siRNA抑制感染细胞模型中HCV复制的研究

目的:探讨siRNA能否有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞中HCV的复制.方法:用HCV JC1质粒体外制备HCV RNA转录体,转染Huh-7.5.1细胞,收集细胞上清,再次孵育Huh-7.5.1细胞以建立HCV感染细胞模型,并用间接免疫荧光检测细胞内HCV核心蛋白的表达.将针对HCV NS5B基因的siRNA转染HCV感染细胞(浓度为4、40和200 nmol/L,时间为24 h、48 h和72 h),将4、40和200 nmol/L siRNA转染正常Huh-7.5.1细胞,并设空白对照、脂质体对照、无关siRNA对照以及IFNα-2b(1 000 IU/ml)组,用荧光定量PCR检测细胞内HCV RNA和PKRmRNA水平.结果:HCV感染的Huh-7.5.1细胞中检测出HCV核心蛋白表达.40 nmol和200nmol/L siRNA 24 h组及4、40、200 nmol/L siRNA 48 h和72 h组,HCV RNA水平分别降至58％、54％、29％、17％、17％、33％、22％、19％,明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).1 000 IU/mlIFN的各时间组HCV RNA水平均明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).各浓度siRNA组的PKR mRNA的表达与对照组无明显差异(P＞0.05).结论:针对HCV NS5B区的siRNA能够明显抑制HCV感染细胞中HCV的复制,而不引起双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)基因表达的激活.     

YTHDF1对HBV蛋白表达和HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用

目的:探讨YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTHDF1）对乙型肝炎病毒（HBV）蛋白表达和抗原分泌的影响。方法:分别以pCD3/Flag-KBE和pSilencer2.1-U6 neo为载体,构建过表达和敲降YTHDF1质粒。在Huh7细胞中过表达HBV蛋白质粒的同时表达pshR-YTHDF1和对照质粒,通过Western印迹检测YTHDF1对HBV蛋白表达的影响。在HepG2.2.15细胞中过表达和敲降YTHDF1, 在Huh7细胞中同时过表达pHBV1.3质粒,通过ELISA检测YTHDF1对HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响。结果:与正常肝细胞相比,YTHDF1在肝癌细胞Huh7（t=17.4）、HepG2.2.15细胞中（t=39.6）高表达。成功构建过表达和敲降YTHDF1质粒并验证其有效。敲降YTHDF1抑制HBV基因组编码的HBc蛋白（t=9.5）、HBs蛋白（t=5.2）、preS1蛋白（t=25.7）、preS2蛋白（t=9.0）、HBx蛋白（t=19.7）、HBV DNA Pol蛋白（t=23.0）表达,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。过表达YTHDF1促进HBsAg（Huh7细胞t48 h=5.5,t72 h=5.0;HepG2.2.15细胞 t48 h=5.3,t72 h=27.4）、HBeAg抗原（Huh7细胞t48 h=5.7,t72 h=6.3;HepG2.2.15细胞t48 h=29.0,t72 h=6.6）的分泌,而敲降YTHDF1抑制HBsAg（Huh7细胞t48 h=16.0,t72 h=7.9;HepG2.2.15细胞t48 h=22.3,t72 h=7.0）、HBeAg抗原（Huh7细胞t48 h=9.0,t72 h=14.3;HepG2.2.15细胞t48 h=8.1,t72 h=6.6）的分泌（均P＜0.05）。结论:YTHDF1可能具有增加HBV蛋白表达及促进HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用。     

乙型丙型肝炎病毒合并感染细胞模型的建立

目的：本文拟利用慢病毒载体,在可感染丙型肝炎病毒（HCV）的Huh7.5.1细胞中过表达人肝细胞乙型肝炎病毒（HBV）受体钠离子牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP）编码基因,建立Huh7.5.1- hNTCP细胞模型,使其可以被HBV、HCV共同感染。方法：使用携带人NTCP编码基因、GFP（green fluorescent protein）基因、嘌呤霉素抗性基因的GV358重组慢病毒载体,以50的感染复数（MOI）感染Huh7.5.1细胞。经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达人NTCP基因的Huh7.5.1-hNTCP细胞株,并通过Western-blotting验证NTCP蛋白的表达。使用HepAD38细胞来源的HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞,通过ELISA及qPCR等方法检测HBV感染后不同时间点HBsAg、HBeAg的表达以及HBV DNA的复制。HBV感染后24小时予以HCV-JFH1感染,检测合并感染状态下HBV DNA以及HCV RNA的复制。结果：Western-blotting 结果表明Huh7.5.1-hNTCP细胞株可稳定表达HBV受体NTCP。HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后ELASA、qPCR结果显示：HBsAg、HBeAg、HBV DNA合成逐渐增加,并在第9天达峰。HBV/HCV合并感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后,qPCR检测结果显示不同时间点HBV DNA、HCV RNA复制逐渐增加。结论:建立了Huh7.5.1-hNTCP细胞模型,该模型可被HBV/HCV合并感染。     

