α2,6-唾液酸对结肠癌细胞同源凝集的影响

目的研究结肠癌细胞LS174T的α2,6-连接的唾液酸水平对肿瘤细胞同源黏附功能的影响。方法结肠癌细胞株LS174T转染α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal-I)cDNA或ST6Gal-I cDNA的部分反义序列以及空载体pcDNA3.1,以流式细胞仪检测转染细胞表面α2,6-连接唾液酸含量并进行克隆分选,比较顺义、反义以及空载体转染细胞的贴壁时间以及细胞-细胞之间的同源凝集效应。结果转染顺义的ST6Gal-I cDNA的细胞克隆显示ST6Gal-I mRNA的表达增强,SNA(一种特异性识别α2,6-连接唾液酸的植物凝集素)与细胞表面成分的结合增加;另一方面,细胞转染反义ST6Gal-I cDNA后其ST6Gal-I mRNA表达减少,SNA与细胞表面成分的结合力降低。与空载体转染相比,顺义转染的细胞克隆同源凝集作用降低,与细胞外成分的黏附作用增强,贴壁速度加快;反义转染细胞克隆同源凝集作用显著增强,与细胞外成分的黏附作用降低,传代后4 h的贴壁率仅为空载体的53.7%。结论本实验结果显示,肿瘤细胞α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal-I)的表达将有效影响细胞表面α2,6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的黏附功能。     

细胞表面唾液酸及其连接方式对乳腺癌细胞黏附的影响

目的 研究肿瘤细胞总唾液酸及α2,6-连接唾液酸对乳腺癌细胞MDA-MB435黏附力的影响。方法 乳腺癌细胞MDA-MB-435转染顺义或反义α2,6唾液酸转移酶（ST6Ga1-I）cDNA,以黑接骨木凝集素SNA筛选高、低表达α2,6唾液酸细胞克隆．检测各转染细胞的同源凝集作用,并比较唾液酸酶处理前后肿瘤细胞对胶原Ⅳ黏附力的变化。结果 顺义转染克隆细胞．细胞之间的同源黏附能力下降．与胶原Ⅳ的黏附增强;反义转染克隆细胞-细胞之间同源黏附能力增强,而与胶原Ⅳ的黏附降低。唾液酸酶处理后肿瘤细胞与胶原Ⅳ的黏附力下降至未处理前的31％-57％。结论 乳腺癌MDA-MB435细胞表面唾液酸及α-2,6唾液酸化对肿瘤细胞的黏附有重要影响。     

Fucoidan干预小鼠肝癌淋巴道转移及其分子机制研究

【立论依据】 我国有辽阔的海域,海洋药物资源丰富,开发潜力巨大。随着陆地资源的日益枯竭,海洋药物开发研究已迫在眉睫。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是从Undaria pinnatifida孢子叶中提取富含L-岩藻糖和硫酸根的天然水溶性胞外杂聚糖,研究表明其具有抗凝血、抗肿瘤、降血脂等作用。恶性肿瘤患者的死亡主要是由于肿瘤的转移造成的,其中淋巴道转移是肿瘤转移的重要方式。HGF、C-Met及VEGF-C、VEGFR-3是转移通路中重要的细胞蛋白和膜表面受体蛋白,在转移中起着极其重要的作用。 【设计路思】 本实验以探究Fucoidan对小鼠肝癌淋巴道转移的影响为目的,检测了药物处理后肿瘤细胞转移相关蛋白VEGFR-3、C-Met及细胞外分泌因子VEGFC、HGF的变化,为临床肿瘤转移药物的开发应用提供前期基础研究依据。 【实验内容】 本研究以小鼠肝癌细胞系Hca-F为细胞模型,采用蛋白质印迹法、酶联免疫吸附剂测定法、聚合酶链式反应法、Transwell法等,检测药物对Hca-F细胞的转移、侵袭相关蛋白表达以及基因转录的影响。 【材料】 大连海域自然生长的裙带菜(Undaria pinnatifida)孢子叶、小鼠肝癌Hca-F细胞系、细胞和分子生物学实验所需试剂、抗体、Transwell小室等。 【可行性】 本课题组从裙带菜孢子叶中提取Fucoidan,对其进行纯化及理化性质分析,并对其抗肿瘤、免疫调节等活性进行研究,已完成对Hca-F细胞生长因子受体VEGFR-3和C-Met表达,以及生长因子VEGF-C和HGF的分泌进行检测。本实验设计合理,具有可行性。 【创新性】 目前对Fucoidan的研究主要集中于诱导肿瘤细胞凋亡,对其抗肿瘤侵袭转移的研究却鲜有报道。本实验以Hca-F细胞株为研究对象,探究Fucoidan对小鼠高淋巴道转移细胞Hca-F侵袭转移的影响,具有一定创新性。     

