调控骨桥蛋白介导的中性粒细胞浸润减轻脓毒症小鼠肺损伤的研究

目的探讨骨桥蛋白（OPN）中和抗体处理对脓毒症小鼠生存情况的影响及其加剧急性肺损伤的机制。 方法将80只雄性小鼠分成假手术组（Sham组）、脓毒症组[盲肠结扎穿孔术（CLP）组]、阴性对照组[CLP+免疫球蛋白G（IgG）组]及OPN中和抗体组（CLP+ OPN Ab组）,每组各20只。采用CLP制备脓毒症小鼠模型,Sham组除不结扎和穿刺盲肠外,其余手术步骤相同。建模成功即刻,CLP+ IgG组及CLP+ OPN Ab组小鼠分别经颈内静脉注射IgG和OPN单抗,Sham组和CLP组注射等量磷酸盐缓冲液。每组10只用于观察小鼠活动状态及术后7 d存活情况;另外10只分别于术后24 h采集眼眶血及收集肺组织用于OPN及髓过氧化物酶（MPO）检测。比较4组小鼠血清、肺组织OPN信使RNA（mRNA）水平和肺组织中OPN蛋白水平,外周血丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、白细胞介素6（IL-6）、趋化因子配体2（CXCL-2）和MPO活性。 结果术后第7天,Sham组小鼠10只均存活;CLP组及CLP+ IgG组分别有2只存活,而CLP+ OPN Ab组仍有4只小鼠存活。4组小鼠7 d存活情况比较,差异有统计学意义（χ² = 17.374,P = 0.001）。且与Sham组相比,CLP组、CLP+ IgG组和CLP+ OPN Ab组小鼠存活情况均显著降低（P均< 0.05）;而CLP组、CLP+ IgG组和CLP+ OPN Ab组小鼠存活情况比较,差异均无统计学意义（P均> 0.05）。CLP术后24 h,4组小鼠血清、肺组织OPN mRNA水平和肺组织中OPN蛋白水平,外周血中ALT、AST、LDH、IL-6、CXCL-2、MPO活性比较,差异均有统计学意义（F = 84.227、51.929、41.563、19.558、55.416、75.968、32.824、176.945、119.046,P均< 0.05）。进一步两两比较发现,CLP组、CLP+ IgG组和CLP+ OPN Ab组小鼠血清、肺组织OPN mRNA水平和肺组织中OPN蛋白水平,外周血中ALT、AST、LDH、IL-6、CXCL-2、MPO活性均较Sham组显著增高,且CLP组和CLP+ IgG组更高（P均< 0.05）。 结论OPN单抗中和OPN可调控脓毒症小鼠肺内中性粒细胞浸润,减轻急性损伤,提示OPN可作为脓毒症急性肺损伤的治疗靶点。     

烟酸对脓毒症小鼠急性胃肠道损伤的保护作用

目的评价烟酸对脓毒症小鼠胃肠道损伤的保护作用。 方法将36只健康雄性清洁级成年C57BL/6小鼠分为假手术组、盲肠结扎穿孔（CLP）组和CLP+烟酸组，每组12只。假手术组小鼠仅开腹后立即缝合处理，CLP组小鼠行CLP术，CLP+烟酸组小鼠CLP建模后10 min经腹腔注射烟酸（360 mg/kg），稀释至相同体积。造模后24 h眼球取血，查血清；通过检测血浆水平评价肠道损伤程度；检测血清白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、内毒素、二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸含量，摘取其肠道用于组织病理学检查，光镜下观察小肠组织病理形态变化，并进行肠组织损伤分级即Chiu评分。 结果假手术组小鼠肠道解剖基本正常，肠管未见扩张，无充血、渗出，肠道无粘连；CLP组小鼠结扎端盲肠发黑，腹腔内脓性物渗出，肠管明显扩张；CLP+烟酸组小鼠炎症反应较CLP组减轻。病理结果显示，假手术组小鼠肠黏膜形态完整，绒毛结构清晰；CLP组小鼠肠黏膜结构紊乱，固有层及其血管暴露，上皮细胞脱落；CLP+烟酸组小鼠肠黏膜损伤程度减轻，部分绒毛脱落，间质及基地开始修复。假手术组、CLP组和CLP+烟酸组小鼠Chiu评分比较，差异有统计学意义[（0.75 ± 0.75）、（4.25 ± 0.75）、（2.67 ± 0.89）分，F = 57.469，P<0.001]，CLP组和CLP+烟酸组小鼠Chiu评分均较假手术组显著升高，且CLP组更高（P均<0.05）。3组小鼠血TNF-α、IL-1β、血内毒素、DAO和D-乳酸比较，差异均有统计学意义（F = 30.394、46.632、920.356、1 184.639、5.184，P均<0.05）。进一步两两比较发现，与假手术组比较，CLP组和CLP+烟酸组小鼠血TNF-α、IL-1β、血内毒素、DAO均显著升高，且CLP组更高（P均<0.05）；而CLP组小鼠D-乳酸较假手术组和CLP+烟酸组均有所升高（P均<0.05）。 结论烟酸可减轻脓毒症小鼠胃肠道损伤及炎症反应，具有保护作用。     