miR-122对IFN-α抗HCV效应的影响

目的:探讨miR-122对α-干扰素(IFN -α)抗丙型肝炎病毒(HCV)效应的影响.方法:给感染HCV的Huh7.5.1予miR-122模拟物(20 nmol/L、100 nmol/L、400 nmol/L)和(或)IFN-α(1 000 IU/ml)处理,采用荧光定量PCR检测HCV RNA水平;给Huh7.5.1细胞感染不同数量HCV(107拷贝,106拷贝,105拷贝)和(或)IFN-α处理,荧光定量PCR检测HCV RNA水平.结果:IFN-α以时间依赖方式抑制HCV复制,在48 h时使HCV RNA下降了83％.miR-122模拟物呈剂量依赖性促进HCV RNA复制(P＜0.05).IFN-α的抗病毒效应与miR-122模拟物水平(20 nmol/L、100nmol/L、400 nmol/L)成反比,与对照组比较有显著性差异(73.3％±3.5％,64.67％±5.5％,56.33％±5.1％ vs 84％ +4.5％,后两组P＜0.05).IFN-α的抗病毒效应与HCV载量呈反比(105拷贝组vs107拷贝组,P＜0.05).结论:在细胞感染模型中,miR-122促进HCV的复制,并且,miR-122的表达可部分中和IFN-α的抗HCV效应.     

干扰素α对丙型肝炎病毒复制子的抑制作用

目的 利用丙型肝炎病毒（HCV）复制子细胞模型,体外研究干扰素α（IFN-α）对HCV复制子的抑制作用,并探讨IFN-α信号传导与激活转录分子（STAT）及介导IFN-α抗病毒作用的干扰素刺激基因（ISGs）的表达水平。方法 以HCV复制子质粒为模板体外转录合成HCV复制子RNA,将此RNA转染Huh7肝癌细胞并经G418筛选,建立HCV复制子细胞株;用不同剂量（0—5000 IU／m1）IFN-α处理HCV复制子细胞72h或用1000 IU／ml IFN-α处理细胞不同时间（0、24、48、72、96h）,通过半定量RT—PCR及实时定量PCR同时检测HCVRNA,Western印迹检测HCVNSSA蛋白表达水平,研究IFN-α对HCV复制子的抑制作用。结果 IFN-α能明显抑制HCVRNA的复制,10IU／ml及25 IU／mlIFN-α可使HCVRNA较无IFN-α处理的对照细胞分别降低约68％及75％;IFN-α 1000IU／ml作用24h或96h导致HCVRNA较对照组分别降低75％及88％,同样,IFN-α对HCVNSSA蛋白的合成也有明显抑制作用,说明IFN-α的抗HCV作用呈剂量及时间依赖性;HCV复制子细胞中有抗病毒作用的ISG（PKR、2′5′OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ）呈明显的IFN诱导性表达。结论 IFN-α能明显抑制HCVRNA的复制,其抑制作用与IFN-α剂量及作用时间有关,PKR、2′5′OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ等ISG可能介导IFN-α的抗HCV作用。     

维拉帕米通过下调硫氧还蛋白互作蛋白的表达抑制丙型肝炎病毒感染

目的 探讨抗高血压药维拉帕米是否可通过下调宿主硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)的表达而抑制丙型肝炎病毒(HCV)的感染.方法 用不同浓度梯度的维拉帕米处理人肝癌细胞系Huh7.5.1,用qPCR和蛋白质印迹法检测TXNIP的表达.用维拉帕米处理Huh7.5.1细胞,同时加入细胞培养产生的HCV (HCVcc),48 h后检测HCVcc感染情况.用TXNIP siRNA转染Huh7.5.1细胞,检测下调TXNIP表达后,维拉帕米对HCVcc感染的影响;用TXNIP启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因表达质粒(pTXNIP-EGFP)转染Huh7.5.1细胞,分析维拉帕米对TXNIP启动子转录活性的影响.结果 与对照孔相比,维拉帕米(100、200、400 μmol/L)可下调Huh7.5.1细胞中TXNIP的表达,并呈现浓度依赖性(P＜0.05);并可抑制HCVcc对Huh7.5.1细胞的感染,且浓度越高抑制作用越明显(P＜0.05).进一步研究结果显示,与对照组相比,维拉帕米能够抑制pTXNIP-EGFP转染细胞中EGFP的表达水平(P＜0.05).结论 维拉帕米可下调TXNIP的表达从而抑制HCV感染,这可能是通过抑制TXNIP启动子的转录活性来实现的.     