糖基因ST8SIA家族在人慢性粒细胞白血病多药耐药中的作用

【目的】 通过研究糖基因ST8SIA家族在人慢性粒细胞白血病(CML)细胞株KCL22及其耐阿霉素细胞株KCL22/ADR、CML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中表达的差异,明确糖基因ST8SIA家族与人CML多药耐药的相关性,为白血病耐药提供新的治疗策略和靶点。 【方法】 采用质谱技术检测KCL22及KCL22/ADR细胞表面N-糖链的组成差异;采用real-time PCR和蛋白质印迹法检测ST8SIA家族在人CML及其耐药细胞株、CML患者(28例)及CML耐药患者(48例)BMMC中的表达;通过RNA干扰技术特异性下调差异表达的糖基因,检测干扰前后CML细胞在体内、体外对化疗药物的敏感性、PI3K/Akt信号通路的激活情况及P-gp、MRP1的表达情况;特异性PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002 和Akt shRNA分别作用于KCL22/ADR细胞,检测抑制前后该细胞体内、体外对化疗药物的敏感性。 【结果】 KCL22和KCL22/ADR细胞膜表面N-糖链的组成、唾液酸具有显著差异;ST8SIA4和ST8SIA6在人CML及其耐药细胞株、CML患者BMMC中表达具有显著差异;特异性下调ST8SIA4或ST8SIA6的表达,改变KCL22/ADR和KCL22细胞体内、体外的药物敏感性、PI3K/Akt信号通路分子和P-gp、MRP1表达;KCL22/ADR细胞经LY294002和Akt shRNA分别作用后,PI3K/Akt主要信号通路分子表达水平降低,同时该细胞的药物敏感性也增强(P<0.05)。 【结论】 人CML细胞株及CML患者BMMC中ST8SIA家族的表达具有显著差异,这些特征性改变与CML多药耐药具有相关性;CML多药耐药性可能是通过ST8SIA4、ST8SIA6介导PI3K/Akt信号通路调控P-gp、MRP1的表达改变实现的。     

肝素酶基因过表达对小鼠肝癌细胞迁移的影响

目的 利用构建小鼠肝素酶正义pcDNA3.1(+)表达载体转染低转移潜能肝癌细胞系(Hca-F)，高转移潜能肝癌细胞系(Hca-P)，观察过表达小鼠肝素酶对肝癌细胞迁移的影响。方法 利用商业途径构建好的pcDNA3.1(+)-hpa质粒，利用lipofectamine2000作为转染试剂，将其分别转至Hca-F、Hca-P细胞株，采用微孔迁移法观察和检测肿瘤细胞粘附和转移情况。结果 转染有pcDNA3.1(+)-hpa质粒的细胞可以明显促进低转移潜能肝癌细胞系(Hca-F)和高转移潜能肝癌细胞系(Hca-P)的迁移功能(P<0.01)。结论 利用基因过表达技术表达肝素酶，可以明显促进肝癌细胞系的迁移和转移，为进一步研究阻断肝素酶基因表达治疗肝癌，明确肝癌预后靶点等奠定基础。 肝癌 肝素酶 鼠     

靶向ST6GalI的siRNA与反义寡核苷酸联合应用对结肠癌细胞转移能力的影响

目的探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响。方法设计并合成靶向ST6GalI的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA不同靶点)、ASO2组(与siRNA相同靶点)、siRNA ASO1组及siRNA ASO2组,应用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA水平,流式细胞术检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质的粘附与侵袭力。结果siRNA组、ASO1组、ASO2组、siRNA ASO1组、siRNA ASO2组中,SW480细胞的ST6GalImRNA表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均明显低于空白对照组、脂质体对照组(P<0.05),以siRNA ASO1组最明显,且siRNA ASO1组与siRNA组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而siRNA ASO2组与siRNA组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应。     

