丙型肝炎病毒抗体单片段检测与总抗体检测的比较研究

目的 通过对国产HCV抗体分片段酶联免疫检测试剂与进口第三代抗-HCV检测试剂检测丙型肝炎病毒抗体的研究来了解丙肝病毒抗体单片段检测的意义。方法 采用国产基因重组表达的丙型肝炎病毒不同区(C、NS3、NS4、NS5)特异性抗原分别包被酶标板，以间接EIA法检测75例丙肝患血清中不同区特异性抗体。并以Ab—bott公司第三代抗-HCV试剂进行总抗体检测，同时做HCV—RNA检测。结果 75例血清中HCV不同区抗原片段NS3、HCV～C、NS4、NS5的抗体检出率分别为93．3％(70／75)、92．0％(69／75)、70．7％(53／75)、64．0％(48／75)。含2个片段以上的抗体检出率为94．7％(71／75)；抗-HCV总抗体的检出率为98．7％(74／75)；HCV—RNA检出率为77．4％(58／75)。结论 HCV不同区抗原片段的抗体检出率有差别，NS3、HCV—C检出率较高，其次为NS4、NSS。两种试剂有较好的相关性，HCV抗体单片段试剂可作为检测丙型肝炎病毒抗体的补充试剂，单独片段抗体阳性具有一定意义，动态观察NS3、NS4抗体水平可预测IFN的治疗效果。     

乙型肝炎病毒S基因片段的克隆及其原核表达的实验研究

目的：获得adw亚型乙肝病毒表面抗原S基因在原核中的克隆和表达，经家兔免疫后产生抗-HBs抗体。方法：从乙型肝炎病人血清中提取HBV DNA后扩增出501bp的核苷酸片段，经纯化限制性内切酶(BamH Ⅰ和HindⅢ)切后，分别与PUC19和pGEME^XM—1载体连接后转化入宿主菌JM109中和BL21，重组质粒经蓝／白斑，筛选、PCR鉴定、酶切鉴定，序列分析得到阳性重组质粒pGE-S。通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达出重组抗原，重组抗原免疫家兔后，用ELISA法在血清中检测到抗-HBs的存在。结果：HBV DNA经扩增得到501bp的核苷酸片段，与质粒重组后形成的重组质粒，在IPTG诱导形成重组抗原，重组抗原两次免疫家兔后的血清抗体阳性率比较，差别有显著性(X^2=0．25，P≤0．05)。     

细粒棘球蚴AgB亚单位基因的联合表达和血清学评价

目的为进一步提高AgB抗原在诊断中的敏感性和特异性,将细粒棘球蚴AgB1和AgB2两个亚单位基因在同一载体中进行联合表达,并对联合表达的重组抗原和单基因表达的AgB1、AgB2在血清抗体检测中的差异进行比较研究。方法在表达载体PET32a中构建AgB1+AgB2(AgBs)联合基因的重组质粒,用ELISA检测重组抗原与病人血清的反应性。结果构建了AgBs重组质粒,经测序证实插入的联合基因片段序列正确。AgBs重组质粒表达的融合蛋白分子量为38kDa,为不溶性蛋白。联合表达抗原AgBs对细粒棘球蚴病(CE)血清的敏感性为84.4%,特异性为80.5%;单基因表达的AgB1和AgB2的敏感性分别为75.6%和57.8%,特异性分别为72.6%和91.2%。结论成功构建了AgB亚单位联合表达基因,联合表达的AgBs抗原对CE血清的诊断价值优于单基因表达的AgB1或AgB2抗原。     

丙型肝炎病毒多表位抗原的融合表达及抗原性分析

目的 表达HCV核心蛋白Core、非结构区NS3、NS4和NS5区的部分优势表面抗原的融合基因,为丙型肝炎病毒的检测提供合适抗原.方法 通过KT-PCK从HCV全长基因组中分别克隆Core、NS3、NS4和NS5区的部分优势表面抗原的基因片段,运用重叠延伸PCR技术将它们拼接成融合基因,将融合基因再克隆到表达裁体pBVIL-2中.转化大肠杆菌JM109,阳性克隆经42℃热诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.重组蛋白经阳离子交换和分子筛纯化.结果 42℃诱导可高表达分子量约为43 kD的融合抗原,重组蛋白主要以包涵体形式存在.经过纯化目的 蛋白纯度达90%以上的,表达量约为886μg/mL.ELISA结果表明纯化蛋白具有良好的抗原性.结论 HCV复合多表位抗原融合蛋白可作为HCV诊断抗原提供了靶抗原.     

MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备

[目的]构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体.[方法]利用RTPCR方法扩增MAGE-3基因片段,连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEXMAGEE-3并测序.将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化.用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性.[结果]构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达一相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3.制备了兔抗GST-MAGE-3抗体.Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合.[结论]获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体、为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具.     

丙肝蛋白芯片用于病毒性肝炎血清流行病学调查

目的 用蛋白芯片技术确证ELISA法初筛抗-HCV阳性结果,观察HCV不同功能区抗体在不同地区低危人群中的检出率差异.方法 将HCV混合抗原,核心区抗原,NS3,NS4,NS5区抗原分别固定于同一玻片载体上制作蛋白芯片,选取48例2001年浙江省病毒性肝炎血清流行病学调查丙肝抗体ELISA法初筛阳性血清,用芯片检测不同功能区抗体.结果 48例初筛阳性血清用蛋白芯片检测有15例不同功能区抗体均为阴性,33例均有1～4种抗体阳性,抗C、抗NS3、抗NS4、抗NS5总检出率分别为51.5%、51.5%、48.5%和57.6%.其中舟山、衢州、温州、绍兴地区抗C检出率分别为53.3%、33.3%、44.4%、66.7%,抗NS3检出率分别为33.3%、100%、55.6%、66.7%,抗NS4检出率分别为60.O%、0%、33.3%、66.7%,抗NS5检出率分别为66.7%、0%、44.4%、83.3%.结论 HCV不同功能区抗体在不同地区低危人群中的分布存在差异,使用蛋白芯片检测低危人群中的HCV抗体,具有较高的特异性.     

HCV不同编码区重组基因的蛋白表达丰度分析

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)不同基因片段重组载体在pET大肠杆菌系统中的蛋白表达情况.方法:分别将构建好的含有HCV C、NS3、NS5片段基因的pET重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.通过卡那霉素抗性筛选转化子.经过IPTG诱导表达相应的重组蛋白,通过Ni-NTA凝胶亲和层析纯化各目标蛋白,并分别计算各重组蛋白的浓度.结果:分别诱导表达含有HCVC、NS3、NS5片段基因的重组蛋白,各蛋白的浓度分别为:3.557(1型NS3)、4.238(6型NS3)、2.087(NS5)、1.490g/L(C).结论:在相同条件下,诱导表达含有HCV不同基因片段的重组载体,所得到的蛋白丰度存在差异.     

多抗原肽免疫血清体外阻断丙型肝炎病毒感染树鼩肝细胞的初步研究

目的：探讨多抗原肽（MAP）免疫血清在体外能否阻断丙型肝炎病毒（HCV）感染树Gu感染树Gu肝细胞，为研制HCV分子疫苗提供实验基础。方法：用兔抗MAP血清分别与两分感染血清按一定比例混合后接种于原代培养的树Gu肝细胞中，用逆转录聚合酶链反应（RR－PCR），免疫组化，原位杂交分别检测细胞内或上清中正负链RNA，细胞内HCV NS3抗原的表达情况，以及原位检测细胞内HCV负链RNA，结果：1份HCV RNA阳性血清与兔抗MAP血清按1：1混合后接种于培养的树Gu肝细胞中，细胞内可检出HCV正负链RNA，并有HCV NS3抗原的表达，而另外1份HCV RNA阳性血清与兔抗MAP血清按1：1，5：1，10：1混合后接种于培养的树Gu肝细胞中，细胞内未检测出HCV正负链RNA，也未见特异性抗原表达，结论：兔抗MAP血清在体外能部分阻断HCV感染。     

S100A16基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的:构建S100A16原核表达载体,制备S100A16蛋白多克隆抗体并初步鉴定?方法:RT-PCR扩增得到小鼠肝脏组织的S100A16基因,将此片段克隆到带有His标签的原核表达载体pET-28a多克隆位点,并转化大肠杆菌BL21(DE3)?IPTG诱导融合蛋白表达,以亲和层析的方法纯化His-S100A16融合蛋白?纯化蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫新西兰白兔制备抗血清?分别采用ELISA和Western blot方法检测抗体效价和特异性?结果:经双酶切和核酸序列分析证实成功构建pET-28a-S100A16原核表达质粒?考马斯亮兰染色结果证实IPTG可有效诱导融合蛋白表达?用纯化融合蛋白免疫新西兰白兔得到的S100A16抗体血清,经ELISA和Western blot检测结果显示该抗体效价高,特异性好?结论:构建带有His标签的S100A16原核表达载体,并获得高纯度His-S100A16融合蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究S100A16生物学功能奠定基础?     

