色阳性。结论体外rMSC能扩增、传代,并被诱导分化成神经元样细胞。     

辅酶Q10对多巴胺损伤的PC12细胞凋亡的影响

目的:观察辅酶Q10在以PC12细胞建立的多巴胺神经元凋亡细胞模型中的作用。方法:实验于2003-04/2004-04在锦州医学院科技试验中心进行。取体外培养的PC12细胞分为3组:①辅酶Q10组:加450μmol/L辅酶Q10和0.3mmol/L多巴胺。②多巴胺组:加0.3mmol/L多巴胺。③空白对照组:只加等量RPMI1640。24h后进行流式细胞仪测试DNA含量,检测细胞凋亡率。结果:多巴胺组细胞凋亡率明显高于空白对照组[(30.66±1.90)%,(0.82±0.07)%,P<0.01],辅酶Q10组细胞凋亡率[(16.05±2.16)%]明显低于多巴胺组(P<0.01)。结论:辅酶Q10能显著降低多巴胺引起的PC12细胞凋亡,提示辅酶Q10作为神经保护性药物对保护多巴胺能神经元,防治帕金森病可能有实际应用价值。     

黄体酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞实验研究

目的：体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，黄体酮定向诱导。MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄体酮诱导3h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

原花青素对大鼠背根神经节神经元突起生长的影响

目的 探讨原花青素（proanthocyanidins, PC）对大鼠背根神经节（dorsal root ganglion, DRG神经元突起生长的作用。方法 在体外,培养原代大鼠DRG神经元细胞并检测不同浓度PC对其突起生长数量、长度及生长锥的影响;在体内,构建大鼠坐骨神经夹伤模型,检测损伤早期生长相关蛋白43(growth-associated protein 43, GAP43)的表达情况。最后在体外采用细胞免疫荧光和ELISA检测PC对DRG神经元中神经生长因子（nerve growth factor, NGF）的表达影响。结果 PC可显著增加DRG神经元突起的数量、长度及生长锥伪足数量;促进大鼠坐骨神经损伤早期GAP43蛋白的表达;增强DRG神经元内NGF的表达。结论 PC可能通过促进大鼠DRG神经元内NGF的表达,加快神经元突起生长。     

磷酸化Smad3在神经元样细胞氧糖剥夺中的表达变化

目的探讨磷酸化Smad3蛋白在神经元样PC12细胞氧糖剥夺中的表达变化。方法利用鼠神经生长因子(NGF)诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)向神经元样细胞转化,应用无糖DMEM培养液联合连二亚硫酸钠(Na2S2O4)构建氧糖剥夺模型(oxygen-glucose deprivation,OGD),体外模拟神经元缺血性损伤。MTT检测神经元样细胞OGD 0,3,6和12h存活率,Western blot检测OGD前后磷酸化Smad3蛋白表达。结果成功建立神经元样PC12细胞的OGD模型;OGD 3h后细胞存活率显著下降,至OGD 12h降至最低54.7%;细胞内磷酸化Smad3表达在OGD 3、6h与OGD 0h组相比略升高,至OGD 12h时明显降低。结论磷酸化Smad3参与在神经元样细胞OGD早期ActA/Smads通路的活化。     

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中端粒酶的变化

背景：已知端粒酶活性变化与组织工程应用的安全性密切相关，而目前端粒酶在骨髓间充质干细胞诱导分化过程中的变化及机制研究尚少。目的：观察体外人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中端粒酶的变化。设计、时间及地点：细胞学开放性实验，于2006—12／2007—11在吉林大学第三临床医院实验中心及基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成。材料：无菌条件下采集非血液系统疾病的志愿者髂骨骨髓，体外分离培养人骨髓间充质干细胞。方法：取第3代培养的人骨髓间充质干细胞，应用二甲基亚砜/丁羟茴香醚（DMSO／BHA）联合诱导法诱导其向神经元样细胞分化。主要观察指标：绘制体外培养的人骨髓间充质干细胞的生长曲线。免疫荧光及细胞化学染色法分别检测诱导后细胞的巢蛋白和尼氏体的表达，TRAP—ELISA方法检测人骨髓间充质干细胞诱导前后端粒酶活性的变化。结果：体外培养的人骨髓间充质干细胞在第3～8代生长较快，第10代以后细胞的生长能力明显减弱。经DMSO／BHA诱导分化后的细胞能够表达具有神经元特征的巢蛋白及尼氏体结构。此外，TRAP—ELISA结果显示诱导2h细胞端粒酶活性变化不明显，当诱导6h以后细胞端粒酶活性明显降低，诱导至24h时，细胞端粒酶活性已近阴性（P〈0．05）。结论：人骨髓间充质干细胞在体外成功诱导分化为神经元样细胞的过程中端粒酶活性逐渐降低直至消失。     