人肝癌与肝正常细胞系ST3Gal唾液酸转移酶家族表达差异的研究

目的：分析ST3Gal唾液酸糖基转移酶家族在不同肝细胞系表达的差异,为ST3Gal唾液酸糖基转移酶家族与细胞膜唾液酸糖链表达相关性研究奠定基础。方法：采用实时荧光定量PCR技术检测人正常肝细胞系L-02、人肝癌细胞系HepG-2、SMMC-7721中ST3Gal唾液酸转移酶家族全部成员ST3GalⅠ-Ⅵ的mRNA表达情况。结果：与L-02相比,HepG-2、SMMC-7721中ST3GalⅣ高表达;ST3GalⅠ、ST3GalⅤ、ST3GalⅥ低表达;ST3GalⅡ、ST3GalⅢ不稳定表达。结论：高表达的ST3GalⅣ可能是调节细胞膜表面唾液酸糖链的关键酶之一,并与肝癌细胞膜表面α2,3-唾液酸糖链表达增高相关。     

shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK的表达及细胞迁移和侵袭

目的：研究shRNA对小鼠肝癌细胞株Hca-F JNK基因表达的抑制作用及对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,阐明JNK表达水平与小鼠肝癌细胞淋巴转移潜能的关系。方法：构建3条shRNA表达载体,以脂质体法稳定转染Hca-F细胞;RT-PCR 和 Western blotting检测shRNA对JNK基因和蛋白表达的抑制作用,筛选出RNA干扰效果最好的shRNA;Transwell 实验检测Hca-F细胞穿膜细胞数观察shRNA对Hca-F细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。结果：成功构建pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞,筛选出对JNK表达抑制效果最好的shRNA;其转染后JNK mRNA表达水平与其他组比较明显下调 ( P<0.01 );JNK蛋白质表达水平与其他组比较明显减少 ( P<0.01 );转染shRNA后Hca-F细胞穿膜细胞数均显著下降（P<0.05）。结论：通过建立pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞株,获得JNK表达稳定下调的Hca-F细胞株,抑制JNK表达水平可降低小鼠肝癌细胞的迁移和侵袭能力,JNK可能是决定肝癌淋巴转移潜能的重要基因之一。     

不同小鼠腹水型肝癌细胞增殖侵袭能力与膜联蛋白A7的亚细胞定位和亚型表达研究

目的 探讨在小鼠淋巴道转移潜能不同的肝癌细胞中,肝癌细胞增殖侵袭能力与膜联蛋白A7的亚细胞定位和亚型的表达.方法 以小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移潜能不同的细胞株Hca-F细胞和Hca-P细胞为研究对象,通过CCK8法检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力;Western blotting方法检测膜联蛋白A7在体外增殖侵袭能力不同的肿瘤细胞中的亚细胞定位和亚型的变化.结果 发现Hca-F细胞无论是增殖能力还是侵袭能力都高于Hca-P细胞.膜联蛋白A7在Hca-F细胞和Hca-P细胞主要为47 kD亚型表达,而51kD亚型只少量表达于细胞浆.47 kD亚型在Hca-F细胞的细胞浆、细胞膜、细胞器膜以及细胞骨架中的表达均明显高于Hca-P细胞,分别为(73％±7％)vs(49％±19％)、(36％±8％) vs(24％±9％)和(53％±7％)vs(40％±12％)(均P＜0.05).结论 膜联蛋白A7的47 kDa亚型在细胞浆、细胞膜、细胞器膜和细胞骨架的定位表达,可能与肝癌细胞增殖侵袭能力密切相关.     

靶向ST6GalⅠ的siRNA与反义寡核苷酸联合应用对结肠癌细胞转移能力的影响

目的 探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal Ⅰ)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalⅠ高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响.方法 设计并合成靶向ST6GalⅠ的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染SW480细胞.实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA不同靶点)、ASO2组(与siRNA相同靶点)、siRNA ASO1组及siRNA ASO2组,应用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠ Mrna水平,流式细胞术检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质的粘附与侵袭力.结果 siRNA组、ASO1组、ASO2组、siRNA ASO1组、siRNA ASO2组中,SW480细胞的ST6GalⅠ Mrna表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均明显低于空白对照组、脂质体对照组(P＜0.05),以siRNA ASO1组最明显,且siRNA ASO1组与siRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),而siRNA ASO2组与siRNA组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 化学合成的靶向ST6GalⅠ的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalⅠ基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应.     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