中药912液对脓毒症大鼠心肌损伤保护的实验研究

目的观察盲肠结扎穿孔术（CLP）脓毒症模型大鼠心肌损伤的发生情况，以及应用中药912液进行干预的效果及其对心肌的保护作用机制。方法采用CLP制备脓毒症大鼠模型；按照随机数字表法分组。共有56只存活Wistar大鼠进入该实验，其中假手术组8只，CLP模型组24只，中药912液治疗组24只，后两组再分为术后3、24和72h3个时间点亚组。观察各组不同时间点心肌损伤指标[肌钙蛋白T（TnT）、脑钠素（BNP）]，血清炎症因子水平[肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-10]和血浆一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的动态变化。结果CLP模型组大鼠术后3h血浆TnT、TNF-α、IL-6、NO、MDA水平即开始较假手术组明显升高，BNP、IL-10到24h时也明显升高（P〈0．05或P〈0．01）；而中药912液组的TnT、BNP、TNF-α、IL-6、NO、MDA虽较假手术组升高，但明显低于CLP模型组，IL-10则高于CLP模型组（P〈0．05或P〈0．01）。结论脓毒症后可出现明显的心肌损伤，中药912液可通过抑制NO和自由基介导的组织损伤改善脓毒症时的心肌损伤。     

持续静脉泵注利多卡因对脓毒症大鼠急性肺损伤及炎症反应的影响

目的探讨利多卡因对脓毒症大鼠肺损伤及炎症因子表达的影响。 方法采用随机数字表法将60只雄性成年Sprague Dawley大鼠分为假手术组、盲肠结扎穿孔（CLP）组、利多卡因组和乌司他丁组,每组各15只。假手术组大鼠打开腹腔后缝合,其他各组采用CLP法制备脓毒症模型。利多卡因组大鼠在给予10 mg/kg的负荷剂量后,以10 mg·kg^-1·h^-1的剂量通过尾静脉持续泵注利多卡因3h;乌司他丁组大鼠进行CLP的同时,以100 000 U·kg^-1·h^-1的剂量通过尾静脉持续泵注乌司他丁3 h;假手术组和CLP组用等量等渗NaCl溶液代替。于CLP后24 h处死大鼠,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）表达水平;实时荧光定量PCR检测肺组织HMGB1 mRNA表达水平;苏木素-伊红（HE）染色法观察各组大鼠肺组织病理变化。另取40只大鼠（每组10只）用于观察4组大鼠72 h死亡情况。 结果4组大鼠血清中TNF-α、IL-6、HMGB1及HMGB1 mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义（F = 189.886、237.952、175.999、179.491,P均< 0.001）。进一步两两比较发现,与假手术组比较,CLP组、利多卡因组和乌司他丁组血清TNF-α、IL-6、HMGB1及HMGB1 mRNA表达水平均显著升高（P均< 0.05）;与CLP组比较,利多卡因组和乌司他丁组血清TNF-α、IL-6、HMGB1及HMGB1 mRNA表达水平均显著降低（P均< 0.05）;与利多卡因组比较,乌司他丁组IL-6表达水平显著升高（P < 0.05）。HE染色结果显示,假手术组大鼠肺泡大小均匀、结构完整,肺泡上皮细胞形态正常;CLP组大鼠肺泡间隔增厚、间质充血水肿、炎症细胞浸润、肺泡塌陷;而利多卡因组和乌司他丁组病理学改变较CLP组均明显减轻,肺组织轻度水肿,肺泡及肺间质出现少量炎症。四组大鼠死亡构成比（0 /10、9/1、4/6、3/7）比较,差异有统计学意义（χ²=17.500,P < 0.001）。CLP组、利多卡因组和乌司他丁组大鼠死亡构成比均较假手术组显著升高（P均<0.008）;利多卡因组和乌司他丁组大鼠死亡构成比均较CLP组显著降低（P均<0.008）;而利多卡因组和乌司他丁组大鼠死亡构成比比较,差异无统计学意义（P > 0.008）。 结论持续静脉泵注利多卡因可以有效降低脓毒症大鼠炎症因子TNF-α、IL-6及HMGB1的表达,抑制肺组织中HMGB1 mRNA表达量,减轻脓毒症对肺组织的损伤,有效提高动物存活率,其减轻脓毒症炎症反应及肺保护作用疗效与乌司他丁相似。     