恙虫病东方体56 kD表面抗原基因片段的克隆、表达及纯化抗原在恙虫病抗体检测中的应用

目的　构建恙虫病东方体 5 6 k D表面抗原基因 (sta5 6 )片段的重组表达质粒 ,在 E.coli中表达 Sta5 6重组抗原 ,重组抗原纯化后应用于间接法 EL ISA、金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体特异性抗体。　方法　从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出 sta5 6基因的 ORF及其中长 10 5 3bp的大片段 ,用 TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板 ,扩增出不同长度的截短的 sta5 6片段 ,定向插入p PROEX HTb及 p ET30 a载体 ,转化大肠杆菌 DH 5α或BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,应用 SDS- PAGE观察重组蛋白表达情况 ,应用 Western blot分析重组抗原的活性 ;采用电洗脱、亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯 96孔板 ,用于间接法 EL ISA检测恙虫病东方体 Ig G,或以胶体金标记重组抗原 ,运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体 Ig M和 Ig G抗体。　结果　 (1)从恙虫病东方体 Karp株基因组中扩增出含 sta5 6基因的 ORF,并成功构建含 sta5 6 ORF大片段的重组质粒 TOPO- sta5 6。(2 )以截短的 sta5 6基因片段构建重组表达质粒 p HTb Ot95 7、p HTb O4 98、 p HTb Ot342和 p ETOt95 7、 p ETOt4 98、p ETOt342 ,各重组子均可在 E.coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS- PAGE显示各表示重组子     

RELATIONSHIP BETWEEN LOAD OF HCV RNA AND ANTIBODIES AGAINST REGIONAL SPECIFIC PROTEINS OF HCV IN SERUM

Objective To study whether HCV RNA load is related to the antibodies against regional specific proteins of HCV. Methods 69 serum samples were detected for HCV RNA load by Real time fluorescent PCR. Anti-HCV and the antibodies against regional specific proteins of HCV were detected by EL1SA. Results The positive rates of anti-C and anti-NS3 were remarkably higher than those of anti-NS4 and anti-NS5. We divided the serum samples into two groups on the basis of load of HCV RNA, there was no statistical significance between A and B group in the positive rate as well as the antibody reactivity of HCV anti-C, anti-NS3 , anti-NS4 and anti-NS5. From the distribution of different combined patterns, we could conclude that the pattern IV was superior to others in both of the two groups. Conclusion There are remarkable differences in different antibodies against the regional specific proteins of HCV. The positive rates and the antibody reactivity of anti-C, anti-NS3, anti-NS4, anti-NS5 are not related to the HCV viral load. The E1A-3 which conclude C, NS3, NS4, NS5 proteins could enhance the sensitivity of detection HCV.     

丙型肝炎病毒NS5区部分基因的克隆和表达及其抗体动态研究

分析丙型肝炎病毒ＮＳ５蛋白的抗原性,研究抗－ＮＳ５抗体的性质,动态变化规律及临床诊断意义。方法 用Ｇｏｌｄｋｅｙ程序对ＮＳ５蛋白的抗原决定簇进行预测分析,以ＲＴ－Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ方法扩增ＮＳ５基因片段,并进行核酸序列分析。通过基因体外重组技术克隆表达目的的基因。     

Clinical application and analysis of hepatitis C virus NS3 antigen detection by ELISA in human serum

