JNK通路对左归丸含药血清调控MC3T3 成骨细胞Runx2 mRNA表达的影响

目的:探讨c-Jun氨端激酶(JNK)信号通路在左归丸含药血清调控成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖和成骨特异转录因子核心结合因子(Runx2) mRNA表达中的作用.方法:以MC3T3-E1为研究对象,制备左归丸含药血清,选用JNK特异抑制剂SP 600125,实验分为空白对照组、SP 600125组、左归丸组、左归丸加SP 600125组、倍美力组、倍美力加SP 600125组.孵育48 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测SP600125对左归丸含药血清干预MC3T3-E1成骨前体细胞增殖作用的影响,采用Western blot法分析JNK蛋白磷酸化水平,采用Real Time RT-PCR法检测成骨细胞特异转录因子Runx2 mRNA表达情况.结果:与空白对照组比较,左归丸含药血清组显著促进细胞增殖,明显上调p-JNK蛋白和Runx2 mRNA表达(P＜0.01);SP600125显著抑制左归丸含药血清诱导的增殖和p-JNK蛋白表达(P＜0.01),对Runx2 mRNA表达的影响不显著.结论:JNK信号通路的激活可能参与了左归丸含药血清诱导的MC3T3-E1成骨前体细胞增殖,但左归丸含药血清诱导的Runx2mRNA高表达对JNK信号通路依赖不显著.     

沉默Cx43基因对左归丸促MC3T3-E1细胞分化作用的影响

目的:研究沉默Cx43基因对左归丸含药血清促MC3T3-E1细胞分化作用的影响。方法:采用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默Cx43基因,将培养细胞分为正常对照A组、含药血清B组、基因沉默C组。细胞培养第3、5、7、9天进行ALP活性测定、第21天矿化结节茜素红染色,进行组间对比。结果:左归丸含药血清可以促进MC3T3-E1细胞的分化,与A组比较:ALP活性增强,其中第5、7、9天差异显著(P0.05);茜素红染色面积增加(P0.01)。C组与B组比较:ALP活性降低,其中第7、9天差异显著(P0.05);茜素红染色面积明显减少(P0.05)。结论:沉默细胞Cx43基因导致左归丸含药血清促MC3T3-E1细胞分化作用明显下降。     

基于ER/ERK信号通路研究左归丸、左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞功能的影响

目的:对比观察左归丸和左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞功能的影响,从而部分阐明"阳中求阴"配伍防治骨质疏松的作用机制。方法:以成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,制备左归丸、左归丸去补阳药含药血清,选用雌激素受体拮抗剂ICI182780共孵,阻断ER受体后检测左归丸、左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞增殖、分化和矿化的影响。采用MTT法检测24 h、48 h、72 h左归丸、左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞增殖的影响,采用改良钙钴染色法和茜素红染色法分别观察48 h左归丸、左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞ALP活性和矿化结节的影响,采用Western-blot法检测48 h左归丸、左归丸去补阳药含药血清对ERα、ERK、p-ERK和Osterix蛋白表达的影响。结果:与空白对照组比较,左归丸组(9.68 g/kg)促进成骨细胞增殖,提高成骨细胞ALP活性和矿化结节数量,上调ERα、p-ERK和Osterix蛋白表达。ICI 182780阻断ER受体后,左归丸含药血清促成骨细胞增殖、分化和矿化的特性明显下降,ERα和p-ERK蛋白表达降低,相关转录因子Osterix的表达也被部分抑制。与空白对照组比较,左归丸去补阳药组(7.47 g/kg)未呈现促MC3T3-E1细胞增殖作用,可促进成骨细胞ALP活性和矿化结节形成数量增多,左归丸组明显优于左归丸去补阳药组,对ERα、p-ERK和Osterix蛋白表达影响不明显。结论:左归丸含药血清可以促进成骨细胞增殖、分化和矿化,机制可能与其上调成骨细胞ER受体激活ERK信号通路调控转录因子osterix有关;全方效果较好,部分揭示左归丸"阳中求阴"配伍防治骨质疏松的作用机制可能与其影响成骨细胞增殖和部分影响成骨细胞分化和矿化功能密切相关。     

更正启事

2012年08期《中成药》中《左归丸含药血清通过JNK信号通路诱导MC3T3成骨细胞分化的研究》一文,第1433页英文摘要第4行"Blood cells"应为"Cells";第5行"SP6001250"应为"SP600125"。特此更正!     