高迁移率族蛋白B1 / Toll样受体4信号通路在脓毒症大鼠致急性肺损伤中的作用研究

目的探讨高迁移率族蛋白B1（HMGB1） / Toll样受体4（TLR4）信号通路对脓毒症导致的急性肺损伤大鼠的影响。 方法将60只清洁级雄性Sprague Dawley大鼠分为假手术组、脓毒症组和实验组,每组各20只。假手术组大鼠麻醉后开腹翻动肠道,随即关腹;脓毒症组和实验组行盲肠结扎穿孔（CLP）术后0.5 h于尾静脉分别注射等渗NaCl溶液（4 mL / kg）及抗HMGB1单克隆抗体（2 mg / kg）。各组分别取10只用于观察大鼠CLP建模后7 d存活情况,其余大鼠于造模后24 h处死并留取肺组织标本。计算各组大鼠的肺损伤Smith评分,并比较各组大鼠HMGB1和TLR4阳性蛋白在肺组织中的表达水平。采用酶联免疫吸附测定检测各组大鼠肺泡灌洗液（BALF）中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、HMGB1和TLR4水平,计算每个巨噬细胞内微球蛋白数以比较各组大鼠肺泡巨噬细胞（AM）的吞噬功能,并采用Western-blotting法测定AM内HMGB1、TLR4蛋白表达水平。 结果假手术组大鼠建模后7 d全部存活,脓毒症组大鼠仅3只存活,实验组大鼠5只存活。各组大鼠间存活情况的比较,差异有统计学意义（ χ² = 10.833,P = 0.004）;且假手术组大鼠的存活情况明显优于脓毒症组与实验组大鼠（P均< 0.017）,而脓毒症组与实验组大鼠间存活情况比较,差异无统计学意义（P = 0.120）。假手术组、脓毒症组及实验组大鼠间肺组织损伤评分[（2.20 ± 0.27）、（8.20 ± 1.27）、（4.25 ± 2.21）分,F = 56.432,P < 0.001],肺组织HMGB1阳性蛋白[（10.4 ± 1.5）、（34.4 ± 5.0）、（26.6 ± 6.9）,F = 35.203,P = 0.003]、TLR4阳性蛋白[（10.6 ± 2.1）、（48.0 ± 5.8）、（38.2 ± 5.3）,F = 103.414,P = 0.002],BALF中TNF-α[（19 ± 4）、（45 ± 4）、（35 ± 4）μg / L,F = 2.749,P < 0.001]、IL-6[（56 ± 19）、（86 ± 15）、（70 ± 19）μg / L,F = 4.648,P = 0.001]、HMGB1[（41 ± 18）、（70 ± 15）、（56 ± 12）μg / L,F = 7.254,P = 0.002]、TLR4[（20.9 ± 1.8）、（51.2 ± 1.6）、（49.8 ± 2.6）μg / L,F = 3.978,P = 0.035],AM的吞噬功能[（21.8 ± 2.7）、（3.1 ± 1.9）、（12.6 ± 2.2）个,F = 32.821,P = 0.001]及AM中HMGB1蛋白[（11 ± 3）、（40 ± 15）、（24 ± 13）,F = 7.253,P < 0.001]、TLR4蛋白[（0.9 ± 0.4）、（1.2 ± 0.6）、（1.1 ± 0.4）,F = 3.984,P = 0.028]的比较,差异均有统计学意义。进一步两两比较发现,脓毒症组与实验组大鼠肺组织损伤评分,肺组织HMGB1阳性蛋白、TLR阳性蛋白表达水平,BALF中TNF-α、IL-6、HMGB1水平及AM中HMGB1蛋白表达水平均明显高于假手术组大鼠,且脓毒症组大鼠更高（P均< 0.05）;脓毒症组及实验组大鼠AM的吞噬功能均显著低于假手术组,且脓毒症组更低（P均< 0.05）;脓毒症组及实验组大鼠BALF中TLR4水平及AM中TLR4蛋白表达水平均显著高于假手术组（P均< 0.05）,但脓毒症组与实验组间上述指标的比较,差异均无统计学意义（P均> 0.05）。 结论通过抑制HMGB1 / TLR4信号通路可以缓解脓毒症致肺损伤大鼠肺组织的炎症损伤,抑制炎症介质过度释放,并增强AM的细胞吞噬功能。     