星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:在神经干细胞移植治疗神经系统退行性变及修复神经系统功能损伤过程中,有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化尤为关键.目的:以星形胶质细胞条件培养液为诱导剂,观察胎鼠室管膜前下区神经干细胞体外向多巴胺能神经元的分化.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2006-12/2007-08在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成.材料:清洁级新生2d龄KM小鼠15只,孕16d Wistar大鼠40只,均由解放军第三军医大学实验动物中心提供.方法:采用差速黏附法和振荡分离法纯化培养KM小鼠星形胶质细胞,收集传至第3代、培养5d的星形胶质细胞条件培养液,-20℃冻存待用.体外分离Wistar胎鼠室管膜前下区神经干细胞,加入含B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基进行原代培养,传至第3代后按0.5×108L-1密度接种,设立2组:对照组单纯加入含体积分数0.1为胎生血清的DMEM/F12培养基予以自然分化,实验组加入已制备的星形胶质细胞条件培养液进行诱导分化.主要观察指标:免疫细胞化学染色鉴定胎鼠室管膜前下区神经干细胞,流式细胞仪检测胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率.结果:培养的神经球细胞袁达巢蛋白,可分化为神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞.诱导分化7d后,实验组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞,胞体呈圆形或椭圆形,酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中;对照组酪氨酸羟化酶阳性细胞在数量、细胞成熟形态上均未达到实验组水平.实验组酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率明显高于对照组(t=35.296,P<0.01).结论:在体外星形胶质细胞条件培养液可显著促进胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化.     

成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向神经细胞分化的可能性。方法利用Per-coil梯度分离及贴壁筛选法分离培养和扩增MSCs；利用bFGF、化学诱导剂DMSO和BHA联合诱导MSCs向神经元转化，观察分化过程中细胞形态的变化，利用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测神经元特异性标志物的表达情况。结果经Perecoll梯度分离及贴壁筛选法获得了纯度较高的人MSCs，诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态，并且分别从mRNA和蛋白水平上证明诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和NF，不表达神经胶质细胞标记物GFAP。结论人MSCs可以在体外诱导分化为神经元样细胞，这种潜能使其有可能成为神经系统疾病细胞移植治疗的种子细胞。     

Nogo-A受体在早期神经元细胞分化过程中的表达

目的:探讨在早期神经元细胞生长发育过程中Nogo-A受体(NG-R)的表达变化。方法:体外培养PC12细胞,实验组加入50 ng/m L细胞生长因子(NGF)进行诱导分化1、3、5、7 d,对照组中不加入NGF诱导分化。于不同时间点镜下观察细胞轴突发育及细胞分化情况,免疫荧光法观察NG-R蛋白在PC12细胞中的表达与定位,RT-PCR法检测NG-R m RNA在PC12细胞中的表达变化,western blot法检测NG-R蛋白在PC12细胞中的表达变化。结果:随着诱导分化时间的增加,实验组PC12细胞轴突发育及细胞分化增加;对照组PC12细胞未检测出NG-R m RNA及蛋白表达;实验组随着NGF诱导刺激时间延长,PC12细胞内NG-R m RNA及蛋白表达量逐步增加,组间差异有统计学意义,且均高于对照组(P0.05或0.01),但实验组诱导1 d PC12细胞内NG-R蛋白表达量与对照组差异无统计意义(P0.05)。结论:在神经元发育早期NG-R的表达随着轴突生长逐渐升高。     

神经生长因子对新生大鼠脑神经元细胞缺氧缺血损伤的保护作用

目的:观察神经生长因子对新生大鼠脑神经元细胞缺氧缺血性损伤的保护作用。方法:实验于2004-01/06在东南大学临床医学院中心实验室完成。①体外培养新生脑皮质神经元细胞后,改良Goldberg方法建立神经元细胞“缺氧缺血”损伤模型。②应用光学显微镜、透射电镜观察不同组之间(正常组、缺氧缺血组、缺氧缺血后即刻给以神经生长因子-80μg/L治疗组)神经元细胞形态、超微结构改变。③应用细胞免疫化学方法检测神经生长因子治疗组细胞色素C基因在转录及翻译水平的表达,与正常组及缺氧缺血组进行比较。结果:①光镜测量缺氧缺血组细胞突起长度明显低于正常组和治疗组[(7.591±1.354),(23.7595±0.945),(23.466±1.005)μm],而其细胞色素C阳性率及AIFmRNA表达相对含量明显高于另两组[(69.318±6.646)%,(41.193±4.472)%,(41.817±4.364)%,P<0.05]。上述测值正常组与治疗组差异无显著性(P>0.05)。②透射电镜观察细胞:缺氧缺血对照组细胞核形状不规则,染色质凝聚成块,核周间隙明显增厚,线粒体肿胀空泡化;正常组神经元细胞及治疗组神经元细胞核大呈圆形或椭圆形,常染色质均匀分布,可见明显的核仁,胞浆内线粒体、粗面内质网结构清晰,核糖体丰富。结论:①体外培养新生大鼠脑皮质神经元细胞,剥夺氧及糖6h后能够模拟缺氧缺血性神经元细胞损伤。与正常组相比,缺氧缺血模型组光镜及电镜示凋亡小体存在,线粒体结构异常;细胞色素C细胞免疫化学示阳性率明显增加。②适宜浓度(80μg/L)的外源性神经生长因子能够促进缺新生大鼠脑缺氧缺血性神经元细胞修复,保护线粒体。