补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞矿化结节形成影响的研究

目的观察补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)矿化结节形成的影响,探讨该方剂促进成骨的作用机制。方法依照体表面积折算成等效剂量的补肾活血固齿方灌胃大鼠,制备含药血清(含药血清组);同等剂量的蒸馏水灌胃大鼠,制备无药血清(无药血清组);胎牛血清作为空白对照(胎牛血清组)。MC3T3-E1细胞分别于补肾活血固齿方含药血清、无药血清、胎牛血清中培养14 d,利用茜素红染色法观察各组矿化结节的形成情况并计数。结果 3组细胞在14 d时均形成矿化结节,含药血清组矿化结节形成数量明显多于无药血清组及胎牛血清组(P均<0.05),无药血清与胎牛血清组矿化结节形成数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论补肾活血固齿方可促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化成熟,通过促进牙周骨组织的再生而发挥其药理作用。     

左归丸通过线粒体途径抗叔丁基过氧化氢诱导的MC3T3-E1细胞凋亡

目的:观察左归丸对叔丁基过氧化氢诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的保护效应,探讨其作用机制是否与其干预线粒体途径有关。方法:以成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,制备左归丸含药血清,建立叔丁基过氧化氢(t-BHP)成骨细胞MC3T3-E1氧化应激模型,实验分为空白组,t-BHP组,左归丸+t-BHP组,补佳乐+t-BHP组。孵育24,48,72 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测左归丸含药血清对t-BHP诱导MC3T3-E1细胞存活的影响;孵育48 h后,采用吖啶橙溴乙啶(AO/EB)染色法检测细胞凋亡,采用Hoechst 33342染色法观察凋亡细胞核变化,采用罗丹明123荧光染色法观察线粒体膜电位的改变,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析线粒体蛋白家族B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平。结果:与空白组比较,t-BHP组显著抑制细胞增殖(P0.05,P0.01),细胞凋亡增加,线粒体膜电位降低,Bcl-2蛋白表达明显下调(P0.01);与t-BHP组比较,左归丸加t-BHP组促进暴露于t-BHP诱导的MC3T3-E1氧化损伤细胞的存活(P0.01),48 h者尤佳,逆转细胞凋亡情况,提高细胞线粒体膜电位,上调Bcl-2蛋白表达(P0.05),抑制Bax和Caspase-3蛋白表达(P0.01)。结论:左归丸含药血清能够抗t-BHP诱导的MC3T3-E1细胞凋亡,其作用机制可能与其干预线粒体途径有关。     

左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响

目的:研究左归丸含药血清对培养MC3T3-E1细胞分化成熟过程中Cx43表达及GJIC功能的影响。方法:胰蛋白酶消化法传代培养MC3T3-E1细胞,通过血清药理学方法,设立正常对照组、左归丸组(5%、10%、15%)。分别用RT-PCR、Western blot法检测培养细胞第7、14、21天Cx43mRNA、蛋白表达;第21天划痕染料标记示踪法检测细胞GJIC功能。结果:随着培养时间增加,各组MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达逐渐增强;GJIC染料标记检测中,可见绿色荧光在划痕两侧扩散,荧光定量分析存在组间差异。各浓度左归丸含药血清均可促进培养细胞的Cx43mRNA和蛋白表达、增强GJIC功能,并与含药浓度正性相关,其中以10%组作用最显著(P0.05或P0.01)。结论:左归丸含药血清能增强MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达及GJIC功能,这可能是其促进MC3T3-E1细胞分化成熟的重要机制之一。     