微小RNA-214对脓毒症小鼠心肌损伤的作用北大核心CSCD

目的探讨微小RNA-214（miRNA-214）对脓毒症小鼠心肌损伤的作用。方法清洁级雄性昆明小鼠66只,体质量25～30g,随机（随机数字法）分为4组：假手术组（Sham组,n=18）、脓毒症组（CLP组,n=18）、miRNA-214前体＋脓毒症组（前体组,n=12）、miRNA-214抑制剂＋脓毒症组（抑制剂组,n=12）,其余6只小鼠应用载有miRNA-214前体和抑制剂的腺病毒转染用于空载病对照及miRNA-214转染情况检测。采用盲肠结扎穿孔术（CLP）制备小鼠脓毒症模型。Sham组开腹寻找盲肠,不结扎穿孔;前体组、抑制剂组转染后行CLP术。Sham、CLP组小鼠分别于术后6、12、24h时取心肌组织采用实时荧光定量聚合酶链反应法（RT—PCR）测定miRNA-214表达。于术后12、24h时采用酶联免疫法（ELISA）测定各组心肌组织炎症因子和血清心肌酶浓度;术后24h时采用流式细胞技术测定心肌细胞凋亡率,光镜下观察心肌组织病理学结果。采用SPSS13．0统计学软件进行分析,应用单因素方差分析进行组间差异比较。结果（1）与Sham组比较,CLP组术后6、12、24hmiRNA-214表达分别升高2．28倍、1．89倍、1．53倍（F值分别为280．198,82．48,30．65;均P〈0．05）;（2）与CLP组术后12h比较,转染miRNA-214前体小鼠miRNA-214表达水平升高1．86倍,转染抑制剂小鼠miRNA-214表达下降84．5％（F：394．773;P〈0．05）;（3）与CLP组比较,前体组小鼠术后12、24h心肌组织上清液肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）,血清肌钙蛋白（cTnI）及脑钠肽（BNP）水平降低,白介素-10（IL-10）水平升高;反之,抑制剂组各指标水平升高,IL．10水平降低（12hF值分别为72．819,88．851,147．546,65．256,102．72;24hF值分别为50．836,76．167,100．290,60．763,52．580;均P〈0．05）;（4）与CLP组比较,前体组小鼠术后24h心肌细胞凋亡率下降,抑制剂组升高（F=151．076;P〈0．05）;（5）前体组小鼠心肌组织病理学损伤较CLP组、抑制剂组减轻。结论在CLP所致的小鼠心肌损伤中miRNA-214表达增加,且miRNA-214对CLP诱导的心肌损伤有保护作用。     

微小RNA-155在脓毒症小鼠肝脏内的表达变化及作用研究

目的 探讨肝组织中微小RNA-155(miR-155)表达在脓毒症小鼠肝损伤中的作用.方法 按随机数字表法将120只BALB/c小鼠分为脓毒症组和正常对照组,每组60只.腹腔注射脂多糖(LPS)20 mg/kg复制脓毒症模型,术后0、2、6、12、24、48 h每组各取10只小鼠的血及肝组织标本.用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清和肝组织匀浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-10)及血清丙氨酸转氨酶(ALT)含量,并观察肝组织病理改变;用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中miR-155的表达.结果 脓毒症组血清和肝组织匀浆中TNF-α、IL-6、IL-10水平均随制模时间延长呈升高趋势,TNF-α、IL-6达高峰后逐渐降低,但仍高于对照组水平;TNF-α(ng/L)于2h达高峰(血清:1538.46±102.12比64.52±18.44,肝:255.26±41.23比60.21±13.55),IL-6(μg/L)于6h达高峰(血清:875.33±102.37比153.72±20.67,肝:9.22±0.82比3.35±0.36),IL-10(ng/L)于48 h达高峰(血清:520.13±88.52比23.43±3.01,肝:260.12±50.38比16.37±3.71),与正常对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).脓毒症组血清ALT活性(U/L)随制模时间延长逐渐增加,至48 h达高峰(603.26±70.21比45.84±5.64),与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).注射LPS后12h,肝组织结构紊乱,大量炎性细胞浸润,肝细胞水肿、坏死;肝组织中miR-155相对表达量在注射LPS后2h开始升高,12h达高峰,为正常对照组的(72.96±9.34)倍(P＜0.05).结论 MiR-155表达增加在脓毒症肝损伤机制中起重要作用.     

还原型谷胱甘肽对大鼠脓毒症肺损伤外周血淋巴细胞凋亡率及TNF-α、IL-6水平的影响

目的观察还原型谷胱甘肽对大鼠脓毒症肺损伤外周血淋巴细胞凋亡率及血浆细胞因子TNF-α、IL-6水平的影响，探讨还原型谷胱甘肽对大鼠脓毒症肺损伤的保护作用及其机制。方法应用盲肠结扎穿孔（CLP）法复制大鼠脓毒症肺损伤模型。将清洁级雄性SD大鼠112只，随机分成假手术组（Sham）、脓毒症肺损伤组（ALI）、还原型谷胱甘肽治疗组（GSH）、左旋氧氟沙星治疗组（LEV），每组再分为3、6、12、24h等4个亚组，每个亚组n=7。观察大鼠脓毒症肺损伤肺组织的病理形态学改变，并检测外周血淋巴细胞凋亡率及血浆TNF-α、IL-6水平的变化。结果在脓毒症肺损伤组及左旋氧氟沙星治疗组淋巴细胞凋亡率较假手术组及GSH治疗组明显升高（P〈0．05）；在脓毒症肺损伤组血浆TNF-α水平在CLP术后6h出现升高，较GSH治疗组升高明显（P〈0．01）。脓毒症肺损伤组大鼠血浆IL-6水平于CLP术后3h升高，GSH治疗组CLP术后3h血浆IL-6水平较脓毒症肺损伤组低（P〈0．05）。脓毒症肺损伤组大鼠病理显示明显肺损伤，GSH治疗组大鼠肺损伤程度明显减轻。结论还原型谷胱甘肽能显著抑制外周血淋巴细胞凋亡及血浆TNF-α和IL-6表达水平，对大鼠脓毒症急性肺损伤具有明显的保护作用。     

