【In Press】Senescence Marker Protein 30 Promotes the Proliferation of Human Lens Epithelial Cells SRA01/04 and Inhibits its Apoptosis

AIM: To study the effect of senescence marker protein 30 (SMP30) on the proliferation and apoptosis of human lens epithelial cell (HLEC) SRA01/04. METHODS: SMP30 overexpression and knock down type cell lines were cultivated by using two groups RGN (SMP30) lentiviral vectors (LV-RGN, LV-RGN-RNAi) and the respective negative control virus infect SRA01/04 cells. Western blot and q-PCR analysis were used to determine RGN overexpression and knock down efficiency. We use Cell Counting Kit-8 (CCK8) assay to measure cell viability and 5-bromodeoxyuridine (BrdU) assay to test cell proliferation. Cell cycle was measured by PI FACS assay and Cell apoptosis was tested by Annexin-V APC assay through flow cytometry. We use western blot to measure the content of caspase-3 in SRA01/04. RESULTS: We used PCR and WB techniques to determine the successful transfection of SMP30 overexpression (OE) and knock down (KD) SRA01/04 cell lines. By CCK8, Brdu and PI FACS cell cycle assay, it was found that the SMP30 OE group promoted cell proliferation (P<0.05) compared with the control group, and the KD group inhibited cell proliferation (P<0.05).The results of Annexin V APC signal staining detection indicated that compared with respective control group, the cell apoptosis rate was higher in KD group (P<0.05) but lower in OE group (P<0.01). The expression of caspase-3 was down-regulated in OE group through Western Blot assay and up-regulated in KD group compared with respective control group. CONCLUSION: Proliferation of SRA01/04 was promoted by over-expressing SMP30 and apoptosis was suppressed. Increasing the expression of SMP30 may protect HLEC SRA01/04 against apoptosis in cataract.     

低表达衰老标记蛋白30对高钙状态下人晶状体上皮细胞增殖和氧化的影响

目的:探讨高钙状态下衰老标记蛋白30(SMP30)低表达对人晶状体上皮细胞(LECs)系SRA01/04增殖、氧化应激的影响。方法:设计3条干扰SMP30靶向基因RGN表达的RNAi序列(KD1~3),以空载序列为阴性对照组(NCKD),构建慢病毒载体并感染SRA01/04细胞,同时以未感染的SRA01/04细胞作空白对照组(CON)。RT-PCR筛选干扰效率最高的慢病毒载体用于后续实验。采用含15mmol/L CaCl2的完全培养基处理细胞24h模拟发生白内障时人LECs的病理状态,通过BrdU-Elisa法检测细胞增殖活力,并检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性及氧化型谷胱甘肽/总谷胱甘肽(GSSG/T-GSH)水平以评估细胞氧化应激水平。结果:成功构建KD1~3及NCKD慢病毒载体,感染SRA01/04细胞效率约80%。三种慢病毒载体(KD1~3)敲减效率分别为93%、60%、74%,故选择KD1慢病毒载体进行后续实验。高钙状态下,KD1组细胞相对增殖活力和SOD活力[(2.42±0.08)和(11.69±0.52U/mg)]均低于NCKD组[(2.95±0.08)和(31.10±2.24U/mg)]和CON组[(2.96±0.25)和(26.33±1.04U/mg)],GSSG/T-GSH比值(70.80±2.34)高于NCKD组(15.93±3.47)和CON组(20.05±2.45)(均P<0.05),而NCKD组与CON组上述指标均无差异(P>0.05)。结论:高钙状态培养下,RGN-RNAi慢病毒载体介导的SMP30低表达SRA01/04细胞增殖活力及抗氧化应激能力减弱,提示SMP30可能具有调控细胞增殖、抗氧化应激的保护作用。     

急性氧化应激初期人晶状体上皮细胞株SRA01/04中衰老标记蛋白30抗氧化作用的研究

目的　初步探讨衰老标记蛋白30（senescence marker protein 30，SMP30）的增加对处于急性氧化应激初期的人晶状体上皮细胞株SRA01/04的保护作用。方法　将处于对数生长期的SRA01/04接种于96孔板，分别使用含150 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、250 μmol·L^-1、300 μmol·L^-1、350 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、450 μmol·L^-1 H₂O₂的培养基作用2 h，CCK-8法选取最佳H₂O₂浓度；使用慢病毒对SRA01/04进行转染建立SMP30高表达模型，实验分3组:SMP30过表达（over expression，OE）组、SMP30过表达相应空载（negative control over expression，NCOE）组及对照（control，CON）组。通过超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）定量检测试剂盒、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）/总谷胱甘肽（total glutathione,T-GSH）测定试剂盒测量细胞内SOD活力及GSSG/T-GSH比值的变化。结果　经分析，建立模型的最佳H₂O₂浓度为300 μmol·L^-1。在此浓度下，与CON组（5.783±0.192）U·mg^-1及NCOE组（5.837±0.182）U·mg^-1相比，OE组细胞内SOD活力升高，为（10.251±0.110）U·mg^-1；与CON组（29.943±0.241）及NCOE组（30.037±0.433）相比，OE组细胞内GSSG/T-GSH比值（20.990±0.342）降低；差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　当SRA01/04处于H₂O₂诱导的急性氧化应激初期时，SMP30表达的增加可通过增加SOD活力和降低GSSG/T-GSH比值，加强SRA01/04的抗氧化能力。     