Background Hepatitis C virus （HCV） core antigen assays have been produced to exclude infectious donations collected during the preseroconversion window phase （PWP）. For the same purpose, we evaluated the specificity and sensitivity of a novel hepatitis C virus NS3 antigen detection immunoassay and the application of this assay in clinical diagnosis. Methods Samples from 77 healthy subjects, 173 anti-HCV positive patients and 3708 hepatitis patients other than HCV positive were tested with the HCV NS3 antigen assay. Some HCV NS3 antigen positive samples were further validated with HCV-RNA, neutralization and immunodot assays. Twenty-five sequential samples from 11 HCV NS3 antigen positive patients were subjected to kinetic study. Results Only 48 （1.3%） of 3708 anti-HCV negative samples were positive for HCV NS3 antigen. Among them, 44 of 3030 samples from patients only infected with HBV were HCV NS3 antigen positive, 4 of the 445 samples from patients infected with other type hepatitis were HCV NS3 antigen positive. In addition, 42 （24.3%） of 173 anti-HCV positive samples were HCV NS3 antigen positive and all 77 samples from healthy subjects were negative to HCV NS3 antigen assay. Of the 15 HCV NS3 antigen positive samples, 9 （60%） were HCV-RNA positive. The neutralization and positive percentage of immunodot assay for 23 HCV NS3 antigen positive sera were 87.0% （20/23） and 69.6% （16/23） respectively. Of the 25 sequential samples from 11 HCV NS3 antigen positive patients, there was a negative correlation between the OD values and the duration of test （r=-0.989, P〈0.05）, and there were correlations among their HCV NS3 antigen, HCV-RNA and anti-HCV Utres. The anti-HCV antibodies of two sera were detected while their OD values of HCV NS3 antigen decreased gradually. Conclusions The HCV NS3 antigen detection assay showed perfect specificity and high sensitivity. Thus, it would be useful and economical as a routine test in laboratories for early diagnosis of HCV infection and prevention.     

Rv1196基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 用PCR方法从结核菌基因组中扩增Rv1196基因,将之重组到pET24b载体,在大肠杆菌中进行融合表达,重组蛋白纯化后通过免疫印迹反应初步鉴定其抗原性和特异性.方法 提取H37Rv标准株的基因组DNA;设计Rv1196基因两端的引物,通过PCR方法从基因组DNA中扩增出Rv1196抗原的基因,直接连接到pGEMT载体上,经过筛选鉴定后,将重组子测序;将测序的质粒用NdeI和XhoI双酶切后连接到pET24b载体上,筛选得到重组载体pET24b-39;转化BL21并优化表达条件,采用金属鏊合层析纯化重组蛋白;选取7例结核病阳性临床血清标本和7例健康人血清标本进行Western blot分析.结果 获得了氨基酸编码序列正确的基因,与数据库中报道一致;Rv1196基因能够在大肠杆菌中高效表达,其表达量约占细菌总蛋白的30%以上;重组抗原不与健康人血清反应,但与结核标本血清呈强烈反应.结论 重组Rv1196抗原具有较好的特异性和抗原性,有较好的血清学分析价值.     

抗HCV NS3抗原单克隆抗体的研制与初步鉴

目的：为研制抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３抗原单克隆抗体,用于检测丙肝患者血清中的ＨＣＶＮＳ３抗原。方法：用基因工程表达的ＨＣＶ非结构区ＮＳ３蛋白与鼠血清白蛋白交联后,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,用杂交瘤技术获得能分泌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的细胞株。结果：获得有实用价值的两株ＭｃＡｂ。两株ＭｃＡｂ与免疫抗原有较强的抗原－抗体反应,与ＨＣＶＮＳ４、ＮＳ５及核心区Ｃ３３肽、ＣＰ９、ＣＰ１０抗原无反应性,在竞争ＥＬＩＳＡ中,对ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性血清有较好的抑制作用。结论：用基因工程表达的ＨＣＶ非结构区ＮＳ３蛋白,能够制备出有实用价值的单克隆抗体。     

Effect of immunization in mice with recombinant DNA encoding the hepatitis C virus structural protein