肝刺激因子表达下调通过ERK促进肝癌细胞转移的研究

【目的】 肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)能促进肝细胞增殖、抑制肝细胞凋亡,是细胞内重要的存活因子。本课题组前期研究发现多种促癌因素可下调肝癌细胞中HSS的表达,其表达水平的降低可以促进肝癌细胞发生转移侵袭,但相关机制尚不明了。研究表明细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与肝癌转移,因此本研究旨在阐明HSS表达降低与EMT的关系并探究其中的分子机制。 【方法】 利用实验室已经构建好的稳定低表达HSS的HepG2细胞(shRNA)和稳定高表达HSS的HepG2细胞(HSS)作为研究对象,首先应用蛋白质印迹方法检测不同细胞的上皮细胞分子标志物(如E-cadherin和ZO-1)和间质细胞分子标志物(例如vimentin、fibronectin)表达的变化,确定HSS表达改变与EMT的关系;选择在EMT中发挥重要作用的激酶磷酸化抗体,利用蛋白质印迹的方法,筛选参与HSS表达下调诱导EMT发生的激酶,并应用特定激酶抑制剂,通过Transwell转移和侵袭实验,检测细胞迁移侵袭能力的改变,进一步确定候选激酶的作用;最后运用脾注射肝转移实验分析HSS表达下降与裸鼠生存率的关系。 【结果】 蛋白质印迹结果显示shRNA细胞的间质细胞分子标志物表达明显增高,上皮细胞分子标志物表达明显降低,说明HSS表达降低后肝癌细胞发生EMT。AKT和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在EMT的发生过程中具有重要作用,蛋白质印迹结果显示shRNA细胞中AKT磷酸化水平没有明显改变,但ERK的磷酸化水平明显增高;使用不同浓度的ERK抑制剂PD98059后进行trans-well迁移和侵袭实验,结果显示shRNA细胞无论迁出小孔还是穿过铺有基质胶的小孔的数目都明显减少,而且随着抑制剂浓度的增加,发生迁移侵袭的细胞数目随之减少,具有剂量依赖性,说明ERK在HSS表达降低诱导的EMT过程中具有关键的作用。脾注射shRNA细胞4周后,裸鼠体重明显下降,腹部变黑并明显增大,不足9周全部死亡,而注射HSS细胞后,裸鼠体重下降不明显,10周后才开始出现死亡,说明HSS表达降低后促进细胞的迁移侵袭使裸鼠生存时间明显缩短。 【结论】 肝刺激因子表达降低激活ERK,诱导肝癌细胞发生上皮-间质转化从而促进肝癌的转移。     

靶向ST6Gal Ⅰ的siRNA与ASO联合应用对宫颈癌细胞转移能力的影响

目的 探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal Ⅰ)小分子干扰RNA(siRNA)及其与反义寡核苷酸(ASO)联合应用对ST6Gal Ⅰ高表达的宫颈癌HeLa细胞的粘附和侵袭力的影响.方法 设计并合成靶向ST6Gal Ⅰ的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染HeLa细胞.实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA相同靶点)、ASO2组(与siRNA不同靶点)、siRNA ASO1组及siRNA ASO2组,用RT-PCR测定细胞中ST6Gal Ⅰ mRNA水平,流式细胞仪检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)的粘附与侵袭力.结果 转染后各实验组细胞的ST6Gal Ⅰ mRNA表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均低于空白对照组及脂质体对照组(P均＜0.05),以siRNA ASO2组调低作用最明显.其中siRNA组细胞的ST6Gal Ⅰ mRNA表达水平(0.55±0.08)、细胞表面α2,6-唾液酸含量(39.27±9.23)分别与siRNA ASO1组(0.54±0.09、38.27±7.74)比较,差异均无统计学意义,与siRNA ASO2组(0.33±0.09、9.10±0.40)比较,差异有统计学意义(P均＜0.05);siRNA组与siRNA ASO1组比较,细胞对ECM的粘附与侵袭力差异均无统计学意义,而siRNA ASO2组细胞对ECM的粘附与侵袭力较siRNA组降低(P均＜0.05).结论 化学合成的靶向ST6Gal Ⅰ的siRNA能够下调HeLa细胞中ST6Gal Ⅰ基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应.     