姜黄素对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的探讨姜黄素(curcumin,CUR)对人晶状体上皮细胞株SRA01/04(human lens epithelial cell line SRA01/04,HLECSRA01/04)增生的抑制作用及其剂量-效应与时间-效应的关系。方法MTT比色法分别测定不同浓度的CUR作用于HLEC不同时间后的细胞生长抑制率;不同浓度的CUR作用于HLEC24h后,流式细胞术检测HLEC的细胞凋亡率;DAPI免疫荧光染色观察HLEC的形态学改变;免疫组织化学检测HLEC的caspase-3蛋白表达情况。结果MTT比色法实验结果显示,随药物浓度增加和作用时间延长,HLEC生长抑制率增加(P<0.05)。CUR作用于HLEC24h后,流式细胞术检测表明,细胞凋亡率随药物浓度增加而明显增加(P<0.05);DAPI免疫荧光染色可见细胞核固缩、溶解碎裂、产生凋亡小体,而对照组细胞形态规则,细胞核呈现均匀的荧光染色;免疫组织化学可见,用药组caspase-3蛋白的表达随CUR浓度增加而增强(P<0.05)。结论CUR对HLEC有抑制增生和诱导凋亡作用,且呈明显的剂量-效应与时间-效应关系,可望成为后发性白内障的防治药物。     

DNA氧化损伤修复基因ERCC6对过氧化氢诱导的氧化损伤的晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨DNA氧化损伤修复基因ERCC6对过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化损伤的晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法　采用不同浓度H₂O₂处理SRA01/04细胞,构建氧化损伤模型。取氧化损伤的SRA01/04细胞分为H₂O₂组、H₂O₂+空白质粒转染组和H₂O₂+pcDNA3.1-ERCC6质粒转染组进行转染处理。采用实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测转染后氧化损伤的SRA01/04细胞中ERCC6 mRNA和科凯恩综合征互补B蛋白（CSB）的表达变化。采用免疫印迹实验和EdU染色实验分别检测转染后各组SRA01/04细胞凋亡相关蛋白表达变化和细胞增殖能力。结果　当H₂O₂处理浓度为200 μmol·L^-1时, SRA01/04细胞ERCC6 mRNA和CSB蛋白的相对表达量最低,后续转染实验H₂O₂处理浓度均采用200 μmol·L^-1。与H₂O₂组和H₂O₂+空白质粒转染组相比,H₂O₂+pcDNA3.1-ERCC6质粒转染组SRA01/04细胞ERCC6 mRNA和蛋白表达水平均显著增高（均为P<0.05）。进一步实验发现,与另外两组相比,H₂O₂+pcDNA3.1-ERCC6质粒转染组SRA01/04细胞中的促凋亡蛋白Bax表达均明显降低,而抑制凋亡的蛋白Bcl-2表达则均明显增加（均为P<0.05）。EdU染色实验检测结果显示,与H₂O₂+空白质粒转染组相比,H₂O₂+pcDNA3.1-ERCC6质粒转染组SRA01/04细胞内绿色荧光亮度增高,阳性细胞数量增加,表明SRA01/04细胞的增殖能力增强。结论　ERCC6基因可能通过减弱DNA的核苷酸切除修复作用抑制氧化损伤的晶状体上皮细胞增殖、促进其凋亡从而导致老年性白内障的发生。     