miR-155对脓毒症急性肺损伤肺泡巨噬细胞IL-6、IL-10及MIP-2的影响

目的探讨微小核糖核酸155（miR-155）对脓毒症急性肺损伤（ALI）肺泡巨噬细胞白介素（IL）-6、IL-10及巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）的影响。 方法健康清洁C57BL/6雄性小鼠（6~8周,18~20 g）15只,随机分为对照组、脓毒症组和miR-155 antagomir 3组,每组5只,其中miR-155 antagomir组小鼠中将miR-155 antagomir试剂经尾静脉注射,对照组和脓毒症组小鼠注射等量0.9%NaCl,观察24 h后,脓毒症组和miR-155 antagomir组采用盲肠结扎穿孔（CLP）法制备脓毒症ALI动物模型,对照组仅翻动盲肠进行对照,观察3组小鼠生命体征变化,模型制备6 h后,3组小鼠均取左肺下叶行苏木精-伊红（HE）方法进行染色,在光镜下观察肺病理形态变化,取右肺下叶检测干湿重比,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆IL-6、IL-10、MIP-2浓度。 结果HE染色结果表明：脓毒症组和miR-155 antagomir组小鼠肺内均出现肺泡结构破坏、炎症细胞浸润、间质增厚、出血,miR-155 antagomir组肺组织炎性表现较脓毒症组显著减轻。3组干湿重比结果显示：脓毒症组干湿重比［（0.16±0.01）%］明显低于对照组［（0.22±0.01）%］和miR-155 antagomir组［（0.19±0.01）%］,miR-155 antagomir组低于对照组,差异具有统计学意义（均P<0.05）。ELISA结果显示：脓毒症组的血浆IL-6浓度［（171.35±10.41）pg/ml］、MIP-2浓度［（299.71±19.82）pg/ml］显著高于对照组［（125.74±4.41）pg/ml;（214.00±14.93）pg/ml］和miR-155 antagomir组［（144.41±6.29）pg/ml;（270.38±11.96）pg/ml］,IL-10浓度［（283.58±19.90 ）pg/ml］显著低于对照组［（370.27±15.41）pg/ml］和miR-155 antagomir组［（333.30±16.49）pg/ml］,miR-155 antagomir组的血浆IL-6、MIP-2浓度高于对照组,IL-10浓度明显低于对照组,差异具有统计学意义（均P<0.05）。 结论脓毒症ALI时miR-155过度表达,过度表达的miR-155能促进肺泡巨噬细胞释放大量促炎因子而抑制抗炎因子的表达,引起促炎因子及抗炎因子失衡,发生不可控炎症反应,而miR-155 antagomir能够拮抗miR-155的表达,抑制肺泡巨噬细胞释放促炎因子IL-6及趋化因子MIP-2,上调抗炎因子IL-10的表达,进一步抑制中性粒细胞及肺泡巨噬细胞聚集,防止产生更多的炎症介质,有效控制肺部炎症反应的发生,对肺起到一定的保护作用。     

急性缺血性脑卒中小鼠模型脑组织中miR-21 表达对炎症反应和细胞凋亡的影响及相关机制研究

目的 研究急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke, AIS）小鼠模型脑组织中miR-21 表达对炎症反应和细胞凋亡的影响,并探讨其相关分子机制。方法 选取C57/BL6 小鼠30 只随机均分为假手术组、短暂局灶性大脑中动脉闭塞（tran-sient middle cerebral artery occlusion,tMCAO）模型组（利用线栓法构建短暂局灶性大脑中动脉闭塞小鼠模型）及miR-21 agomir 激动剂预处理组（tMCAO 术后侧脑室注射miR-21 agomir 激动剂）。RT-PCR 法检测小鼠脑组织中miR-21 表达水平;改良神经严重程度评分（modified neurological severityscore,mNSS）评估小鼠神经功能;2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法检测小鼠脑梗死体积;酶联免疫吸附法检测炎症因子（TGF-β1,TNF-α,IL-18 和IL-10）水平变化;原位末端标记（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediatednick end labeling,Tunel）法观察小鼠神经细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法检测TLR4/NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白及凋亡蛋白（Bcl-2/Bax）表达情况。结果 假手术组﹑ tMCAO 模型组和miR-21 agomir 组小鼠脑组织中miR-21 表达水平分别为0.83±0.17,0.50±0.11 和1.55±0.32,组间差异有统计学意义（F=43.805,P<0.05）。假手术组小鼠神经功能mNSS 评分均为0 分,tMCAO 组mNSS 评分明显高于miR-21 agomir 组（11.30±3.42 vs 5.61±1.73）,差异有统计学意义（t=12.784,P<0.05）。假手术组小鼠脑组织未出现梗死现象,tMCAO 组脑梗死体积（62.72%±5.30%）高于miR-21 agomir 组（38.22%±3.31%）,差异有统计学意义（t=31.309,P<0.05）。与tMCAO 组比较,miR-21 过表达明显降低促炎因子TNF-α 和IL-18 水平,升高抗炎因子TGF-β1 和IL-10 水平,差异均有统计学意义（t=3.785 ～ 9.693,均P<0.05）。假手术组脑组织皮层细胞凋亡数约为9.40±5.21 个,明显低于 tMCAO 组的75.52±12.81 个,差异有统计学意义（t=38.552,P<0.05）;miR-21 agomir 组细胞凋亡数约为42.41±9.62 个,低于tMCAO 组,差异有统计学意义（t=19.174,P<0.05）。与tMCAO 组比较,miR-21 过表达组小鼠脑组织中TLR4, NF-κB,p-NF-κB 和NLRP3 蛋白表达降低,Bcl-2/Bax 表达升高,差异均有统计学意义（t=2.314 ～ 3.098,均P ＜ 0.05）。结论 miR-21 在急性缺血性脑卒中后小鼠脑组织中表达明显下降,其过表达可以调节脑缺血后促炎因子和抗炎因子之间的平衡,改善皮层细胞凋亡,可能是通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3 通路发挥脑损伤保护作用。     