天麻钩藤饮含药血清对MPP+诱导PC12细胞凋亡JNK通路的影响

目的:观察天麻钩藤饮含药血清对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridinium,MPP~+)诱导的PC12细胞凋亡的影响,并且探讨其是否通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路发挥神经保护作用。方法:将32只SD大鼠随机分为空白组、天麻钩藤饮低、中、高剂量组,每组8只。天麻钩藤饮按照5.7,11.4,22.8 g·kg-1灌胃,空白组灌胃等体积生理盐水,采血制备空白和含药血清。PC12细胞常规培养并分为空白组、模型组、天麻钩藤饮含药血清低、中、高剂量组,空白组和模型组加空白血清,其他3组加10%的天麻钩藤饮含药血清,孵育30 min后,模型组和含药血清组再加500μmol·L~(-1)MPP~+共孵育48 h后收集细胞,采用Cell Titer 96Aoueous MTS Reagent powder(MTS法)检测细胞存活率。后续实验分为5组,即:空白组,MPP~+组,MPP~++含药血清高剂量组,MPP~++SP600125组,MPP~++含药血清高剂量+SP600125组,采用Annexin VFITC/PI双染色法检测细胞凋亡,分光光度法检测细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测JNK,p-JNK,c-Jun,p-c-Jun蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组细胞活力明显降低(P0.05);与模型组比较,10%的天麻钩藤饮低、中、高剂量含药血清组细胞活力显著增加(P0.05)。后续试验中,与空白组比较,MPP~+组细胞凋亡率,Caspase-3活性,p-JNK和p-c-Jun蛋白表达明显升高(P0.05)。与MPP~+组比较,MPP~++含药血清高剂量组,MPP~++SP600125组均能够使细胞凋亡率,Caspase-3活性,p-JNK和p-c-Jun蛋白表达明显降低(P0.05),而MPP~++含药血清高剂量+SP600125组的作用明显高于MPP~++含药血清高剂量组(P0.05),但不高于MPP~++SP600125组。JNK和c-Jun蛋白表达无明显变化。结论:天麻钩藤饮含药血清对MPP~+诱导的PC12细胞的凋亡具有保护作用,其机制可能与JNK信号通路密切相关。     

二仙汤含药血清通过BK通道对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化的影响

探讨二仙汤(Erxian Decoction, EXD)含药血清通过BK通道(BK channel)对氧化应激的MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化的影响。构建H₂O₂诱导MC3T3-E1细胞氧化应激模型，使用3 mmol·L^-1的氯化四乙基铵(tetraethylamine chloride, TEA)阻断MC3T3-E1细胞BK通道。将MC3T3-E1细胞分为对照(control)组、模型(model)组、EXD组、TEA组和TEA+EXD组。MC3T3-E1细胞按照分组分别处理2 d后，加入700μmol·L^-1 H₂O₂继续培养2 h, CCK-8法检测细胞增殖活性，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒法检测细胞ALP活力，蛋白免疫印迹法检测细胞蛋白表达，实时荧光定量PCR检测细胞mRNA表达，茜素红染色法检测成骨细胞矿化区域。结果显示，与control组相比，model组细胞增殖活性和ALP活力显著降低，BK通道α...     

补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响

目的观察补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1)碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,探讨其对成骨细胞分化的作用机制。方法将20只SD大鼠随机分为含药血清组和无药血清组,各10只。含药血清组大鼠予补肾活血固齿方灌胃,无药血清组予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃,均灌胃7 d后抽取腹主动脉血制备成含药血清和无药血清。胎牛血清组为直接购买的PAA胎牛血清。分别用含10%含药血清、10%无药血清及10%胎牛血清的培养基培养MC3T3-E1细胞24、48、72 h,检测MC3T3-E1细胞中ALP的含量。结果含药血清组培养24、48、72 h后MC3T3-E1细胞ALP含量均高于胎牛血清组及无药血清组同期水平,比较差异均有统计学意义(P0.05),但胎牛血清组与无药血清组同期差异无统计学意义(P0.05);含药血清组MC3T3-E1细胞ALP含量随培养时间的延长而明显增加(P0.05)。结论补肾活血固齿方可增强MC3T3-E1细胞中ALP活性,促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化,且均有一定时间依赖性。     