丹酚酸A（Sal A）对H2O2诱导的氧化应激损伤人晶状体上皮细胞增殖、凋亡、超微结构及炎症反应的作用

目的　探讨丹酚酸A（salvianolic acid A,Sal A）对H₂O₂诱导的氧化应激损伤人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLEC）增殖、凋亡、超微结构及炎症反应的作用。方法　将HLEC SRA01/04细胞传代培养后,用不同浓度（50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、800 μmol·L^-1）H₂O₂处理培养24 h,通过MTT法检测细胞存活率,筛选H₂O₂最佳作用浓度,作为细胞模型组使用浓度。对照组细胞用正常完全培养液培养。Sal A干预组将细胞先在含50 μmol·L^-1 Sal A培养液中预孵育24 h,后加入最佳作用浓度H₂O₂继续培养24 h。而后采用MTT法检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,电镜观察细胞超微结构,Western blot检测各组细胞炎症相关蛋白IL-1β、IL-18、TNF-α的表达情况。结果　MTT法检测结果显示不同浓度H₂O₂（50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、800 μmol·L^-1）处理组细胞存活率分别为61.26%±3.35%、47.81%±2.63%、29.53%±2.54%、21.47%±2.26%、14.97%±1.82%,各浓度处理组细胞存活率和对照组相比,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。其中,100 μmol·L^-1 H₂O₂处理组细胞存活率最接近半数致死量,故选择100 μmol·L^-1 H₂O₂作为氧化应激损伤模型浓度用于后续实验。Sal A干预组细胞存活率为82.54%±3.07%,比100 μmol·L^-1 H₂O₂模型组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术检测结果显示,对照组细胞凋亡率为4.06%±0.41%,H₂O₂模型组细胞凋亡率为20.52%±3.29%,Sal A干预组细胞凋亡率为12.35%±1.48%,H₂O₂模型组和Sal A干预组细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05）。电镜观察结果显示H₂O₂诱导产生了明显的细胞超微结构损伤,线粒体、内质网数目减少,分泌颗粒减少,胞核体积缩小,可见少数细胞核内异染色质增多甚至聚集成块状。Sal A预处理后,细胞损伤的超微结构出现一定程度改善,如细胞形态较规则,细胞器线粒体、内质网数目增多,空泡数量减少,染色质分布基本均匀。Western blot检测结果显示,H₂O₂引起的氧化损伤会显著提高IL-1β、IL-18、TNF-α表达,Sal A可以在一定程度上降低IL-1β、IL-18、TNF-α的表达。结论　Sal A可以有效增加H₂O₂诱导的氧化应激损伤HLEC的增殖,抑制细胞凋亡,减小细胞超微结构损伤性改变,降低IL-1β、IL-18、TNF-α表达。     

Bax抑制因子1对紫外线B诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用

目的　探讨Bax抑制因子1（BI-1）对紫外线B（UVB）诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用。方法　取对数生长期的人晶状体上皮细胞（HLEC）系SRA01/04细胞,将BI-1过表达质粒及其空载质粒转染至SRA01/04细胞中,分别记为BI-1组、Vector组,另取不做任何处理的SRA01/04细胞作为blank组。转染48 h后,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后各组细胞中BI-1 mRNA和蛋白表达水平。而后再根据实验需要将细胞分为6组:（1）Control组,SRA01/04细胞不经任何处理;（2）UVB组,采用紫外线（2.0 W·cm^-2）处理SRA01/04细胞60 min;（3）Vector组,转染BI-1空载质粒的SRA01/04细胞;（4）BI-1组,转染BI-1过表达质粒的SRA01/04细胞;（5）Vector+UVB组,转染BI-1空载质粒的SRA01/04细胞,再经紫外线（2.0 W·cm^-2）照射60 min;（6）BI-1+UVB组,转染BI-1过表达质粒的SRA01/04细胞,再经紫外线（2.0 W·cm^-2）照射60 min。采用实时荧光定量PCR检测UVB照射后各组细胞中BI-1 mRNA表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞中活性氧（ROS）含量,荧光探针法检测细胞内质网内Ca²⁺浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测各组细胞中相关蛋白表达水平。结果　本研究中所培养的SRA01/04细胞在荧光显微镜下可观察到细胞内αA-晶状体蛋白呈红色荧光。随着UVB照射强度增加,SRA01/04细胞内BI-1 mRNA表达水平逐渐降低,本研究选择UVB照射强度为2.0 W·cm^-2进行后续的实验。与blank组或Vector组相比,BI-1组细胞中BI-1 mRNA和蛋白表达水平均显著上升,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与Control组比较,UVB组细胞增殖活性显著降低,细胞内ROS含量显著增加,细胞内质网内Ca²⁺浓度显著升高,细胞凋亡率显著升高,细胞内Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平显著上调,Bcl-2蛋白表达水平显著下调,细胞内GRP78、p-IRE1、p-JNK和Cleaved-caspase-12蛋白表达水平显著上调（均为P＜0.05）。BI-1+UVB组细胞增殖活性较UVB组显著增高,细胞内ROS含量较UVB组显著降低,细胞内质网内Ca²⁺浓度较UVB组显著下降;与UVB组比较,BI-1+UVB组细胞凋亡率显著下降,细胞内Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平显著下调,Bcl-2蛋白表达水平显著上调;BI-1+UVB组细胞内GRP78、p-IRE1、p-JNK和Cleaved-caspase-12蛋白表达水平较UVB组显著下调（均为P＜0.05）。结论　BI-1在UVB诱导的HLEC系SRA01/04细胞中表达显著下调,BI-1过表达可通过降低内质网内Ca²⁺浓度抑制内质网应激介导的IRE1-JNK信号通路的激活,进而抑制UVB诱导的SRA01/04细胞凋亡。     