维生素E脂质体纳米颗粒转运siRNA抑制丙型肝炎病毒核心蛋白表达的实验研究

目的 研究携带针对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)RNA的小干扰RNA(siRNA)的维生素E(Vitamin E)脂质体纳米颗粒在体外靶向抑制HCV复制的作用.方法采取“薄膜水化法”制备Vitamin E脂质体纳米颗粒,应用激光粒度分析仪测量纳米颗粒VE-DC/siRNA的颗粒大小及zeta电位,应用透射电子显微镜观察VE-DC形态及分散性.以Huh7.5.1细胞株作为载体.CCK-8法检测纳米颗粒的细胞毒性,琼脂糖凝胶电泳检测纳米颗粒携带siRNA的血清稳定性,蛋白印迹技术和免疫荧光技术检测该siRNA纳米颗粒的转染效率及对HCV的抑制作用.结果 Vitamin E脂质体纳米颗粒形态呈球形,粒度分布为(125.5-9.0)nm,zeta电位为(39.1±4.8)mV,分散均一.相较同浓度商品化脂质体,VE-DC/siRNA对细胞的毒性相对较小.血清稳定性实验显示,VE-DC/siRNA在24 h后siRNA无降解,较裸siRNA稳定性显著提高.携带siRNA的Vitamin E脂质体纳米颗粒可以较高效率进入Huh7.5.1细胞内,并抑制HCV核心蛋白的表达.结论 Vitamin E脂质体纳米颗粒可以转运siRNA至Huh7.5.1细胞,并抑制HCV核心蛋白的表达.     

丙型肝炎病毒对白细胞介素32表达影响的研究

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）在体内外对白细胞介素32（IL-32）表达的影响。方法 荧光定量PCR和免疫印迹法检测Huh7.5.1细胞中IL-32 mRNA和蛋白的表达水平,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-32的血清含量。结果 HCV感染的Huh7.5.1细胞IL-32 mRNA和蛋白的表达水平较对照细胞高,HCV患者IL-32血清含量明显高于健康对照（P〈0.05）。结论 HCV能够在体内外促进IL-32的合成和分泌。     

多配体聚糖结合蛋白1过表达增加低密度丙型肝炎病毒颗粒的产生

目的　探讨syntenin-1蛋白对丙型肝炎病毒（HCV）颗粒组装的影响。 方法　用免疫印迹法分析人原代肝细胞中syntenin-1的含量。用慢病毒转染质粒在人肝癌细胞系Huh7.5.1构建syntenin-1过表达细胞系和绿色荧光蛋白（GFP）过表达细胞系。采用电转法将HCV RNA转入细胞后,通过荧光素酶分析、免疫印迹分析和病毒滴度测定方法分别从RNA复制、病毒蛋白表达和感染性病毒颗粒的分泌方面检测syntenin-1过表达对HCV的影响。用密度梯度分析法检测HCV RNA和感染滴度在不同密度组份的分布情况。 结果　人原代肝细胞中syntenin-1含量与实验室常用的肝癌细胞系Huh7.5.1相比较高。Syntenin-1过表达不影响HCV RNA在宿主细胞中的复制;syntenin-1过表达细胞来源的HCV 病毒的感染性与Huh7.5.1细胞或GFP过表达细胞的对照组相比差异无统计意义;在syntenin-1过表达细胞培养上清液中的HCV感染性颗粒从主要集中在1.08～1.16 g/mL区域变为有部分转移到密度为1.01～1.02 g/mL的低密度区域。 结论　Syntenin-1过表达改变了HCV感染性颗粒的密度组份分布,从主要集中在1.08～1.16 g/mL区域变为有部分转移到密度为1.01～1.02 g/mL的低密度区域,在低密度区域出现了具有更高单位RNA感染能力的病毒颗粒。     

雷公藤对固有免疫分子干扰素诱导的研究

目的:为了探索具有免疫抑制和抗炎作用的雷公藤对干扰素的影响,以及雷公藤的风湿免疫性疾病治疗效果与干扰素的关系。方法:以1 ug/m L、5 ug/m L、10 ug/m L 3个浓度梯度的雷公藤作用于Huh7.5.1细胞48 h,采用荧光定量聚合酶链反应法定量检测甲氨蝶呤干预后Huh7.5.1细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、Mx A的mRNA表达量。结果:雷公藤能够诱导细胞产生内源性IFN-α、IFN-β、IFN-γ,使干扰素信号通路下游因子ISG15和Mx A高表达。结论:雷公藤治疗风湿免疫性疾病的良好疗效与干扰素相关,为进一步研究雷公藤的作用机制和开发利用提供理论依据。