基于分子对接的方法探讨桑根酮C对MC3T3-E1细胞的作用

目的:观察桑根酮C(SanC)对地塞米松(DEX)作用下小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化的影响,并探讨其作用机制。方法:将SanC与同源建模所得的Runt-相关转录因子2(Runx2)蛋白结构进行分子对接。不同浓度SanC(8,16,32μmol·L^-1)和1μmol·L^-1DEX共同作用MC3T3-E1细胞,而后采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测SanC对MC3T3-E1成骨细胞增殖影响。试剂盒测定MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色检测骨矿化结节的形成。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Runt-相关转录因子2(Runx2),ALP,和锌指结构转录因子(Osterix)mRNA的表达水平。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Runx2蛋白表达。结果:SanC与Runx2对接打分为-9.78。与正常组比较,DEX组显著降低细胞存活率(P<0.01),其中7 d存活率差异达到最大;与DEX组比较,SanC能显著促进MC3T3-E1的细胞增值(P<0.01),其中32μmol·L^-1SanC作用细胞7 d增殖率差异达到最大。与正常组比较,DEX组Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达均有一定程度升高(P<0.05);与DEX组比较,不同浓度SanC组依赖性上调Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达(P<0.01)。与正常组比较,DEX组Runx2蛋白表达明显下降(P<0.05);与DEX组比较,SanC干预下细胞Runx2蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:桑根酮C能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化,其机制可能与上调Runx2表达有关。     

基于肾主骨理论观察肾小球系膜细胞对成骨细胞增殖及功能的影响

目的:研究肾小球系膜细胞对成骨细胞的影响。方法:应用体外细胞培养法,将成骨细胞分为正常血清组和系膜细胞组。检测培养24h、48h7、2h、120h后的成骨细胞增殖情况,并在72h后检测碱性磷酸酶(ALP)及骨桥蛋白(OPN)浓度。结果:系膜细胞组上清液的成骨细胞增殖要明显高于正常血清组,在72h后系膜细胞组上清液的AKP及OPN浓度要明显高于正常血清组。结论:肾系膜细胞能直接作用于成骨细胞,促进成骨细胞的增殖及功能,为中医"肾主骨"理论体系提供了新的实证。     

补肾活血复方含药血清对大鼠成骨细胞磷酸化GSK-3β、p38MAPK及ERK1/2蛋白的影响

目的:观察补肾活血复方含药血清对大鼠成骨细胞磷酸化糖原合成激酶3β(GSK-3β)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白的作用。方法:3月龄SD雌性大鼠灌胃制备空白血清和含药血清,并分离培养1日龄新生鼠颅骨成骨细胞。实验分为空白血清组和含药血清组,分别采用MTT、ELISA、Western-blot等方法检测两组成骨细胞的增殖、ALP和BGP的分泌及磷酸化GSK-3β、p38 MAPK和ERK1/2蛋白的变化。结果:与空白血清组相比,含药血清组可明显促进成骨细胞的增殖、ALP和BGP的分泌,并促进胞内磷酸化p38 MAPK和ERK1/2蛋白的表达,对磷酸化GSK-3β蛋白的表达未见明显影响。结论:补肾活血复方含药血清可促进大鼠成骨细胞的增殖和分化,提高p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化水平。     

竹节参对MC3T3-E1成骨样细胞增殖与分化的影响

目的：研究竹节参不同提取物对体外培养成骨样细胞（MC3T3-E1）增殖、分化作用的影响。方法：采用MC3T3-E1细胞为体外药物筛选的细胞模型,用MTT法测定药物对成骨细胞的增殖作用,碱性磷酸酶（ALP）试剂盒测定ALP的活性,考察竹节参不同提取物对MC3T3-E1细胞增殖、分化作用的影响。结果：10^-1mg／mL的竹节参水提物和10^-4mg／mL的95％乙醇提取物能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化（P〈0．05）。结论：一定浓度的竹节参水提物和95％乙醇提取物能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化,该药物具有开发抗骨质疏松药物的潜力。     

华中五味子含药血清对成骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨甘肃产华中五味子对大鼠成骨细胞增殖分化的作用。方法:采用血清药理学方法,对体外培养的大鼠成骨细胞作MTT法细胞增殖测定、PNPP法ALP活性测定、以及茜素红染色矿化结节计数。结果:培养48h,10%、15%和培养72h,5%、10%华中五味子95%乙醇提取物血清组的细胞增殖速度比对照组快(P<0.01);培养48h,10%、15%和培养72h,10%华中五味子乙醇提取物血清组的ALP活性较对照组增加(P<0.05和P<0.01);培养2周,矿化结节计数显示10%华中五味子乙醇提取物血清组多于对照组(P<0.01),华中五味子水提取物各血清组对成骨细胞增殖分化没有显著作用。结论:甘肃产华中五味子95%乙醇提取物对体外大鼠成骨细胞的增殖和分化具有促进作用。