短发夹状RNA干扰bcl-2后诱导人晶状体上皮细胞凋亡的实验研究

目的 应用RNA干扰技术抑制人品状体上皮细胞(HLEC)bcl-2基因表达,观察诱导其细胞凋亡情况,为防治晶状体后囊膜混浊提供新的策略.方法 实验研究.设计2条以bcl-2基因为靶标的短发夹RNA(shRNA),克隆入质粒PGCsi表达载体,分别命名为P1、P2,经脂质体转染入永生性HLEC系SRA01/04,48 h后检测转染效率和bd-2的基因及蛋白表达情况,并检测HLEC的细胞凋亡情况.多组间及组间计数资料的比较,采用随机区组设计的方差分析.结果 重组质粒经自动基因测序仪测序,证实构建成功.转染后48 h,流式细胞仪测得P1、P2转染率为44.1%、47.2%.免疫印迹法测得P1、P2组的bcl-2蛋白表达较对照组降低,实时荧光定量聚合酶链反应法测得P1、P2组的bcl-2 mRNA相对表达量为0.435、0.476,较对照组降低(F=1672.4,P<0.05),流式细胞仪双染法测得P1、P2组HLEC的细胞凋亡率分别为42.3%、45.4%,较对照组增加(F=1756.2,P<0.05),并且活化型caspase-3蛋白的表达增加.结论 P1、P2可抑制HLEC的bcl-2基因表达,并诱导HLEC凋亡.(中华眼科杂志,2009,45:636-640)     

高糖对人晶状体上皮细胞沉默信号调节蛋白6（SIRT6）表达的影响

目的　观察高浓度葡萄糖对人晶状体上皮细胞(SRA01/04)活性及沉默信号调节蛋白6（SIRT6）表达的影响。方法　将SRA01/04细胞在不同葡萄糖浓度（5.5 mmol·L^-1、15.5 mmol·L^-1、25.5 mmol·L^-1、35.5 mmol·L^-1、45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1）培养基中培养48 h后,用光镜观察SRA01/04细胞形态;CCK-8试剂盒检测各组细胞的活性;Western blot检测各组细胞SIRT6蛋白的表达水平。然后将SRA01/04细胞用55.5 mmol·L^-1葡萄糖干预,培养不同时间（0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h）后,Western blot检测不同时间SRA01/04细胞SIRT6蛋白表达水平。免疫荧光技术检测对照组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖）和高糖组（55.5 mmol·L^-1葡萄糖）细胞的SIRT6蛋白表达情况。结果　随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的数量逐渐降低。CCK-8检测结果显示,与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组相比,随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的活性逐渐降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示,SRA01/04细胞的SIRT6蛋白表达与葡萄糖呈浓度和时间依赖性,45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1葡萄糖组与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组比较,以及24 h组、48 h组和72 h组与0 h组比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。细胞免疫荧光结果显示,SRA01/04细胞中的SIRT6蛋白主要在细胞核表达,高糖组SRA01/04细胞中SIRT6蛋白表达较对照组显著降低（P<0.05),且高糖组细胞核出现明显的核固缩和核碎裂现象。结论　高浓度葡萄糖可以降低SRA01/04细胞的增殖活性,降低SIRT6蛋白的表达水平。     