siRNA介导核干因子基因沉默抑制肝癌细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 核干因子(nucleostemin, NS)是最近发现的一个GTP结合蛋白,在神经干细胞、胚胎干细胞以及某些肿瘤细胞中均有表达。NS在多种肿瘤细胞增殖和凋亡调控中具有重要作用,然而其在肝癌中的作用尚未清楚。本研究通过检测其在不同肝癌细胞系和组织中的表达,并利用siRNA干扰技术,以探究NS在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用。 【方法】 以肝癌组织和多种肝癌细胞系为研究对象,首先通过定量PCR及蛋白质印迹法分析细胞及肝癌组织中NS的表达。接着通过siRNA瞬时转染的方法降低NS的表达,并通过定量PCR和蛋白质印迹法检测干涉效果,利用MTT试验和细胞增长实时监控技术检测细胞增殖情况,流式细胞术探究紫外线(ultraviolet, UV)或血清饥饿诱导下细胞凋亡情况。 【结果】 蛋白质印迹及定量PCR结果显示NS在多种肝癌细胞系及肝癌组织中都有较高的表达,且在MHCC97H和Bel7402细胞中,MTT试验和细胞增长实时监控显示降低NS的表达能够抑制细胞增殖,流式细胞术和蛋白质印迹结果显示NS基因沉默能够促进UV和血清饥饿诱导的细胞凋亡。即NS可能具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。 【结论】 NS在肝癌组织和细胞中都有较高的表达,在MHCC79H和Bel7402细胞中,降低NS表达可抑制细胞增殖,促进UV及血清饥饿诱导的细胞凋亡。     

去细胞肝支架诱导大鼠损伤肝脏再生的研究

【立论依据】 基于结合国内外对肝脏去细胞的研究及前期的基础,利用肝脏去细胞支架在体内诱导损伤肝组织的修复与再生。以解决肝功能衰竭供体缺乏,在外科手术后损失修复与再生的空缺。 【设计思路】 制造肝损伤模型研究去细胞支架对于肝脏损伤修复及再生的作用。 【实验内容】 通过外科手术造成大鼠肝脏损伤,移植去细胞支架修补创面;检测去细胞基质内生长因子含量与移植后支架内细胞的类型;观测移植后肝脏形态及内部结构的改变与蛋白表达情况。 【材料】 去细胞肝脏支架。 【可行性】 去细胞支架相较于其他生物材料具有完全模拟机体细胞的生存环境;去细胞支架含有的一系列黏附分子及生长因子是细胞与组织再生的关键因素;运用去细胞支架体外培养细胞已初具成效。 【创新性】 相较国外针对去细胞支架的体外研究,体内移植能模拟真正的体内生理环境;运用新型生物材料修复肝损伤。     

慢病毒载体法建立乳腺癌GFP-ST3稳定细胞株

目的 慢病毒载体法建立乳腺癌GFP-ST3稳定细胞株。 方法 采用PCR扩增α2,3-ST全长基因片段,克隆至慢病毒载体进行测序分析,将重组慢病毒载体转染人乳腺癌细胞,嘌呤霉素抗性筛选,经荧光显微镜观察、实时定量PCR、Western blot检测α2,3-ST的表达。 结果 成功构建了慢病毒载体pGLV5-H1-GFP-ST3,体外转染乳腺癌细胞后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,α2,3-ST mRNA表达和蛋白水平均明显升高(P<0.05),获得稳转细胞株。 结论 成功构建了绿色荧光蛋白为报告基因的α2,3-ST慢病毒载体,并在MDA-MB-231中稳定表达,为进一步研究乳腺癌细胞膜连α2,3-唾液酸水平增高与其侵袭和转移潜能的调控提供实验模型。     