脓毒症小鼠CD4~+ CD25~+ Foxp3~+T细胞变化及其意义

目的观察脓毒症小鼠血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的变化特点,探讨它与脓毒症病程发展间的关系。方法选择清洁级KM雄性小鼠,用盲肠结扎穿孔术(CLP)制作脓毒症小鼠模型(CLP组),分别于2h、6h、12h、24h、48h、72h采血处死12只,并留取远端回肠HE染色光镜检查;流式细胞仪检测血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞计数及其占CD4+T细胞的百分比,ELISA法测定细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10的表达水平,全自动生化分析仪检测AST、ALT、BUN、Cr等肝肾功能生化指标。以假手术组(Control组)作为对照,标本采集时间点、检测方法同CLP组。结果 CLP组血CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞百分比持续增高,12h后即高于假手术组,随病程进展增高更为显著(P<0.01)。CLP2h后TNF-α水平升高即超过假手术组(P<0.01),12h到达顶峰,随后开始下降,但至CLP后72h仍高于假手术组;IL-6水平于CLP后6h出现快速升高,12h达到峰值,与假手术组相比增幅有统计学差异(P<0.01),随后下降,72h与假手术组比较无统计学差异(P>0.05);CLP2h后IL-10水平即已高于假手术组(P<0.01),12h出现快速上升改变,并持续攀升,至72h未见下降拐点。CLP后ALT、AST升高早于BUN、Cr,前者术后24h明显升高,增幅大于假手术组(P<0.01),而后者术后48h明显升高,增幅大于假手术组(P<0.01),随着时间的延长,ALT、AST、BUN、Cr均进一步升高,假手术组指标则回落到基线水平。结论 CLP小鼠模型CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例增加与脓毒症严重程度成正比,这种变化可能是机体逃避过度的炎症反应引发严重的组织器官损伤的自身调节反应,但有一定限度,调控Treg或将为脓毒症免疫调节治疗提供新的思路。     

影响脓毒症受损肠黏膜修复的机制

目的 探讨影响脓毒症肠黏膜损害后修复的因素。方法 采用肓肠结扎穿孔(CLP)所致脓毒症模型,分别以CLP后6,24,48 h不同时间段观测肠黏膜损伤程度和修复过程,前者包括形态学观察及细胞凋亡的测定,后者包括肠黏膜修复的杯状细胞变化、黏膜肠三叶因子3(TFF3)、转化生长因子β1(TGF-β1)以及TNF-α、IL-1含量。结果 形态学观察显示肠黏膜呈持续损害状态,6h的损害积分明显小于24h,48 h组(P＜0.05),后两组之间差异无统计学意义(P＞0.05);磷酸化caspase-3蛋白在3组均高于sham组4倍以上;黏膜IL-1,TNF-α含量明显高于sham组3～4倍,其中24h及48 h组明显高于6h组。肠黏膜的修复过程不明显,损伤黏膜未见到明显的杯状细胞积聚;TFF3在6h组轻度增高,24h及48 h组表达下降;杯状细胞数量在CLP的3个组明显减少;TGF-β1在6h组增高,其他两组均接近于sham组。结论 严重脓毒症肠黏膜持续的高炎症状态、杯状细胞功能以及黏膜重建能力下降,影响了受损肠屏障的修复。     

脓毒症大鼠血清巨噬细胞移动抑制因子和肿瘤坏死因子-α表达的相关性及肝素对其水平的影响

目的:观察脓毒症大鼠血清巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达及其相关性;并观察小剂量肝素对两者的影响。方法:雌性Wistar大鼠49只,随机分为假手术组(7只)、脓毒症组(21只)、肝素干预组(21只),以CLP法复制大鼠脓毒症模型,于不同时间点测定大鼠血清MIF及TNF-α水平。结果:脓毒症组及肝素干预组大鼠血清MIF和TNF-α水平显著高于假手术组(均P<0.05),肝素干预组各时间点大鼠血清MIF及12、24h时间点TNF-α水平显著低于相应脓毒症组(均P<0.05),两组血清MIF与TNF-α水平变化呈正相关(脓毒症组r=0.859,肝素干预组r=0.711)。结论:脓毒症大鼠血清MIF及TNF-α水平均显著升高,早期应用小剂量肝素可减轻炎症反应,两种炎性因子的变化呈正相关。     