Wnt3a促进人晶状体上皮细胞增生及相关机制的研究

背景 晶状体上皮细胞(LECs)的异常增生是晶状体后囊膜混浊(PCO)的重要病理基础,以往研究证实Wnt3a信号可促进上皮细胞的增生,但其对LECs的作用机制尚不清楚. 目的 研究Wnt3a对人LECs增生的作用,探讨相关分子机制,为PCO的临床治疗提供新的靶点.方法 将人LECs系SRA01/04细胞进行培养后以4×105个/孔的密度接种于6孔板继续孵育.构建Wnt3a cDNA表达载体,采用脂质体介导转染技术将Wnt3a cDNA表达载体瞬时转染人SRA01/04细胞中,对照组转染pcDNA3-HA表达载体.采用Western blot技术验证载体在转染细胞中的表达;MTT法和流式细胞仪检测Wnt3a在SRA01/04细胞中的过表达对细胞增生能力的影响;Western blot法检测Wnt3a过表达对Wnt/β-catenin下游信号分子β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表达的影响;应用免疫荧光法检测Wnt3a过表达后β-catenin表达的定位变化;采用免疫细胞化学法检测Wnt3a过表达后增生细胞核抗原(PCNA)蛋白表达的变化.结果 本研究成功构建了人Wnt3a基因的表达载体Wnt3a cDNA,获得Wnt3a过表达的Wnt3a/SRA01/04细胞及对照pcDNA3-HA/SRA01/04细胞.Western blot检测证实,与pcDNA3-HA/SRA01/04相比,Wnt3a/SRA01/04细胞内Wnt3a蛋白表达明显升高.MTT法检测表明,Wnt3a cDNA转染组SRA01/04细胞的增生率明显高于对照组(F分组=15.235,P=0.005;F时间=369.677,P=0.000),转染后各时间点2个组间SRA01/04细胞的增生率差异均有统计学意义(t=20.843,P=0.001;t=26.214,P＜0.01;t=25.177,P=0.001;t=35.516,P＜0.01;t=615.056,P＜0.01).细胞周期分析发现,Wnt3a cDNA转染组G1期细胞比例为51.74％,明显少于对照组的79.44％,而S期细胞的比例为36.23％,明显多于对照组的12.34％.Wnt3a cDNA转染组SRA01/04细胞PCNA蛋白表达阳性率为47.00％±7.58％,明显高于对照组的16.00％±3.61％,差异有统计学意义(t=8.256,P＜0.01).转染后48 h,β-catenin蛋白密集分布于Wnt3a/SRA01/04细胞核和细胞质中,而在对照组仅出现于细胞质之中.Wnt3a/SRA01/04细胞中Wnt3a蛋白表达水平上调,β-catenin细胞定位由细胞质转入细胞核;Wnt/β-catenin信号通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc蛋白表达上调. 结论 在SRA01/04细胞中,Wnt3a过表达使Wntβ-catenin信号通路活化,下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表达上调,可促进人LECs的增生.     

BHMT对同型半胱氨酸诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的：观察甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)在同型半胱氨酸(Hcy)环境下对人晶状体上皮细胞(HLEC)的保护作用。

方法：构建BHMT基因过表达慢病毒载体,将体外培养的HLEC随机分为3组：正常组：正常培养的HLEC; 对照组：感染了空载体的HLEC-B3,BHMT过表达组(OE)：感染了过表达BHMT基因载体的HLEC-B3,均培养于10% FBS(胎牛血清)培养基+5mmol/L Hcy培养液中。应用EdU(5-乙炔基-2''脱氧尿嘧啶核苷)试剂盒检测细胞的增殖能力,流式细胞仪检测活性氧(ROS)含量,可见分光光度计测算谷胱甘肽(GSH)活性,Western blotting检测内质网应激相关蛋白(GPR78,Nrf2)及凋亡相关酶Caspase-12的表达。

结果：BHMT过表达组较对照组细胞增殖能力增长约30.0%(P<0.05)。ROS检测显示,正常组、对照组、过表达组荧光强度分别为(89.2043±0.3511)%、(91.4502±0.0606)%、(49.5625±0.4502)%,过表达组与正常组有差异(P<0.05); GSH活性检测显示：相比于正常组与对照组,BHMT高表达组GSH活性明显上升(P<0.05); Western blotting结果显示：GRP78的相对表达量在正常组及对照组中明显高于过表达组,Nrf2的相对表达量在正常组与对照组中明显低于过表达组。凋亡相关酶Caspase-12的相对表达量在过表达组中明显低于对照组。

结论：BHMT可以抑制Hcy对HLEC的氧化损伤作用,降低ROS水平,升高GSH活性,减轻内质网应激反应,抑制细胞凋亡。BHMT对Hcy诱导的HLEC氧化损伤有重要的保护作用。     

MG132对体外培养人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的 研究蛋白酶体抑制荆MG132对晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞增殖的影响,探讨其抑制细胞增殖的有效药物浓度及分子机制.方法 不同浓度的MG132分别处理SRA01/04细胞36h,通过MTT法检测MG132对SRA01/04细胞增殖的影响,通过流式细胞术检测MG132对SRA01/04细胞凋亡的影响,通过Annexin V-FITC/PI双染法在荧光显微镜下观察SRA01/04细胞早期凋亡形态.结果 随着MG132浓度的升高,对SRA01/04细胞增殖的抑制作用逐渐增强,半数有效抑制浓度IC50为2.48μmol·L-1.MG132可诱导SRA01/04细胞凋亡;流式细胞术结果表明:浓度为2.5μmol·L-1、5.0μmol.L-1的MG132作用SRA01/04细胞36h后,细胞早期凋亡率分别为6.55%±0.35%和13.75%±3.18%,而0μmol·L-1为0.75%±0.21%,差异均有统计学意义(均为P<0.05).凋亡细胞被Annexin V-FITC单独染色(绿色荧光),活细胞不被染色,坏死细胞被Annexin V-FITC和PI(红色荧光)同时染色.结论 蛋白酶体抑制剂MG132可通过诱导细胞凋亡来抑制SRA01/04细胞的增殖,起到防治后发性白内障的作用.     