Nogo-A分子对Neuro2A细胞突起生长的作用研究

【立论依据】 少突胶质细胞来源的Nogo-A分子,作为中枢神经系统损伤后重要的轴突抑制因子备受关注。近年来发现Nogo-A在神经元中呈现高表达,但是对于神经元中Nogo-A的自主性功能尚在起步研究阶段。我们更加关注,Nogo-A在神经元发育中潜在的功能。 【实验内容】 选择丙戊酸钠(VPA)诱导的神经母细胞瘤Neuro2A作为细胞分化模型,首先,考察Nogo-A分子在Neuro2A细胞未分化组,不同时间分化组中的表达模式;其次,利用RNA干扰技术下调Neuro2A细胞中内源性Nogo-A,考察细胞分化比例以及分化细胞中突起长度的变化情况。 【材料】 Neuro2A细胞系,VPA,DMEM培养基,胎牛血清,培养皿,Nogo-A抗体,免疫印迹相关耗材,shRNAs。 【可行性】 前期文献调研扎实。西安医学院科研平台拥有细胞培养室,可满足本实验中的细胞系培养。上述抗体已购置,针对Nogo-A的shRNAs已合成好。指导教师长期从事神经元分化与保护方面的研究,可提供了强有力的技术保障和实验指导。 【创新性】 少突胶质细胞表面的Nogo-A通过与神经元表面的NgR结合,激活RhoA-ROCK,进而抑制突起生长。近来大量的数据显示,神经元中的Nogo-A表达丰富,可能参与调控神经元的发生、分化。基于文献报道,本研究拟利用VPA诱导的Neuro2A细胞分化模型,明确Nogo-A在Neuro2A细胞分化过程中的表达变化,进一步利用RNA干扰策略下调内源性Nogo-A表达,通过细胞分化和突起生长的指标分析Nogo-A对Neuro2A细胞分化的影响,为研究神经元中Nogo-A的自主性功能提供依据。     

针对肝癌化疗耐药的多靶标siRNA的构建和功能鉴定

【立论依据】 肿瘤耐药机制复杂多样,是多基因,多步骤综合作用的结果,仅使用单一阻断的方法,尚不能取得令人满意的逆转效果。因此,针对肝癌多种耐药机理,设计和构建能降低肝癌细胞化疗耐药性的新型纳米药物是改善肝癌药物治疗效果的关键科学问题。近年来韩国科学家Dong-Ki Lee构建了一种可同时靶向4个癌基因(Survivin、β-catenin、STAT3、MET)的,由4个RNA双螺旋组成的四聚体RNAi(quadruple interfering RNAs, qiRNA),其转染效率和干扰效率优于传统的siRNA。 因此,本项目拟采用该策略,针对肝癌细胞膜上固有的高表达ABC蛋白和肝脏独特的代谢解毒机制以及肝癌干细胞的耐药机制,选取了4个多药耐药相关的关键基因:编码细胞膜上ABC转运蛋白的MDR1基因、参与肝细胞解毒功能的谷胱甘肽转移酶基因-GST pi、抑制细胞凋亡的Survivin基因和参与肝癌干细胞“干性”维持的Snail基因,将其构建成四合一的四聚体qiRNA;采用肝癌细胞耐长春新碱(VCR)耐药株(SMMC7721/VCR)作为多药耐药细胞,通过观察转染四聚体qiRNA后各个靶基因的表达情况以及细胞增殖、细胞凋亡和瘤体抑制率的变化,以评价四聚体qiRNA对改善肝癌细胞耐药性的效果。 【设计思路】 本项目围绕着降低肝癌化疗耐药性的科学问题,设计和构建针对肝癌不同耐药基因和信号通路的多靶点RNAi药物,并在细胞水平上检测其靶基因的干扰效率及肝癌耐药株细胞耐药性的改变,试图获得有效降低肝癌化疗耐药性的新型多聚siRNA,为开发新型的多靶点抗肿瘤药物奠定基础。 【实验内容】 (1)肝癌多药耐药相关基因siRNA序列的筛选。(2)多聚siRNA的构建与表征。(3)jetPEI介导多聚siRNA的抗肿瘤活性评价。 【材料】 肝癌药物敏感细胞株SMMC7721及肝癌耐长春新碱细胞株SMMC7721-VCR,qiRNA或NC序列的合成由广州瑞博生物有限公司完成。其他常规试剂实验室都有储存。 【可行性】 该实验设计思路新颖、制定的项目方案切实可行,项目组所在学校对学生实践创新及实验实训一贯积极支持和鼓励,匹配经费到位,配套扶持政策完善。因此,项目开展所需的人员、场地、实验设备、材料和经费等条件均可以保证。 【创新性】 (1)本课题首次构建一种新型的多靶点的单一多聚siRNA制剂。(2)课题组首次获得有效降低肿瘤多药耐药性的多靶点siRNA分子。     