脓毒症早期大鼠肾上腺皮质功能变化及地塞米松的干预作用

目的 探讨脓毒症早期是否存在相对肾上腺皮质功能不全及其可能的发病机制,以及地塞米松替代治疗的时机.方法 雄性Wistar大鼠260只,随机均分为正常对照组、假手术组、模型组[行盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症模型]、激素预处理组(CLP前腹腔注射10 mg/kg地塞米松)、激素治疗组(CLP后7 h腹腔注射10 ml/kg地塞米松),各组再分为2、4、6、8、12 h时间点.于8 h和12 h给予促肾上腺皮质激素(ACTH)刺激实验,于刺激前及刺激后30 min用放射免疫分析法测定血清皮质醇浓度;用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肾上腺Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达;透射电镜下观察肾上腺皮质束状带超微结构;其余大鼠观察12 h存活情况.结果 ①模型组、激素预处理组和治疗组刺激前血清皮质醇浓度显著高于正常对照组和假手术组,且预处理组明显高于模型组和治疗组(P均＜0.05),但ACTH刺激前后血清皮质醇浓度均无明显变化.②模型组肾上腺TLR4、TNF-α的mRNA表达较假手术组明显升高(P＜0.05或P＜0.01),激素预处理组和治疗组肾上腺TLR4、TNF-α的mRNA表达较模型组明显下降,且预处理组可降至假手术组水平.⑧模型组、激素预处理组和治疗组肾上腺皮质超微结构发生代谢性改变,其中以模型组为重.④激素预处理组、治疗组大鼠12 h生存率均明显高于模型组(76.92%、40.00%比33.33%,P＜0.01和P＜0.05),且激素预处理组高于治疗组(P＜0.05).结论 ①脓毒症早期即存在相对肾上腺皮质功能不全;②肾上腺TLR4、TNF-α mRNA的表达和超微结构变化可能参与了相对肾上腺皮质功能不全的发生;③地塞米松可以降低肾上腺TLR4、TNF-α mRNA的表达,减轻超微结构变化,提高生存率,改善预后,且早期应用效果更理想.     

慢性血吸虫感染对脓毒症小鼠保护作用的研究

目的 初步探讨慢性血吸虫(SJ)感染对脓毒症小鼠的保护作用及其机制.方法 选择BALB/c雄性小鼠,按随机数字表法分组进行三部分实验.实验1:经腹部皮肤接种SJ尾蚴感染8周建立慢性SJ感染模型,分为正常组和SJ组,每组10只;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清白细胞介素(IL-4和IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)水平,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测腹腔巨噬细胞IL-10和TNF-α的mRNA表达,了解慢性SJ感染小鼠免疫状态.实验2:以脂多糖(LPS)腹腔注射诱导小鼠脓毒症模型,分为LPS组和SJ-LPS组,每组15只;用ELISA法动态观察注射LPS后0、24、48和72 h细胞因子的变化,0 h的水平相当于正常小鼠和SJ感染8周水平,观察慢性SJ感染对脓毒症过程的影响.实验3:分别以盲肠结扎穿孔术(CLP)和LPS诱导两种不同的脓毒症模型,评价慢性SJ感染对脓毒症小鼠72 h存活率的影响.结果 实验1:SJ组血清抗炎因子IL-4[(151.35±12.24)ng/L]和IL-10[(133.22±11.09)ng/L]水平较正常组[IL-4(56.32±8.66)ng/L,IL-10(48.17±7.23)ng/L]显著升高(均P＜0.05),并可使巨噬细胞向替代活化性巨噬细胞分化,慢性SJ感染使腹腔巨噬细胞高表达IL-10 mRNA(SJ组4.46±1.82,正常组1.52±0.60),抑制TNF-α mRNA表达(SJ组1.61±0.93,正常组2.32±1.03,均P＜0.05).实验2、3:慢性SJ感染小鼠血清IL-4、IL-10于注射LPS后0 h即显著升高,随后下降,至72 h仍明显高于LPS组[IL-4(ng/L):92.2±7.6比41.5±4.5;IL-10(ng/L):92.1±7.8比35.6±4.0,均P＜0.05];TNF-α、IFN-γ均于24 h达峰值后逐渐下降,至72 h SJ-LPS组仍显著低于LPS组[TNF-α(ng/L):82.9±5.6比91.5±5.2;IFN-γ(ng/L):44.1±4.8比52.6±4.0,均P＜0.05].慢性SJ感染可明显改善CLP或LPS所致脓毒症小鼠的存活率(CLP:80%比20%,LPS:70%比30%,均P＜0.05).结论 慢性SJ感染可使脓毒症小鼠血清抗炎因子升高,存活率上升,从而起到保护作用.