人参皂苷Rg3对人晶状体上皮细胞生长的抑制作用

目的:观察人参皂苷Rg3对体外人晶状体上皮细胞SRA01/04生长的抑制作用。方法:不同质量浓度的Rg3处理体外培养SRA01/04细胞后,应用MTT比色法分析其细胞生长抑制作用;AO/EB染色法观察细胞的形态学改变;流式细胞仪测定48h细胞凋亡率。结果:Rg3在一定范围内抑制SRA01/04细胞生长,其抑制率随时间和质量浓度增加而增加。AO/EB染色可见实验组SRA01/04细胞核着黄色荧光或橘红色荧光,细胞核呈固缩状或圆珠状。流式细胞仪检测凋亡率随药物质量浓度增加而增加。结论:Rg3能有效抑制SRA01/04细胞增殖、并诱导其凋亡。     

POLH对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡的影响

目的　探究DNA聚合酶η（POLH）对过氧化氢（H₂O₂）诱导的晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡的防御机制。方法　以年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜组织和H₂O₂处理的晶状体上皮细胞系SRA01/04为研究对象,分别通过RT-PCR和免疫印迹实验验证POLH的表达并筛选H₂O₂最佳作用浓度用于后续实验,将培养的SRA01/04细胞分为H₂O₂组、H₂O₂+HA组和H₂O₂+OV-POLH组,采用RT-PCR和免疫印迹实验检测POLH mRNA和蛋白表达情况,免疫荧光法检测DNA氧化损伤标志物以及TUNEL实验检测细胞凋亡变化,免疫印迹实验检测细胞中BAX、BCL-2、Nrf2和Keap1蛋白表达。结果　RT-PCR结果显示,与透明晶状体前囊膜（1.00±0.22）相比,年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜组织中POLH mRNA相对表达量明显下降（0.38±0.62）（P<0.000 1）。RT-PCR和免疫印迹实验均显示,200 μmol·L^-1 H₂O₂处理的SRA01/04细胞中POLH表达量最低;TUNEL实验检测结果显示, 200 μmol·L^-1 H₂O₂处理后细胞的凋亡明显增加。RT-PCR和免疫印迹实验结果显示,与H₂O₂组和H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组SRA01/04细胞中POLH表达量显著升高（P<0.000 1）。免疫荧光染色结果显示,与H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组细胞的γH2A染色明显下降。免疫印迹实验检测结果显示,与H₂O₂组和H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组细胞促凋亡蛋白BAX表达量明显下降,而抑凋亡蛋白BCL-2表达量明显升高（均为P<0.01）;与H₂O₂组和H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组细胞Keap1蛋白水平明显下降,而转录调控蛋白Nrf2表达明显升高（均为P<0.01）。结论　过表达POLH可通过增强DNA损伤修复功能抑制H₂O₂诱导的晶状体上皮细胞凋亡,其抑制氧化应激机制可能与Nrf2-Keap1-ARE通路有关。     

高钙状态对人晶状体上皮细胞株SRA01/04氧化应激水平的影响

目的 探讨高钙培养对人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)株SRA01/04氧化应激水平的影响.方法 选取处于对数生长期的HLEC均匀接种96孔板(每孔2×103个细胞),对照组:正常培养的HLEC,实验组:正常培养的HLEC+CaCl2(3 mmol·L-1、5 mmol· L-1、7 mmol· L-1、9 mmol· L-1、11 mmol·L-I、13 mmol·L-1、15 mmol· L-1、17 mmol·L-1、19 mmol·L-1)培养0h、12 h、24 h、36 h,采用CCK-8法检测各组细胞存活率.利用定量检测试剂盒测量细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、总谷胱甘肽(total-glutathione,T-GSH)含量及氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)/T-GSH比值的变化.结果 3 mmol·L-1、5 mmol·L-1、7 unol·L-1 CaCl2处理SRA01/04细胞24h,细胞存活率随CaCl2浓度增高先呈显著下降趋势,当浓度增高到9 mmol·L-1后细胞存活率又逐渐恢复,各实验组HLEC活力差异有统计学意义(P＜0.05).对照组细胞活力(0.592±0.055)与15 mmol·L-1CaCl2组(0.293±0.020)细胞活力相比差异有统计学意义(t=7.811,P＜0.05).CaCl2引起HLEC凋亡的最合适浓度和作用时间为15 mmol·L-1处理24h.与对照组相比,15 mmol·L-1CaCl2处理24h后,细胞核碎裂、溶解,细胞内SOD活力增高(t=-6.417,P＜0.05),T-GSH含量下降(t=13.816,P＜0.05),GSSG/T-GSH比值增高(t=-4.396,P＜0.05).结论 CaCl2诱导的高钙状态抑制HLEC的活力,引起细胞内SOD活力和GSSG含量增加,诱发并加剧细胞内氧化应激反应.     