B-Myb在肺癌中的作用与分子机制初探

【立论依据】 B-Myb是经典癌基因Myb家族的成员之一,其编码蛋白隶属于转录因子,在细胞周期和肿瘤发生发展过程中均具有重要作用。我们前期已发现,B-Myb在肺癌中表达异常上调,提示其在肺癌中具有重要作用,但其具体功能与分子机制仍不清楚,本课题拟对此进行研究。 【设计思路】 基于B-Myb在肺癌中表达上调,故选用“功能失活”策略进行研究。即:采用RNA干扰技术,抑制人肺癌细胞系H1299中B-Myb的高水平表达,构建B-Myb基因沉默稳定细胞株,分析B-Myb基因沉默后肺癌细胞的生长增殖、细胞周期和迁移侵袭能力以及全基因组基因表达谱的变化,由此初步揭示B-Myb在肺癌中的潜在作用与分子机制。 【实验内容】 首先,分别构建阴性对照和靶向B-Myb的RNA干扰质粒;然后,将上述质粒瞬时转染人肺癌细胞系H1299,结合嘌呤霉素抗性筛选和绿色荧光蛋白追踪,分别建立阴性对照和B-Myb基因沉默稳定细胞株,通过定量RT-PCR和蛋白质印迹技术检测确认B-Myb基因表达的抑制程度;最后,使用上述构建的稳定细胞株,分别采用MTT实验、流式细胞仪、软琼脂克隆形成实验、迁移侵袭实验对细胞的生长增殖、细胞周期分布、克隆形成能力和迁移侵袭能力进行分析,并通过基因芯片技术对全基因组基因表达谱进行检测。 【材料】 人肺癌细胞系H1299、细胞培养基、RNA干扰质粒、转染试剂、定量PCR试剂、B-Myb抗体、基因芯片等。 【可行性】 理论可行性:本课题是依据大量文献、我们的前期研究结果以及经典的分子肿瘤学理论,经过严密论证而提出。技术可行性:本课题采用的实验技术均为经典和成熟的肿瘤分子生物学研究技术,指导教师提供全程指导。 【创新性】 采用“功能失活”策略,综合运用RNA干扰、稳定细胞株构建、细胞表型分析和基因芯片技术,以期首次初步阐明B-Myb在肺癌中的作用与潜在分子机制,目前国内外尚未见报道。     

探究DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌淋巴道转移的影响

【立项依据】 转移是恶性肿瘤的基本特征,且癌细胞转移与细胞运动密切相关,而RhoA-ROCK通路可作用于肌球蛋白,参与细胞骨架重组,影响细胞运动。那么RhoA-ROCK通路与癌细胞转移是否有一定相关性呢?查阅相关资料得知,RhoA-ROCK通路确实能影响癌细胞转移,并可受DLC1调控抑制肝癌、胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤的生长,另有文献报道,用real-time PCR方法分析DLC1的mRNA表达量在乳腺癌非转移细胞系中比高转移细胞系中多。由此我们猜想DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌转移可能产生一定影响。于是我们拟选择DLC1、RhoA作为测定指标,探究DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌淋巴道转移的影响。 【实验内容】 分别选取已发生淋巴结转移和未发生转移的乳腺癌病变组织标本各25例,应用免疫组织化学法和蛋白质印迹法检测DLC1、RhoA在两组标本中的表达,对实验结果进行分析。 【材料】 已发生淋巴结转移和未发生转移的乳腺癌病变组织标本,DLC1抗体,RhoA抗体,相关试剂盒。 【可行性】 (1)应用免疫组织化学法预实验结果显示,发生转移与未发生转移的乳腺癌病变组织比较:DLC1表达较少,RhoA表达较多,二者间差异有统计学意义,用spearman等级相关分析显示DLC1与RhoA间存在相关性,由此提示乳腺癌淋巴道转移与DLC1、RhoA-ROCK通路可能存在一定联系。(2)已有文献报道从理论上支持我们通过检测两组标本中DLC1、RhoA的表达来探究其与乳腺癌淋巴道转移的关系。 【创新性】 (1)学习《病理生理学》,获知RhoA-ROCK通路可影响细胞运动,而学习《病理学》,我们知道癌细胞转移是恶性肿瘤的基本特征,本课题将病理生理学与病理学知识相联系,由RhoA-ROCK通路影响细胞运动联想到乳腺癌淋巴道转移。(2)大量文献报道DLC1能通过抑制RhoA-ROCK通路发挥抑癌作用,但其是否会影响乳腺癌淋巴道转移的文献却未见发表。(3)经实验探究,初步认识到DLC1能通过抑制RhoA-ROCK通路而抑制乳腺癌淋巴道转移,若进一步探究DLC1抑制RhoA-ROCK通路的机制,将为临床上抑制乳腺癌淋巴道转移提供新的治疗靶点和理论依据。