Abstract：

Objective To preliminarily study the protective effect of chronic schistosoma japonica (SJ)infestation against sepsis in mice and its mechanism. Methods BALB/c male mice were used, and the experiment was divided into three parts. Experiment 1: chronic SJ infestation model was reproduced by SJ cercaria inoculation through abdominal skin for 8 weeks. Twenty mice were randomly grouped into normal group (n=10) and SJ group (n=10). The levels of interleukins (IL-4, IL-10), tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interferon-γ (IFN-γ) in serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Real-time polymerase chain reaction (PCR) was employed to detect the levels of IL-10 mRNA and TNF-αmRNA in abdominal macrophages. This experiment was meant to evaluate immune state in mice with chronic SJ infestation. Experiment 2: lipopolysaccharide (LPS) was intraperitoneally injected to reproduce sepsis model. Thirty mice were randomly grouped into LPS group (n=15) and SJ-LPS group (n=15). The levels of cytokines were determined by ELISA at 0, 24, 48 and 72 hours after LPS injection. This experiment was meant to detect the effect of chronic SJ infestation in mice during the septic process. Experiment 3 : two types of sepsis model were reproduced by cecal ligation and puncture (CLP) and LPS injection, respectively. The survival rate of mice with chronic SJ infestation in 72 hours in either type of sepsis was evaluated. Results Experiment 1, compared with normal group [IL-4 (56.32±8.66) ng/L, IL-10 (48.17±7.23) ng/L],chronic SJ infestation showed an increase in serum IL-4 [(151. 35 ± 12. 24) ng/L] and IL-10 [(133. 22 ±11. 09) ng/L, both P＜0. 05]. Chronic SJ infestation also resulted in an increase in IL-10 mRNA expression (SJ group 4. 46±1. 82, normal group 1. 52±0. 60) and inhibited TNF-α mRNA expression (SJ group 1. 61±0.93, normal group 2. 32±1.03) in abdominal macrophages (both P＜0. 05), indicating that macrophages could be differentiated into alternative activated macrophages. Experiments 2 and 3 showed that the levels of serum IL-4 and IL-10 were increased at 0 hour after LPS injection, and then gradually decreased in SJ-LPS group, but the levels were still higher than those in LPS group at 72 hours [IL-4 (ng/L): 92. 2±7. 6 vs.41.5±4. 5; IL-10 (ng/L): 92. 1±7. 8 vs. 35. 6±4. 0, both P＜0. 05]; the levels of TNF-α and IFN-γ were increased at 24 hours, and then decreased in SJ-LPS group, and the levels were lower than those in LPSgroup at 72 hours [TNF-α (ng/L): 82. 9±5. 6 vs. 91. 5±5. 2; IFN-γ (ng/L): 44.1±4. 8 vs. 52. 6±4. 0,both P＜0. 05]. Therefore, chronic SJ infestation could improve the survival rate of mice with sepsis induced by CLP or LPS (CLP: 80% vs. 20%, LPS: 70% vs. 30%, both P＜0.05). Conclusion Chronic SJ infestation could elevate anti-inflammatory factors in septic mice, thus ameliorating the survival rate, so it has protective effect on mice with sepsis.     

免气腹单孔腹腔镜辅助盲肠结扎穿孔术建立脓毒症大鼠模型

目的基于免气腹单孔腹腔镜辅助盲肠结扎穿孔(CLP)术建立脓毒症大鼠模型。方法将64只大鼠分为A组(传统CLP术对照组)、B组(免气腹单孔腹腔镜辅助下CLP术对照组)、C组(传统CLP术穿孔组)及D组(免气腹单孔腹腔镜辅助下CLP术穿孔组),每组各16只。记录建模后24 h各组大鼠的死亡情况,并检测各组大鼠血清白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-10及肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。同时,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察各组大鼠肺组织、小肠组织、肾组织的病理变化。结果建模后24 h,A组、B组大鼠均存活,C组大鼠死亡7只,D组大鼠死亡8只。各组大鼠间血清IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平比较,差异均有统计学意义(F=21.461、27.372、51.113、33.799,P均<0.001)。进一步两两比较发现,C组、D组大鼠的血清IL-1β[(7.4±2.7)、(7.4±2.2)、(2.4±0.6)、(2.4±0.6)ng/L],IL-6[(2.05±0.46)、(2.14±0.58)、(0.82±0.20)、(0.86±0.16)ng/L],IL-10[(59±10)、(61±13)、(19±6)、(22±6)ng/L],TNF-α[(64±13)、(74±21)、(24±4)、(23±5)ng/L]水平较A组、B组大鼠均显著升高(P均<0.05),而A组、B组大鼠间及C组、D组大鼠间血清IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。HE染色发现,A组、B组大鼠肺组织、小肠组织、肾组织结构完整,未见炎症细胞浸润;C组、D组可见肺泡结构完整性破环、肺泡壁增厚、炎症细胞浸润,部分肠绒毛上皮细胞坏死脱落,部分肾小管上皮细胞水肿。结论利用免气腹单孔腹腔镜能简单、有效地建立大鼠CLP术脓毒症模型。