老年性白内障患者circKMT2E表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的　探讨circKMT2E在老年性白内障（ARC）患者中的表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响。方法　取10例在我院接受白内障手术的ARC患者晶状体前囊膜,另选取4例健康捐献者透明晶状体前囊膜作为对照。使用Trizol试剂从人晶状体前囊膜组织中提取总RNA。依次使用cutadapt软件、DCC软件(v0.4.4)、STAR软件 (v2.51 b)、CircBase数据库和circ2Trait数据库对所测得的环状RNA（circRNA）进行注释,筛选circRNA差异表达。将体外培养的SRA01-04细胞随机分组,其中,空白对照组:用正常培养液培养,不作特殊处理;miR-control组:转染miR-control无序序列;miR-34a组:转染miR-34a-5p mimics序列;miR-34a+control组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-control空载体;miR-34a+HMGB1组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-HMGB1质粒。采用实时荧光定量PCR与双荧光素酶报告基因检测基因表达情况。 通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测蛋白表达。结果　经生物信息学分析显示,circKMT2E在ARC患者晶状体前囊膜组织中表达上调最为显著。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-34a-5p后circKMT2E-WT报告基因的荧光素酶活性由1.000±0.023降低至0.502±0.057（P<0.05）;而circKMT2E-MUT报告基因的荧光素酶活性由1.005±0.018降低至0.989±0.053（P>0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞凋亡率（23.59%±3.47%）较miR-control组（3.82%±0.41%）增高（P<0.05）,而miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞凋亡率（8.97%±1.20%）较miR-34a-control组（24.59%±4.33 %）降低（P<0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白、Bax蛋白相对表达量较miR-control组均升高,同时Bcl-2蛋白相对表达量则降低（均为P<0.05）;miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白和Bax蛋白相对表达量较miR-34a-control组均降低,同时Bcl-2蛋白相对表达量较miR-34a-control组增加（均为P<0.05）。结论　circKMT2E可通过海绵吸附miR-34a-5p减弱其对下游靶点HMGB1的抑制作用,进而有效地阻止SRA01-04细胞凋亡,在一定程度起到延缓ARC发展的作用。     

丹参酮IIA对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的影响

目的　探讨丹参酮IIA（Tan IIA）对过氧化氢（H₂O₂）诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的调控作用及可能的机制。方法　以人晶状体上皮细胞SRA01/04为研究对象,分为空白组、H₂O₂组（H₂O₂处理细胞建立氧化损伤模型）、Tan IIA组（Tan IIA溶液预处理24 h后,H₂O₂作用24 h）、Tan IIA+siNC组（转染阴性对照,其他处理方式同Tan IIA组）和Tan IIA+siNrf2组［转染核因子E2相关因子2（Nrf2） siRNA(siNrf2),其他处理方式同Tan IIA组］。CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术分别检测细胞凋亡率和活性氧簇（ROS）水平,酶联免疫吸附试验测定细胞中过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量,Western blot检测细胞总蛋白中Nrf2、血红素氧合酶-1（HO-1）表达及核蛋白中Nrf2表达情况。结果　通过CCK-8法确定H₂O₂和Tan IIA最佳实验浓度为300 μmol·L^-1和20 μmol·L^-1。与空白组相比,H₂O₂组SRA01/04细胞活力及细胞中CAT活性、SOD含量、GSH-Px含量均降低,凋亡率和ROS水平均增加,同时总蛋白中Nrf2和HO-1蛋白相对表达量及核蛋白中Nrf2蛋白相对表达量均下调（均为P<0.05）。与H₂O₂组相比,Tan IIA组SRA01/04细胞活力及细胞中CAT活性、SOD含量、GSH-Px含量均增加,凋亡率和ROS水平均降低,总蛋白中Nrf2和HO-1蛋白相对表达量及核蛋白中Nrf2蛋白相对表达量均上调（均为P<0.05）。而沉默Nrf2基因后,Tan IIA对SRA01/04细胞的保护作用被逆转。结论　Tan IIA能够抑制H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激性损伤和凋亡,其机制与Nrf2/HO-1通路的激活有关。     