OBJECTIVE: To explore the possibility and the efficacy of immune responses in mice inoculated with recombinant plasmid pCD-HCV1 and to lay a foundation for HCV nucleic acid vaccine development in the future. METHODS: The gene fragment coding C and E regions of HCV-II (type I b) was inserted into pCD-SR alpha 1 expression vector and formed pCD-HCV1 and then was injected into quadriceps muscles of Balb/c mouse. Serum anti-HCV level of mice was tested by ELISA (A value). Spleen cells proliferation responses to HCV antigens were detected by 3H-TdR incorporation (cpm). RESULTS: Balb/c mice immunized with recombinant plasmid pCD-HCV1 three or four times can generate specific antibody responses to HCV antigens and the antibody levels gradually ascend to the plateaus and did not have the trend of descending in 18 weeks detected. The serum antibodies in mice immunized by recombinant plasmid pCD-HCV1 were 100 percent positive when the serum were diluted 40 times and the positive rate of antibody still were 16.6 percent positive when the serum were diluted 320 times. Balb/c mice immunized with recombinant plasmid pCD-HCV1 (100 micrograms, 50 micrograms 10 micrograms/mouse three times respectively) can elicit antibody responses to HCV antigens and the antibody levels of three groups were 0.70 +/- 0.07, 0.33 +/- 0.04 and 0.11 +/- 0.09 respectively. Spleen cells of Blab/c mice injected with pCD-HCV1 three times were induced to produce proliferation responses to HCVc + e specific antigens. CONCLUSIONS: These results demonstrated that constructs expressioning HCV core and envelope proteins can generate anti-HCVc + e specific antibody responses and lymphoproliferation responses in mice, which suggested it to be possible to elicit immune responses to viral epitopes from HCV via DNA immunization with HCV-DNA recombinant and to warrant further investigation as a potential vaccine against HCV infections.     

HCV感染的不同临床型HCV核心非结构区抗体检测结果和稳定性研究

目的:研究HCV感染的不同临床型HCV核心区、非结构区抗体检测结果及其稳定性。方法:采用酶联免疫试验(EIA)检测不同功能区抗体，聚合酶链反应(PCR)测定其逆转录病毒。结果C区C11与C22抗体检测结果各临床型均具良好的一致性；NS3区C7区与C33抗体检测结果差异较大。单片段C区C11抗体与Ns3区抗体C7抗体具有早期检测的价值，各临床型反应性较强(S／CO值较高)；且二者互补性较强，尤其HCV相关肝癌。HCV抗体检测不能见出所有HCV感染者，抗HCV阳性者可部分或大部分RT—PCR阳性；RT—PCR能检出HCV阴性标本，且均为急性感染和无症状ALT正常者。HCV相关肝癌HCV抗体和RT—PCR反应性较低。单片段C11抗体极易缺失或(和)变异，阳性者均出现病毒血症中；NS3抗体单独阳性多见，却少与病毒血症共存；NS4．5抗体亦可单独阳性。结论:C、NS3抗体出现较早，反应性强，检出率高，具有早期诊断价值。NS4、Ns5抗体出现较晚，在慢性感染时检出率较高，HCV抗体检测加入NS4、NS5抗体可提高其检测水平。RT—PCR对确诊HCV感染具有重要意义。     

丙型肝炎病毒核心抗原检测在临床诊断HCV感染的价值

目的:评估丙型肝炎病毒核心抗原(HCVcAg)诊断试剂在临床运用对HCV感染的诊断价值?方法:对临床214例确认HCV感染者?60例健康体检者?40例非HCV感染的其他肝炎患者同时检测HCVcAg?抗HCV和HCV RNA,并对78例HIV感染者进行HCV感染筛查,分析 HCVcAg试剂的敏感性?特异性?结果:214 例确认丙肝患者HCVcAg检测162例(75.7%)阳性,且HCV RNA水平越高,HCVcAg检出率也越高?当HCV RNA载量>106/ml时,HCVcAg与HCV RNA检测的符合率达98.7%;60例健康对照和40例非HCV感染的各种肝炎HCVcAg检测均为阴性,显示了HCVcAg对诊断HCV感染得高度特异性?对78份HIV感染者样本进行HCV RNA测定,有16例阳性,以HCVcAg法测定有15例阳性,以抗HCV法测定仅有9例阳性?结论:HCVcAg可作为HCV感染诊断的血清病毒标志物,也可用于使用免疫抑制剂,抗HCV产生受到抑制的患者,以及在一些不具备开展PCR的医院实验室作为HCV RNA检测的替代试验?     

Humoral immune response to HCV core DNA vaccine in mice

DNAvaccine,alsocallednucleicacidvaccine,isarecombinanteukatyoticexpressionplasmidencodingcertainantigenofpathogen.DNAvaccinecanexpressantigenandinducecellularandhumoralimmuneresponsesaftervaccinationbyintramuscularinjectionorplasmid--coatedmicroparticlebombardment.Itshightemperaturestability,lowexpenseofmassproductionandtheabilitytoinducestrongimmuneresponsesevenfortheuseintherapyhavemadeDNAvaccineanexcitingwayfornewvaccinedevelopment['J.InordertofurnishevidenceforHCVDNAvaccinesuitablefo…