bFGF诱导人晶状体上皮细胞增殖过程中细胞外信号调节激酶的作用

目的:检测细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导的人晶状体上皮细胞增殖过程中的表达与活化;检测ERK1/2特异性阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞增殖的影响。方法:人晶状体上皮细胞系SRA01/04体外培养,采用MTT比色法和[3H]-TdR掺入法检测ERK阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞活力和DNA合成的影响;Westernblot法测定bFGF对培养的人晶状体上皮细胞ERK,c-Jun氨基末端激酶(JNK),P38蛋白表达及PD98059对环氧合酶-2(COX-2)表达的影响。结果:10μg/LbFGF能显著刺激人晶状体上皮细胞增生,1μmol/LPD98059即能显著抑制bFGF启动的HLEC增殖,其效应呈浓度依赖性(P<0.01)。10μg/LbFGF可激活ERK信号通路,诱导COX-2蛋白表达,其效应在30min内达到高峰,6h后逐渐减弱,此作用可被10μmol/LPD98059阻断;10μg/LbFGF对非磷酸化ERK,磷酸化和非磷酸化JNK及P38表达无明显影响。结论:有丝分裂原活性蛋白激酶信号传导通路中ERK磷酸化对bFGF启动的人晶状体上皮细胞增殖具有重要的调节作用。     

miR-210靶向沉默Bcl-2诱导人晶状体上皮细胞凋亡

目的　观察ｍｉＲ-２１０在年龄相关性白内障晶状体组织中的表达,并探讨其对人晶状体上皮细胞凋亡的影响与调控机制。方法　收集年龄相关性白内障患者与新鲜人眼透明晶状体前囊膜（正常对照组）标本;培养人晶状体上皮细胞ＳＲＡ０１／０４,予或不予（正常对照组）紫外线照射,利用实时荧光定量ＰＣＲ检测上述组织或细胞中ｍｉＲ-２１０表达。此外,将遭受紫外线照射的ＳＲＡ０１／０４细胞分为空白对照组、阴性对照组、ｍｉＲ-２１０模拟物组和ｍｉＲ-２１０抑制物组,分别予培养液及ｍｉＲ-２１０阴性对照物、模拟物、抑制物处理４８ｈ,行实时荧光定量ＰＣＲ检测ｍｉＲ-２１０表达,以验证转染效率;Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｍｉＲ-２１０的靶基因Ｂｃｌ-２表达,流式细胞术分析细胞凋亡率。结果　与正常对照组相比,年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜组织和紫外线诱导的ＳＲＡ０１／０４细胞凋亡模型中ｍｉＲ-２１０表达均显著上调（均为Ｐ＜０．０１）。相对于空白对照组,ｍｉＲ-２１０模拟物组ｍｉＲ-２１０水平和细胞凋亡率均增加（均为Ｐ＜０．０１）,Ｂｃｌ-２蛋白表达水平降低（Ｐ＜０．０１）;而ｍｉＲ-２１０抑制物组ｍｉＲ-２１０水平和细胞凋亡率均减少（均为Ｐ＜０．０５）,Ｂｃｌ-２蛋白表达水平升高（Ｐ＜０．０１）;阴性对照组上述指标与空白对照组比较,差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论　ｍｉＲ-２１０在年龄相关性白内障患者晶状体组织中呈高表达,ｍｉＲ-２１０可能通过靶向沉默Ｂｃｌ-２促进人晶状体上皮细胞凋亡。     

阿魏酸对高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤的保护作用

目的　探讨阿魏酸对高糖诱导的人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLEC）损伤的保护作用。方法　以HLEC为研究对象,将细胞随机分为对照组（HLEC+DMEM）、DMSO组（HLEC+DMEM+DMSO）、高糖组（HLEC+DMEM+30 mmol·L^-1高糖）、高糖+阿魏酸组（HLEC+DMEM+DMSO+30 mmo·L^-1高糖+阿魏酸）。采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况;流式细胞术检测各组细胞凋亡;Q-PCR检测p53、Bcl-2、Bax mRNA表达水平;免疫细胞化学和Western blot法检测p53、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果　高糖抑制HLEC的细胞活性,不同浓度阿魏酸干预后,HLEC的细胞活性均明显升高,差异均具有统计学意义（均为P<0.05）。流式细胞术检测结果显示,高糖组HLEC凋亡率高于对照组（P<0.05）,高糖+阿魏酸组细胞凋亡率低于高糖组（P<0.05）;高糖组p53、Bax mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组,而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组（均为P<0.05）;高糖+阿魏酸组p53、Bax mRNA和蛋白表达水平均明显低于高糖组,而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平均明显高于高糖组（均为P<0.05）。结论　阿魏酸可能通过降低Bax和促进Bcl-2表达,进而减轻高糖诱导的HLEC损伤,从而达到防治糖尿病白内障发生的作用。